菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的研究

張倩茹， 安曉萍， 王 園， 王瑞芳， 王乃鳳， 齊景偉

菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的研究

張倩茹， 安曉萍， 王 園， 王瑞芳， 王乃鳳， 齊景偉*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

為研究固態(tài)發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件，本試驗以木聚糖含量為指標(biāo)，采用單因素試驗，依次研究單菌發(fā)酵、雙菌發(fā)酵、菌種比例、單酶發(fā)酵、雙酶發(fā)酵、雙酶比例、酶的用量對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響。結(jié)果表明：發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件為：枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1∶9，發(fā)酵時添加纖維素酶量為1000 U/g飼料。在此條件下，木聚糖含量可達1.421 mg/g，與對照組相比顯著提高了257%。

酵母菌；枯草芽孢桿菌；纖維素酶；玉米芯；木聚糖

The best combination of enzymatic conditions for the study of solid state fermentation preparation from corncob xylan，the xylan content as the index，the single factor test was used to study the effects of single strain fermentation，double fermentation，strain ratio，single enzyme fermentation，enzyme fermentation，enzyme and enzyme dosage on the content of xylan in the fermentation products.The results showed that the optimum enzyme combination conditions for preparing xylan from fermented corncob were as follows:the ratio of Bacillus subtilis to yeast was 1∶9，and the amount of cellulase added was 1000 U/g feed.Under these conditions，xylan content was up to 1.421mg/g，which was significantly higher than that of the control group by 257%.

yeast；Bacillus subtilis；cellulase；corncob；xylan

木聚糖是以 β-（1，4）-D-吡喃型木糖構(gòu)成主鏈，以4-0-甲基-吡喃型葡萄糖醛酸為支鏈的多糖（陳國榮等，2009）。木聚糖經(jīng)酶解可用于制備低聚木糖，機體攝入低聚木糖可顯著促進腸道益生菌的生長。提取木聚糖主要有以下幾種方法：酸水解法(徐曉燕等，2007)、堿液提取法（石波，2001）、蒸汽爆破法（張帆，2013）、蒸煮提取法(趙建等，2004)、預(yù)處理-酶水解法（楊瑞金等，2007）等。

玉米芯是制備木聚糖的理想原材料之一，據(jù)統(tǒng)計，我國每年有2000萬噸以上的玉米芯副產(chǎn)物，可以為木聚糖的制備提供豐富的原料資源（孫軍濤等，2015）。

近年來，微生物發(fā)酵和酶解技術(shù)被應(yīng)用于制備木聚糖，本試驗以發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量為評價指標(biāo)，研究單菌發(fā)酵、雙菌發(fā)酵、菌種比例、單酶發(fā)酵、雙酶發(fā)酵、雙酶比例、酶用量對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響，為玉米芯的綜合利用及木聚糖的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌均購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 原料 玉米芯、豆粕、麩皮均購于市場，粉碎過篩。

纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶均購買于濟南諾能生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，MRS肉湯培養(yǎng)基，麥芽汁培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：80%玉米芯，10%豆粕，10%麩皮。

1.1.4 儀器 JJ-CJ-1F超凈工作臺、TG16-WS臺式高速離心機、SYQ-DSX-28OB手提式壓力蒸汽滅茵器、CP224C電子天平、GX2智力光照培養(yǎng)箱、Epoch2酶標(biāo)儀等。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化及種子液的制備 枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌：將冷凍保存的菌種在滅菌的營養(yǎng)瓊脂平皿中劃線，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待長出菌落后，挑取單個菌落于滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于搖床37℃，120 r/min培養(yǎng)24 h，即為種子液。

植物乳桿菌:將冷凍保存的菌種在滅菌的MRS肉湯瓊脂平皿中劃線，36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待長出菌落后，挑取單個菌落于滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于搖床36℃，120 r/min培養(yǎng)24 h，即為種子液。

酵母菌:將冷凍保存的菌種在滅菌的麥芽汁瓊脂平皿中劃線，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待長出菌落后，挑取單個菌落于滅菌的麥芽汁培養(yǎng)基中，置于搖床28℃，120 r/min培養(yǎng)24 h，即為種子液。

1.2.2 試驗設(shè)計 本試驗玉米芯固態(tài)發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度36℃，發(fā)酵時間72 h，裝料量50 g，料水比1∶1，接種量10%，初始pH為自然pH。以木聚糖含量為指標(biāo)，采用單因素試驗依次確定出最佳的發(fā)酵菌種比例和商品酶種類及用量。

1.2.3 木聚糖提取液的制備 固態(tài)發(fā)酵后，將發(fā)酵產(chǎn)物與無菌蒸餾水以1∶10的比例裝入三角瓶中，置于37℃的恒溫水浴搖床以135 r/min振蕩1 h，然后 5000 r/min，4 ℃離心 10 min，提取上清液待測。

1.2.4 檢測指標(biāo) 還原糖測定方法：3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）。

式中：m為還原糖的質(zhì)量；M為待測產(chǎn)物的質(zhì)量（丁勝華等，2010）。

1.3 數(shù)據(jù)分析 所有試驗均重復(fù)三次，試驗結(jié)果運用SASS 9.2軟件，采用單因子方差分析（ANOVA）并用Duncan’s方法對各組間平均數(shù)進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行整理并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌發(fā)酵玉米芯對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響 枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌分別發(fā)酵玉米芯，發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖1，對照組為不加菌發(fā)酵。

圖1 單菌發(fā)酵玉米芯對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

由圖1可知，四株菌都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米芯的產(chǎn)物中木聚糖含量最高，為0.764 mg/g，與對照組相比提高了282%（P＜0.05），故確定單菌最佳發(fā)酵菌種為枯草芽孢桿菌。

2.2 雙菌發(fā)酵玉米芯對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響 枯草芽孢桿菌分別與地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌組合發(fā)酵玉米芯，發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖2，對照組為不加菌發(fā)酵。

圖2 雙菌發(fā)酵玉米芯對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

由圖2可知，三種菌種組合都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中枯草芽孢桿菌和酵母菌組合發(fā)酵玉米芯的產(chǎn)物中木聚糖含量最高，為0.991 mg/g，與對照組相比提高了 395%（P＜0.05），故確定枯草芽孢桿菌與酵母菌的組合為發(fā)酵玉米芯的最佳菌種組合。

2.3 枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例對玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響 枯草芽孢桿菌與酵母菌以不同比例發(fā)酵玉米芯，發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量見圖3，對照組為不加菌發(fā)酵。

圖3 枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例對玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

由圖3可知，枯草芽孢桿菌與酵母菌以任何比例接種都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中當(dāng)枯草芽孢桿菌與酵母菌的比例為1∶9時，發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量最高，為1.108 mg/g，與對照組相比提高了454%（P＜0.05），故確定枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例為1∶9。

2.4 單酶發(fā)酵玉米芯對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響 發(fā)酵玉米芯時，分別添加纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶，發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖4，對照組為不加酶發(fā)酵。

圖4 單酶發(fā)酵玉米芯對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

由圖4可知，發(fā)酵時添加這四種酶都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中添加纖維素酶的發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量最高，為1.319 mg/g，與對照組相比提高了231%（P＜0.05），故確定最佳發(fā)酵單酶為纖維素酶。

2.5 雙酶發(fā)酵玉米芯對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響 纖維素酶分別與木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶組合發(fā)酵玉米芯，發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖5，對照組為不加酶發(fā)酵。

圖5 雙酶發(fā)酵玉米芯對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

由圖5可知，三種酶組合都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中纖維素酶和木聚糖酶組合發(fā)酵玉米芯的產(chǎn)物中木聚糖含量最高，為1.236 mg/g，與對照組相比提高了 211%（P＜0.05），故確定纖維素酶與木聚糖酶的組合為發(fā)酵玉米芯最佳酶組合。

2.6 纖維素酶與木聚糖酶的比例對玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響 纖維素酶與木聚糖酶以不同比例發(fā)酵玉米芯，發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量見圖6，對照組為不加酶發(fā)酵。

圖6 纖維素酶與木聚糖酶的比例對玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

由圖6可知，纖維素酶與木聚糖酶以任何比例都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中當(dāng)纖維素酶與木聚糖酶的比例為1∶0時，發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量最高，為1.498 mg/g，與對照組相比提高了276%（P＜0.05），故確定纖維素酶與木聚糖酶的比例為1∶0，即纖維素酶為最佳發(fā)酵添加酶。

2.7 纖維素酶的添加量對玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響 纖維素酶以不同添加量發(fā)酵玉米芯，發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖7，對照組為不加酶發(fā)酵。

圖7 纖維素酶的添加量對玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

由圖7可知，纖維素酶以任何添加量都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中當(dāng)纖維素酶添加量為1000 U和4000 U時，發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量最高，分別為1.421、1.446 mg/g，與對照組相比分別提高了257%、263%，但差異不顯著（P＞0.05），考慮到成本，故選擇纖維素酶最適添加量為1000 U/g飼料。

3 討論

玉米芯是木聚糖含量最高的農(nóng)副產(chǎn)品，含量為35%～40%，是制備木聚糖的最佳原料。李里特（2004）、楊瑞金（2000）、邵佩蘭等（2000）利用不同的提取方法證明，從玉米芯中提取木聚糖是可行的，而且提取率較高，羅曉風(fēng)（2005）等用堿法提取木聚糖的得率為22.7%。本試驗結(jié)果表明，在枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1∶9，發(fā)酵時添加纖維素酶量為1000 U/g飼料的條件下，木聚糖含量可達1.421 mg/g，與對照組相比顯著提高了257%。

玉米芯中主要的多糖為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，半纖維素主要是由木聚糖組成，因此半纖維素含量的高低直接決定著木聚糖的得率。由于纖維素與半纖維素、木質(zhì)素等以多種物理或化學(xué)作用結(jié)合,形成致密的木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)，單純使用酶降解玉米芯會導(dǎo)致酶解效率不高,生產(chǎn)成本增大（何亮亮，2012）。因此，要保證在實際生產(chǎn)中纖維素酶有較高的酶解效率,必須消除木質(zhì)纖維在結(jié)構(gòu)上的酶解障礙,因而在對木質(zhì)纖維進行酶解之前,采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行預(yù)處理是必要的。常用方法之一是利用細菌、真菌等微生物的降解作用達到去除木質(zhì)素，使纖維組織松散的目的。Zhang等（2007）用白腐菌處理的竹子降解后的還原糖得率是未處理樣品的2.34倍,顯示出較好的處理效果?？莶菅挎邨U菌與酵母菌是微生物發(fā)酵技術(shù)常用的發(fā)酵菌種，都具有產(chǎn)纖維素酶的能力 （甄玉國，2005；Antonio等，2004），本試驗通過使用枯草芽孢桿菌、酵母菌與纖維素酶協(xié)同發(fā)酵玉米芯，可以降解玉米芯中部分半纖維素使其表面出現(xiàn)空隙，增加酶和纖維素的可接觸面積，從而提高酶解率及木聚糖產(chǎn)量（鄭志，2012）。本試驗可為菌酶協(xié)同制備木聚糖的研究提供一些理論依據(jù)。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件為：枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1∶9，發(fā)酵時添加纖維素酶量為1000 U/g飼料。在此條件下，木聚糖含量可達1.421 mg/g，與對照組相比顯著提高了257%。

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S816.3

A

1004-3314（2017）22-0023-04

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