急性分離的脊髓腹角神經(jīng)元膜片鉗記錄技術(shù)

(皖南醫(yī)學(xué)院 細胞電生理研究室，安徽 蕪湖 241002)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

急性分離的脊髓腹角神經(jīng)元膜片鉗記錄技術(shù)

高凌云， 張環(huán)環(huán)， 查盈盈， 鄭 超， 汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 細胞電生理研究室，安徽 蕪湖 241002)

目的：建立急性分離的脊髓腹角神經(jīng)元膜片鉗記錄技術(shù)以深入研究脊髓腹角神經(jīng)元上受體的作用。方法選用6～11 d的新生SD大鼠，麻醉后分離出含腰骶膨大的脊髓，制備切片，給予酶消化，切除背角，將腹角吹打分離出單細胞，進行膜片鉗記錄。結(jié)果①分離的腹角神經(jīng)元形態(tài)良好，胞體呈紡錘形、三角形和多邊形伴多條細長突起；②7個神經(jīng)元記錄到自發(fā)動作電位，其細胞電生理特性為：靜息電位(-61.88±16.70)mV；閾電位(-47.39±8.02)mV；鋒電位幅值(55.79±17.17)mV；超射(8.39±7.70)mV；放電頻率(13.54±9.97)Hz；③7個神經(jīng)元給予1 mmol/L谷氨酸誘發(fā)電流幅值(324.56±90.54)pA，翻轉(zhuǎn)電位(19.43±12.10 )mV；8個神經(jīng)元給予2 mmol/L尼古丁誘發(fā)電流幅值(296.91±77.44)pA，翻轉(zhuǎn)電位(29.06±14.88)mV。結(jié)論急性分離脊髓腹角神經(jīng)元膜片鉗記錄技術(shù)切實可行，可用于脊髓腹角神經(jīng)元相關(guān)調(diào)質(zhì)或藥物的作用機理研究。

脊髓；急性分離；腹角神經(jīng)元；膜片鉗記錄；新生大鼠

作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，脊髓是感覺、運動神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的重要通路，其內(nèi)部的上、下行纖維束構(gòu)成脊髓與高級中樞功能聯(lián)系的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而運動功能的實現(xiàn)，有賴于脊髓腹角運動神經(jīng)元引起肌肉活動。因此，深入系統(tǒng)地研究脊髓腹角神經(jīng)元的形態(tài)和功能，將有助于進一步闡明運動的發(fā)生機制。既往已有急性分離脊髓腹角神經(jīng)元的報道[1-2]，但由于缺乏功能研究，尚不能明確分離的腹角細胞的健康水平以及是否適合開展深入的科學(xué)研究，因而有必要進一步探索和改進脊髓腹角細胞的分離技術(shù)。通過反復(fù)摸索，我們建立脊髓腹角神經(jīng)元急性分離結(jié)合膜片鉗記錄技術(shù)，進一步優(yōu)化分離細胞的方法，提高實驗效率和可靠性，為開展更深入的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～11 d的新生SD大鼠，雌雄不拘，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供。動物許可證號碼 SCXK(蘇)：2017-0001。

1.2 溶液及藥品 配制人工腦脊液 ( Artificial Cerebral Spinal Fluid，ACSF) ，配方(mmol/L)[3]：NaCl 124.0；NaHCO324.0；KCl 5.0；KH2PO41.2；CaCl22.4；MgSO41.3；Glucose 10.0；通混合氧(95% O2+5% CO2)使pH至7.4。配制標(biāo)準(zhǔn)細胞外液，配方(mmol/L)[3]：NaCl 150.0；KCl 5.0；MgCl21.0；CaCl22.0；HEPES 10.0；Glucose 10.0；用Tris-base調(diào)節(jié)pH至7.4。配制電極內(nèi)液，配方(mmol/L)[4]：K-gluconate 120.0；KCl 20.0；MgCl22.0；EGTA 0.5；HEPES 20.0；Na2-ATP 2.0；Na-GTP 0.5；用KOH調(diào)節(jié)pH至7.4，并調(diào)節(jié)滲透壓至290～300 mOsm/(kg·H2O)，最后用濾頭(Millex GV filter unit，0.22 μm)過濾后，-20℃冷凍保存。燒制瓊脂：4.0 g瓊脂粉溶于80 mL ACSF中，煮沸，倒入培養(yǎng)皿，冷卻后冷藏備用。配制實驗所需藥品的母液：0.5 mol/L尼古丁(Nicotine，Nic)，1.0 mol/L 谷氨酸(Glutamate，Glu)，冷藏備用。上述HEPES、Tris-base、K-gluconate、EGTA、Na2-ATP、Na-GTP、Nicotine、Glutamate均購自SIGMA公司；普通試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。配液用水均為超純水(Purelab Flex，ELGA LabWater，UK)。使用玻璃微電極毛坯(Sutter Instrument, Inc., USA)，借助微電極拉制儀(WD-2型，成都儀器廠)，拉制實驗所需的微電極，灌注電極內(nèi)液后，入液電阻為5～10 MΩ。

1.3 制備脊髓切片 預(yù)先冷凍適量ACSF(形成冰水混合物)用作切片液，常溫下準(zhǔn)備適量ACSF用作孵育液(預(yù)通混合氧)和適量標(biāo)準(zhǔn)細胞外液(預(yù)通純氧)；準(zhǔn)備乳鼠手術(shù)器械(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、振蕩切片機(Vibratome，Technical Products International Inc.，USA)等，切片機浴槽內(nèi)充以碎冰，保證低溫環(huán)境；從燒制成形的瓊脂上切出一塊立方體(1.3 cm3)，并在一個側(cè)面上切出一條垂直凹槽，冷藏。將麻醉后的乳鼠以俯臥位固定于自制的泡沫手術(shù)臺上，剪開皮膚，暴露脊柱；用剃須刀片沿脊柱兩側(cè)劃開軟組織、切斷神經(jīng)根；然后剪開椎管，暴露脊髓，游離出含腰骶膨大的部分，并在ACSF冰水混合物中(通混合氧)，修剪殘留的神經(jīng)根。再用超能膠水(Pattex，漢高粘合劑有限公司)將脊髓尾端朝上背側(cè)固定于瓊脂塊的凹槽中，再將瓊脂塊(脊髓正對刀片方向)固定于浴碟中央，加入ACSF冰水混合物，繼續(xù)通混合氧；用震蕩切片機將腰骶膨大部切成400～500 μm的薄片，置于常溫ACSF中復(fù)溫，通混合氧，孵育1 h。

1.4 酶消化處理 將脊髓切片移入含酶溶液(Papain，0.18 g/30 mL ACSF)的燒杯中，并置于恒溫水浴箱內(nèi)33℃通氧消化20～35 min。待消化完成，將脊髓切片轉(zhuǎn)入常溫ACSF孵育40 min；之后，借助體視顯微鏡，以中央管為界切去雙側(cè)背角；用自制的不同口徑的巴斯德吹管，按由大到小的順序，在含標(biāo)準(zhǔn)細胞外液(預(yù)通純氧40 min)的培養(yǎng)皿(35 mm×10 mm, Corning, NY, USA)中輕柔地機械吹吸腹角切片，直至切片分散成單細胞；靜置，待細胞貼壁后備用。

1.5 快速給藥系統(tǒng) 本實驗采用的是重力排管快速給藥系統(tǒng)(SF-77B Perfusion Fast-step，Warner Instrument Corporation，USA)，實驗時先用一定量的標(biāo)準(zhǔn)液排出所有給藥管中的空氣，以實現(xiàn)通暢；然后將工具藥(Glutamate、Nicotine等)用標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成所需濃度，加至相應(yīng)給藥管中；標(biāo)準(zhǔn)液加至沖洗管中，備用。

1.6 膜片鉗記錄 依次打開不間斷電源(UPS，SANTAK)、電腦、倒置顯微鏡(Leica DMI 3000 B，Germany)、微操縱儀(MP-225，Sutter Instrument, Inc.，USA)、恒流泵、數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Axon Instrument, Inc., USA)、放大器(Axon Instrument, Inc., USA)等設(shè)備預(yù)熱，后打開Multiclamp 700B和Clampex 10.6記錄軟件。將含分離細胞的培養(yǎng)皿放置于倒置顯微鏡下觀察，找到形態(tài)良好、健康的腹角神經(jīng)元后，移入視野中央；在低倍鏡下調(diào)整給藥管口于細胞附近，沖洗管口正對細胞胞體。取拉制成形的電極，灌注內(nèi)液，安裝電極，調(diào)節(jié)微操縱儀使電極尖端入液，檢測電極電阻，若在5～10 MΩ，補償失調(diào)電位。鏡下緩慢調(diào)節(jié)微操縱儀，將電極尖端移至細胞上方，緩慢下移觸碰細胞，給予適量負(fù)壓吸引，使電極電阻上升直至GΩ封接，并給予電極電容補償。在電流鉗模式下，記錄自發(fā)動作電位等；給予負(fù)壓配合ZAP破膜后，在I=0模式下記錄靜息電位(resting potential，RP)；觀察接入電阻Ra等參數(shù)，當(dāng)Ra<20 MΩ，適用于全細胞電壓鉗記錄(whole-cell voltage clamp recording)，并給予細胞電容補償。在電壓鉗模式下，通過快速給藥系統(tǒng)給予谷氨酸受體激動劑Glu和N型乙酰膽堿受體激動劑Nic，記錄所鉗制神經(jīng)元的電流變化。在此基礎(chǔ)上，從靜息電位開始，由負(fù)及正分別給予不同鉗制電位(VH：-60～40 mV)，記錄電流反應(yīng)的變化，直至電流翻轉(zhuǎn)。

2 結(jié)果

2.1 新生大鼠急性分離的脊髓腹角神經(jīng)元形態(tài) 采用上述方法分離脊髓腹角神經(jīng)元，待細胞貼壁后，置于倒置顯微鏡載物臺上，在高倍鏡下找到形態(tài)良好的神經(jīng)元進行膜片鉗記錄，并拍攝照片(圖1)。分離的神經(jīng)元胞體較大(長徑>30 μm；短徑>20 μm)，呈紡錘形、三角錐形或多角形，邊緣光整；神經(jīng)元的突起從極端發(fā)出，形態(tài)較為完整，具有分支。拉制的玻璃微電極尖端能較好地接觸所分離的神經(jīng)元，并進行封接和記錄。

a.胞體呈紡錘形的神經(jīng)元，從極端發(fā)出四條突起，并有分支；b.玻璃微電極尖端鉗制于a細胞；c.胞體呈菱形的神經(jīng)元；d.玻璃微電極尖端鉗制于c細胞；e.胞體呈菱形的神經(jīng)元，四角分別有突起向外延伸；f.胞體呈四角形的神經(jīng)元，突起較多。圖中所有標(biāo)尺均為50 μm。

圖1 新生大鼠急性分離的脊髓腹角分離神經(jīng)元形態(tài)照片

2.2 分離的脊髓腹角神經(jīng)元自發(fā)動作電位 選擇如上形態(tài)良好的腹角神經(jīng)元，進行膜片鉗記錄。當(dāng)玻璃微電極與細胞膜高阻封接后，在電流鉗模式下，記錄了7個神經(jīng)元的自發(fā)動作電位，測量細胞電生理參數(shù)，結(jié)果見表1。在對記錄的自發(fā)放電分析中，我們發(fā)現(xiàn)腹角神經(jīng)元的放電頻率和幅值有不同的模式(圖 2)，圖2A和2B顯示一種神經(jīng)元的放電模式，幅值較大( >65 mV)，頻率較低 (11 Hz)；圖2C和2D顯示另一種神經(jīng)元的放電模式，幅值較小(<50 mV)，頻率較高(20 Hz)。

參數(shù)數(shù)值靜息電位/mV-61．88±16．70動作電位 放電頻率/Hz13．54±9．97 幅度/mV70．27±5．38 閾電位/mV-47．39±8．02 超射/mV8．39±7．70鋒電位 幅度/mV55．79±17．17 半幅時程/ms1．86±0．99 最大上升斜率/(mV/ms)103．83±47．31 上升時間/ms0．93±0．48 最大下降斜率/(mV/ms)-46．76±34．82 下降時間/ms3．14±2．70

A和C分別為兩例神經(jīng)元在1 s內(nèi)的自發(fā)放電；全細胞電流鉗模式下RP分別為-64.16 mV和-46.35 mV。B和D分別為A和C相應(yīng)放大后的單個動作電位。

圖2 新生大鼠脊髓腹角分離神經(jīng)元的自發(fā)動作電位

2.3 谷氨酸、尼古丁在脊髓腹角分離神經(jīng)元誘發(fā)的全細胞電流及翻轉(zhuǎn)電位 如圖 3顯示，對每一例神經(jīng)元記錄的反應(yīng)結(jié)果進行分析，7個神經(jīng)元給予1 mmol/L谷氨酸誘發(fā)的全細胞電流平均幅值為(324.56±90.54) pA，平均翻轉(zhuǎn)電位為(19.43±12.10)mV；8個神經(jīng)元給予2 mmol/L 尼古丁誘發(fā)的全細胞電流平均幅值為(296.91±77.44) pA，平均翻轉(zhuǎn)電位為(29.06±14.88) mV。

A.在不同鉗制電位下(-60～40 mV)，谷氨酸誘發(fā)的系列全細胞電流，RP=-63.14 mV；B.根據(jù)圖A作出I-V擬合線，其與X軸的交點為谷氨酸電流翻轉(zhuǎn)電位13.60 mV；C.不同鉗制電位下(-60～20 mV)，尼古丁誘發(fā)的系列全細胞電流，RP=-61.24 mV；D.對應(yīng)C作出I-V擬合線，與X軸的交點為尼古丁電流翻轉(zhuǎn)電位20.09 mV；E.脊髓腹角神經(jīng)元谷氨酸、尼古丁電流翻轉(zhuǎn)電位的統(tǒng)計圖。

圖3 分離的典型腹角神經(jīng)元谷氨酸或尼古丁誘發(fā)的全細胞電流及其翻轉(zhuǎn)電位

3 討論

盡管已有通過酶消化結(jié)合機械吹打來進行中樞神經(jīng)元分離的報道[1-2,5-8]，并有初步電生理實驗結(jié)果，但多見于海馬神經(jīng)元分離和電生理記錄[1-2,6,8]，而脊髓腹角神經(jīng)元的分離技術(shù)僅有少量形態(tài)學(xué)實驗的報道，缺乏功能研究[1-2]；我們實驗中記錄的細胞形態(tài)(圖1)與報道的基本一致[1-2]，另有胞體呈現(xiàn)紡錘形、三角形或多邊形；突起從極端向外延伸，發(fā)出分支，并被較為完整的分離保留，提示我們分離的細胞形態(tài)更加健康，適合開展功能研究。以往的文獻報道使用不同的消化酶處理各類神經(jīng)元[9-13]，為了分離出健康的脊髓腹角神經(jīng)元，我們首先沿用實驗室長期制備腦片的經(jīng)驗，制備脊髓腰骶部切片，在酶消化中，我們應(yīng)用papain(木瓜蛋白酶)，它是一種蛋白水解酶，作用迅速，消化時間短，對神經(jīng)元傷害小。而早先的文獻報道[1]使用膠原蛋白酶和鏈霉蛋白酶聯(lián)合消化，時間超過1 h。此外，我們也曾使用papain處理大鼠視網(wǎng)膜分離出神經(jīng)節(jié)細胞和無長突細胞，并開展相關(guān)調(diào)質(zhì)作用的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究[14]，效果頗好。最后我們使用拋光的巴斯德管機械吹打，打散細胞間的連接，分解細胞外基質(zhì)，最終得到分離的單細胞。更重要的是，通過此方法獲得的單細胞能保持原有的形態(tài)學(xué)和電生理特性，使得電生理實驗結(jié)果更加真實可靠。近年來，由于細胞培養(yǎng)技術(shù)的建立，采用培養(yǎng)的神經(jīng)元開展電生理研究的報道屢見不鮮，如采用培養(yǎng)的胚胎大鼠及成年大鼠脊髓運動神經(jīng)元進行膜片鉗記錄[15-16]。雖然培養(yǎng)的細胞狀態(tài)較好，但是有學(xué)者認(rèn)為培養(yǎng)的細胞不同于在體狀態(tài)，其形態(tài)、功能等方面在外界環(huán)境的影響下，可能發(fā)生變化，而急性分離的神經(jīng)元卻能保持相對完好的生理特性[5,9-10]，因而更適合進行功能研究。

現(xiàn)階段，離體的膜片鉗記錄根據(jù)應(yīng)用的標(biāo)本不同，主要分為腦片(slice)膜片鉗和分離細胞(單細胞)膜片鉗兩種。利用腦片膜片鉗記錄開展脊髓腹角神經(jīng)元的研究已有報道[17-18]，而在急性分離的脊髓腹角神經(jīng)元結(jié)合膜片鉗研究尚未見報道，其可能原因為：脊髓腹角神經(jīng)元特別是運動神經(jīng)元較為脆弱，耐缺氧能力差，胞體較大，經(jīng)過酶解消化和機械吹打后，細胞狀態(tài)一般比較差，不太適合作功能研究。而我們的實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用我們的方法急性分離脊髓腹角神經(jīng)元并開展膜片鉗實驗，在大多數(shù)腹角神經(jīng)元上可以記錄到自發(fā)動作電位(圖 2)，其電生理參數(shù)(表1)與本實驗室傳統(tǒng)的細胞內(nèi)記錄研究結(jié)果以及培養(yǎng)的運動神經(jīng)元自發(fā)放電參數(shù)基本一致[15,18-19]，自發(fā)動作電位連續(xù)而穩(wěn)定，基本上皆有超射，提示分離的腹角神經(jīng)元狀態(tài)良好。此外，我們對分離的腹角神經(jīng)元給予谷氨酸或尼古丁，皆可記錄到穩(wěn)定的全細胞電流(圖3)，這也與相關(guān)研究結(jié)果[16-18]基本一致。我們利用記錄到的谷氨酸或尼古丁誘發(fā)的全細胞電流還進行了翻轉(zhuǎn)電位等研究，這些皆證實我們設(shè)計的方法具有可行性、可靠性。但從圖 2的實驗結(jié)果來看，新生大鼠脊髓腹角神經(jīng)元的自發(fā)放電模式不止一種，提示分離的細胞中存在不同類型的神經(jīng)元。后期，根據(jù)文獻[20-21]，我們將采用熒光試劑逆行標(biāo)記的方法，鑒定出脊髓運動神經(jīng)元，以便專一地研究運動神經(jīng)元在運動控制中的作用及其機制。當(dāng)然，分離細胞膜片鉗記錄技術(shù)也有其局限性，通過酶解分離的細胞已不具有突觸前成分，因而不適合突觸前機制的研究，在今后的工作中，可以結(jié)合腦片膜片鉗或細胞內(nèi)記錄技術(shù)來聯(lián)合開展脊髓腹角突觸傳遞的系統(tǒng)研究，更全面深入地揭示脊髓運動控制的機制。

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Patch-clamprecordingtechniqueforacutelydissociatedspinalcordventralhornneurons

GAOLingyun,ZHANGHuanhuan,ZHAYingying,ZHENGChao,WANGMengya

Cell Electrophysiology Laboratory, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China

Objective： To establish a technique of patch-clamp recording of acutely dissociated spinal cord ventral horn neurons for further investigation of roles of diverse receptors on the neurons.Methods: Neonatal SD rats(aged 6 to 11 days) were included and received lumbosacral laminectomy after anesthesia. Then the lumbosacral spinal cord was removed and transverse slices were prepared. Dorsal horn of the slice was cut off after digestion with Papain. Patch-clamp recording was then performed on mechanically dissociated ventral horn neurons.Results: ①Dissociated ventral horn neurons had characteristic morphology with a fusiform, triangular, or polygonal soma and broad dendrites emanating from the poles; ②Electrophysiological parameters for spontaneous firings of the dissociated neurons (n=7)were: resting potential, (-61.88±16.70) mV; threshold, (-47.39±8.02) mV; spike amplitude, (55.79±17.17) mV; overshoot, (8.39±7.70) mV; and firing frequency, (13.54±9.97)Hz; ③The amplitudes of 1 mmol/L glutamate-induced currents recorded in the 7 ventral horn neurons were (324.56±90.54) pA, the average equilibrium potentials (EGlus), (19.43±12.10) mV, whereas amplitudes of 2 mmol/L nicotine-induced currents in the 8 ventral horn neurons were (296.91±77.44) pA, the average equilibrium potentials (ENics),(29.06±14.88) mV.Conclusion: The whole-cell patch-clamp recording technique for acutely dissociated spinal cord ventral horn neurons was successfully established, and this technique can be applied to investigate the receptors and their distributions, classifications and functional mechanisms underlying related modulators or drugs.

spinal cord; acute isolation; ventral horn neuron; patch-clamp recording; neonatal rat

1002-0217(2017)06-0511-05

國家自然科學(xué)基金項目(31200828，31271155，81601158)；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃項目(gxyqZD2016175，gxyq2017034)；皖南醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金(rcqd201609)

2017-04-28

高凌云(1991-)，女，2015級碩士研究生，(電話)18055382113，(電子信箱)gao-ly@hotmail.com；

鄭 超，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)chaozheng10@fudan.edu.cn，通信作者；

汪萌芽，男，教授，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)wangmy@wnmc.edu.cn，通信作者。

R 33-33;R 338.2

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.06.001