多菌株聯(lián)合發(fā)酵玉米秸稈的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

張 昕， 金和花， 王雪瑩， 田家英

多菌株聯(lián)合發(fā)酵玉米秸稈的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

張 昕， 金和花， 王雪瑩*， 田家英

（吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林長春 130507）

為研究平菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉多菌株聯(lián)合發(fā)酵玉米秸稈的固態(tài)發(fā)酵條件，本試驗(yàn)對(duì)玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵過程中原料的初始pH、含水量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵工藝條件為原料初始pH為5.5，原料含水量為65%，發(fā)酵溫度為25℃，發(fā)酵時(shí)間為120 h。在最優(yōu)發(fā)酵條件下聯(lián)合發(fā)酵菌株濾紙酶活力（FPA）為 13.57 IU/g。

玉米秸稈；發(fā)酵；纖維素酶

This paper studied on the optimization of solid-state fermentation conditions of corn-stalks through multistrains’co-fermenting process，which included the Pleurotusostreatus PL-01，Aspergillusniger M6.300 and Trichodermareesei.The solid-state fermentation conditions of initial pH，moisture content of raw material，fermentation temperature，fermentation time were optimized.The results showed that the conditions of solid-state fermentation were initial pH 5.5，moisture content 65% ，fermentation temperature 25 ℃ ，fermentation time 120 h.The FPA enzyme activity of co-fermented strains reached 13.57 IU/g under these conditions.

corn stalk；fermentation conditions；cellulase

我國玉米秸稈年產(chǎn)量約2.6億噸，有效利用率50%左右（楊軼囡等，2016）。由于秸稈資源化利用的技術(shù)還不夠成熟，仍然有大部分的秸稈被焚燒，造成資源的巨大浪費(fèi)和環(huán)境污染。玉米秸稈的基本成分中，纖維素約占干重的37.3%，半纖維素20.6%，木質(zhì)素17.5%（張強(qiáng)等，2007）。目前玉米秸稈資源化利用的瓶頸問題，就是秋季玉米秸稈收割后，秸稈運(yùn)輸成本高、貯藏困難，秸稈中纖維素降解周期長，秸稈資源化利用的相關(guān)技術(shù)難以轉(zhuǎn)化為工業(yè)化生產(chǎn)。

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，其不是單組分酶，多達(dá)十幾種組分。主要包括 3大類：內(nèi)切葡聚糖酶（1，4-β-D-glucanglu canohydrolase，EC 3.2.1.4， 也稱 CMC 酶，EG），這類酶可作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素。外切葡聚糖 酶 （1，4-β -D-glucan cellobiohydrolase， EC 3.2.1.91，也稱纖維二糖水解酶，CBH），這類酶可作用于纖維素線性分子末端，水解β-1，4-糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子。β-葡萄糖苷酶（1，4-β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21， 也稱纖維二糖酶，BG或CB），這類酶將纖維二糖水解為葡萄糖。當(dāng)以上三種酶主要成分的活性比例適當(dāng)時(shí)，則能協(xié)同作用完成對(duì)纖維素的降解（張昕等，2011）。

本研究利用玉米秸稈為原料，選擇平菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉作菌種，采用田間窖貯多菌株聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵方式，生產(chǎn)玉米秸稈發(fā)酵飼料。優(yōu)化玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的初始pH、含水量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間（何國慶等，2009），為生產(chǎn)玉米秸稈發(fā)酵飼料提供工藝參數(shù)。在三株真菌酶系的協(xié)同作用下，實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米秸稈中纖維素的降解和益生菌的大量繁殖，利用無機(jī)氮源產(chǎn)生新的氨基酸、菌體蛋白、生長因子、免疫物質(zhì)（曾瑩等，2004）。有效提高玉米秸稈的飼用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 原料 玉米秸稈、苜蓿，產(chǎn)自吉林省長春市九臺(tái)區(qū)，玉米成熟后秸稈上部有5片綠葉時(shí)的秸稈；水解羽毛粉，石家莊宏輝生物科技有限公司羽毛粉；其他試劑，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑分析純。

平菇（Pleurotus ostreatus）PL-01、黑曲霉（Aspergillus niger）M6.300、里氏木霉（Trichoderma reesei）為吉林工商學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.2 玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料配方 玉米秸稈粒（直徑 2.80 mm）100.00 g，尿素 0.80 g，硫酸銨 1.80 g， 硫酸鎂 0.02 g，磷酸氫二鉀 0.06 g（張昕等，2016）。

1.3 酶活力測(cè)定

1.3.1 粗酶液提取 取玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵料5.00 g于研缽中，加入0.05 mol/L的pH 4.8檸檬酸緩沖液50 mL研碎，取上清液過濾，6000 r/min、4℃離心15 min，取上清液即為粗酶液（李冠杰等，2015）。

1.3.2 濾紙酶活（FPA）的測(cè)定 在25 mL具塞試管中加pH 4.8檸檬酸緩沖液1 mL，再加入一條WhatmanNo.1濾紙（60mm×10mm），50℃預(yù)熱 8 min后加入0.5 mL粗酶液，50℃保溫30min，加入3 mL的DNS液，在沸水浴5 min，用流動(dòng)冷水終止反應(yīng)，加蒸餾水至25 mL，混合均勻（王菁莎等，2006）。濾紙沉淀后，取上清液在540 nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生成的還原糖量。同時(shí)用失活的粗酶液作對(duì)照（韓立榮等，2008）。

一個(gè)濾紙酶活力國際單位（FPIU）定義為在酶促反應(yīng)中每分鐘生成1.0 μmol葡萄糖所需的酶量。濾紙酶活力（FPA）以 IU/g表示（劉韞滔等，2008）。

圖1 玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的初始pH優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的初始pH優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 把玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的初始pH分別 調(diào) 到 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。 采 用 平 菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉聯(lián)合發(fā)酵玉米秸稈，接種量（g/g）分別為 3%、2%、5%，原料的含水量為 70%，29 ℃發(fā)酵 96 h（羅洋等，2014），發(fā)酵結(jié)束后提取粗酶液分別測(cè)定FPA酶活力，優(yōu)化玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的初始pH結(jié)果見圖1。

由圖1可知，玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的初始pH為3.5～5.0時(shí)，酶活力逐漸增大，pH為5.0時(shí)酶活力達(dá)到高峰，pH大于5.0時(shí)，酶活力明顯下降。表明發(fā)酵原料的初始pH不僅影響聯(lián)合發(fā)酵菌株的生長及細(xì)胞代謝能力，而且影響各菌株產(chǎn)纖維素酶活力，通過優(yōu)化得到聯(lián)合發(fā)酵菌株FPA酶活力較高的原料初始pH分別為4.5、5.0、5.5。

2.2 玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的含水量優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 把玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的含水量分別調(diào)到 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%，原料的初始pH為5.0，采用平菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉聯(lián)合發(fā)酵玉米秸稈，接種量（g/g）分別為3%、2%、5%，29℃發(fā)酵96 h，發(fā)酵結(jié)束后提取粗酶液分別測(cè)定FPA酶活力，優(yōu)化玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的含水量結(jié)果見圖2。

圖2 玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的含水量優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料含水量為45%～65%時(shí)，隨著原料含水量的增加，酶活力明顯提高，原料的含水量超過65%以后，隨著含水量的升高酶活力緩慢下降。真菌的生長需要大量的自由水，含水量低于55%不利于真菌的生長；在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，含水量大的培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌后黏稠結(jié)塊，導(dǎo)致培養(yǎng)基中含氧量降低，真菌的生長繁殖和產(chǎn)酶需要大量的氧，培養(yǎng)料加水量過大使真菌因缺氧而生長繁殖和產(chǎn)酶受到抑制。通過優(yōu)化得到聯(lián)合發(fā)酵菌株FPA酶活力較高的原料含水量分別為60%、65%、70%。

2.3 玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵溫度的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的含水量為65%，原料的初始pH為5.0，平菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉聯(lián)合發(fā)酵玉米秸稈，接種量（g/g）分別為3%、2%、5%，把培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為 23、25、27、29、31、33、35 ℃發(fā)酵 96h，發(fā)酵結(jié)束后提取粗酶液分別測(cè)定FPA酶活力，優(yōu)化玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵溫度結(jié)果見圖3。

圖3 玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵溫度的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

由圖3可知，培養(yǎng)溫度為23～27℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶活力明顯提高；溫度為27～31℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶活力緩慢下降；超過 31℃以后，隨著溫度的升高酶活力明顯下降。由于玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵采用平菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉三株真菌聯(lián)合發(fā)酵，每株真菌生長及產(chǎn)酶的最適宜溫度不同，因此通過優(yōu)化試驗(yàn)選擇聯(lián)合發(fā)酵菌株的最適宜發(fā)酵溫度尤為重要，發(fā)酵溫度明顯影響微生物的生長及產(chǎn)酶。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度33℃以上細(xì)菌污染的幾率也會(huì)提高。通過優(yōu)化得到聯(lián)合發(fā)酵菌株FPA酶活力較高的發(fā)酵溫度分別為 25、27、29 ℃。

2.4 玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的含水量為65%，原料的初始pH為5.0，平菇PL-01、黑曲霉M6.300、里氏木霉聯(lián)合發(fā)酵玉米秸稈，接種量（g/g）分別為3%、2%、5%，培養(yǎng)溫度 27 ℃，分別培養(yǎng) 60、72、84、96、108、120、132 h后測(cè)定菌體FPA酶活力，優(yōu)化玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵時(shí)間結(jié)果見圖4。

圖4 玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

由圖4可知，發(fā)酵時(shí)間為60～72 h時(shí)，酶活力上升緩慢；可能由于微生物生長處于適應(yīng)期，需要合成大量的誘導(dǎo)酶，細(xì)胞數(shù)未達(dá)到高峰，因此產(chǎn)生的纖維素酶較少；發(fā)酵時(shí)間為72～120 h時(shí)，酶活力上升較快；可能由于微生物生長處于對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，已經(jīng)合成大量的誘導(dǎo)酶，細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，因此產(chǎn)生大量的高活力纖維素酶；120 h以后酶活力出現(xiàn)下降，可能是由于發(fā)酵液的pH變化及孢子的形成引起的。綜和分析酶活力和經(jīng)濟(jì)效益，優(yōu)化得到聯(lián)合發(fā)酵菌株FPA酶活力較高的發(fā)酵時(shí)間分別為 108、120、132 h。

2.5 優(yōu)化玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵條件L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果 選擇單因素優(yōu)化的玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的初始pH、含水量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間四因素的三水平，以聯(lián)合發(fā)酵菌株FPA酶活力為指標(biāo)。設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)工藝條件結(jié)果見表1。

表1 優(yōu)化玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵條件L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，各因素對(duì)聯(lián)合發(fā)酵菌株FPA酶活力的影響大小順序依次為D＞C＞B＞A，即發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞原料含水量＞原料的初始pH。最佳方案為A3B2C1D2，即玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵原料的初始pH為5.5，原料的含水量為65%，發(fā)酵溫度25℃，發(fā)酵時(shí)間120 h。

2.6 試驗(yàn)驗(yàn)證 為了驗(yàn)證L9（34）正交試驗(yàn)方法優(yōu)化多菌株聯(lián)合發(fā)酵玉米秸稈的固態(tài)發(fā)酵條件的可行性，運(yùn)用正交試驗(yàn)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵工藝條件得到的工藝參數(shù)，以聯(lián)合發(fā)酵菌株FPA酶活力為指標(biāo)，試驗(yàn)做3個(gè)平行。測(cè)得的聯(lián)合發(fā)酵菌株FPA酶活力為13.57 IU/g，說明采用L9（34）正交試驗(yàn)方法優(yōu)化多菌株聯(lián)合發(fā)酵玉米秸稈的固態(tài)發(fā)酵條件合理可行。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)對(duì)玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定聯(lián)合發(fā)酵菌株FPA酶活力較高的玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵條件為原料初始pH為5.0，原料的含水量為65%，發(fā)酵溫度27℃，發(fā)酵時(shí)間120 h。

通過L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定聯(lián)合發(fā)酵菌株FPA酶活力較高的玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵條件為原料的初始pH為5.5，原料的含水量為65%，發(fā)酵溫度25℃，發(fā)酵時(shí)間120 h。

在優(yōu)化的發(fā)酵條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得聯(lián)合發(fā)酵菌株FPA酶活力為13.57 IU/g。說明采用L9（34）正交試驗(yàn)方法優(yōu)化多菌株聯(lián)合發(fā)酵玉米秸稈的固態(tài)發(fā)酵條件合理可行。

本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，與響應(yīng)面優(yōu)化方法相比具有一定的局限性。下一步擬采用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以得到更高FPA酶活力，為工業(yè)化生產(chǎn)提供工藝參數(shù)。

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S816.6

A

1004-3314（2017）22-0015-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172204

吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目

*通訊作者