‘槜李’果實(shí)軟化相關(guān)基因PsPG的克隆與表達(dá)分析

王 剛， 賈展慧， 張計(jì)育， 賈曉東， 王 濤， 翁文昕， 宣繼萍， 郭忠仁

〔江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

‘槜李’果實(shí)軟化相關(guān)基因PsPG的克隆與表達(dá)分析

王 剛， 賈展慧， 張計(jì)育， 賈曉東， 王 濤， 翁文昕， 宣繼萍①， 郭忠仁①

〔江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

研究了室溫〔(25±1) ℃〕貯藏、低溫〔(4±1) ℃〕貯藏、1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理和減壓浸鈣處理?xiàng)l件下‘槜李’(Prunussalicina‘Zuili’)果實(shí)硬度的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步克隆獲得‘槜李’的多聚半乳糖醛酸酶基因(PsPG)，并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)和表達(dá)分析。結(jié)果表明：低溫貯藏、1-MCP處理和減壓浸鈣處理可有效減緩‘槜李’果實(shí)硬度下降?！畼椑睢疨sPG基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為1 134 bp，編碼377個(gè)氨基酸。PsPG蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由11.14%的α螺旋、31.03%的β折疊和57.82%的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：PsPG蛋白含有果膠酸裂解酶3結(jié)構(gòu)域和4個(gè)PbH1結(jié)構(gòu)域；PsPG基因與Prunuspersica(Linn.) Batsch和PrunusarmeniacaLinn.的PG基因編碼的氨基酸序列的親緣關(guān)系較近，相似度達(dá)96%以上。qRT-PCR分析結(jié)果顯示：隨著采后貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，低溫貯藏、1-MCP處理和減壓浸鈣處理?xiàng)l件下PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量均呈先升高后降低的趨勢(shì)，且分別于貯藏5、3和5 d達(dá)到最高值。研究結(jié)果顯示：‘槜李’PsPG基因與其果實(shí)軟化關(guān)系密切，低溫貯藏是‘槜李’果實(shí)采后保鮮的有效手段，可抑制PsPG基因的表達(dá)以延緩果實(shí)軟化。

‘槜李’；PsPG基因； 克??； 基因表達(dá)； 果實(shí)軟化

軟化不僅是果實(shí)成熟的顯著特征，也是影響采后果實(shí)貯藏品質(zhì)和貨架期的重要因子。在果實(shí)軟化過(guò)程中，細(xì)胞壁的降解和細(xì)胞總體結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致細(xì)胞壁松動(dòng)和分離。目前，對(duì)參與果實(shí)軟化過(guò)程細(xì)胞壁降解的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)已有廣泛研究，雖然研究表明PG可能不是惟一調(diào)節(jié)果實(shí)軟化進(jìn)程的關(guān)鍵酶[1]，但在蘋(píng)果(MalusdomesticaBorkh.)[2]、翠冠梨(Pyruspyrifolia‘Cuiguan’)[3]、Prunuspersica(Linn.) Batsch[4]和Prunusdomesticasubsp.insititia(Linn.) C. K. Schneid.[5]的果實(shí)成熟過(guò)程中PG積累并負(fù)責(zé)水解細(xì)胞壁中多聚半乳糖醛酸中的1，4-α-D-半乳糖苷鍵，同時(shí)伴隨mRNA轉(zhuǎn)錄水平和PG活性的上升，說(shuō)明PG在核果類果實(shí)軟化過(guò)程中起著重要作用。

植物中PGs是一個(gè)大的基因家族[6]，不同成員的應(yīng)激反應(yīng)和時(shí)空表達(dá)存在差異。目前，已分離獲得Prunuspersica[4]、Prunusdomesticasubsp.insititia[5]、中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)[7]、甜瓜(CucumismeloLinn.)[8]、葡萄(VitisviniferaLinn.)[9]、西洋梨(PyruscommunisLinn.)[10]和草莓(Fragaria×ananassaDuch.)[11]等植物果實(shí)的PG基因，這些基因在果實(shí)軟化過(guò)程中發(fā)揮不同的作用。

‘槜李’(Prunussalicina‘Zuili’)是薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusLinn.)植物，主要分布于浙江嘉興地區(qū)，是中國(guó)稀有的李中珍品。其果實(shí)含有豐富的氨基酸、鈣、鐵、維生素和有機(jī)酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分，且‘槜李’果實(shí)成熟時(shí)肉質(zhì)果肉化漿，汁液香如醴、甘如蜜，風(fēng)味獨(dú)特，深受人們喜愛(ài)?！畼椑睢麑?shí)屬于呼吸躍變型果實(shí)，采收后迅速進(jìn)入呼吸高峰期，并在3 d內(nèi)快速軟化，達(dá)到后熟化漿狀態(tài)，極不耐貯藏，限制了其商品性。闡明‘槜李’果實(shí)軟化的分子機(jī)制對(duì)調(diào)控其采收、貯藏和貨架期有很大幫助，但有關(guān)‘槜李’果實(shí)細(xì)胞壁降解基因的研究極少。

本研究以‘槜李’果實(shí)為研究材料，克隆并結(jié)合不同采后處理研究了‘槜李’PG基因在采后貯藏期間的表達(dá)特性，以期揭示‘槜李’PG基因在其果實(shí)軟化過(guò)程中的作用，并為采取適宜措施延長(zhǎng)‘槜李’果實(shí)的貨架期提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

‘槜李’果實(shí)采自浙江省桐鄉(xiāng)市桃園村‘槜李’種質(zhì)資源苗圃。2014年6月25日采收八成熟果實(shí)，散去田間熱后裝箱運(yùn)回江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所果樹(shù)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室。挑選大小均一、熟度一致、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)并隨機(jī)分成4組進(jìn)行處理。共設(shè)置4個(gè)處理組：T1(室溫貯藏，對(duì)照)，不做任何采后處理，(25±1) ℃貯藏；T2(低溫貯藏)，不做任何采后處理，(4±1) ℃貯藏；T3(減壓浸鈣處理)，在80 kPa下采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2% CaCl2溶液浸泡5 min后取出晾干，(25±1) ℃貯藏；T4〔1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理〕，在含0.5 μL·L-11-MCP氣體的密閉箱中放置24 h后拿出，(25±1) ℃貯藏。每處理組250個(gè)果實(shí)。采后當(dāng)天(記為0 d)開(kāi)始測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。果實(shí)硬度每天測(cè)定1次，共11次。每處理組每2 d取20個(gè)果實(shí)的果肉組織，去除外果皮和內(nèi)果皮后，將中果皮在液氮中速凍后，于-80 ℃冰箱中保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 果實(shí)硬度測(cè)定 采用探頭直徑8 mm的GY-3型果實(shí)硬度計(jì)(浙江托普儀器有限公司)檢測(cè)‘槜李’去皮果實(shí)硬度。各處理組隨機(jī)抽取5個(gè)果實(shí)，去掉果實(shí)縫合線兩側(cè)最大橫徑處的外果皮，在該區(qū)域測(cè)量硬度值。單果重復(fù)檢測(cè)4次。

1.2.2 基因克隆 采用CTAB法[12]提取各處理組‘槜李’果肉組織總RNA，經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳和Onedrop OD-1000分光光度計(jì)(南京五義科技有限公司)檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度合格后，采用PrimeScriptTMReverse Transcriptase〔寶生物工程(大連)有限公司〕逆轉(zhuǎn)錄cDNA分別用于‘槜李’PsPG基因的克隆和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。具體操作見(jiàn)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。

以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)登錄的多種植物PG基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)，搜索并提取‘槜李’PG基因的可能序列，采用Primer Premier 5.0程序分別在序列的上游和下游設(shè)計(jì)并合成開(kāi)放閱讀框(ORF)驗(yàn)證引物。PsPG-F 的序列為 5′-TGGCGAACCGTAG AAGCCT-3′；PsPG-R 的序列為 5′-CTACAAACAA CTTGTAGGCTGAACC-3′。反應(yīng)體系包括10×PCR buffer 2.5 μL、25 mmol·L-1dNTPs mixture 2.0 μL、25 mmol·L-1MgCl21.5 μL、5 U·μL-1rTaq酶0.2 μL、10 μmol·L-1上游和下游引物各1.0 μL及模板cDNA 1.5 ng·μL-1，用ddH2O補(bǔ)足至終體積25.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s、56 ℃退火45 s、72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，然后利用AxyPrep DNA凝膠試劑盒〔愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司〕回收PCR產(chǎn)物，再將回收產(chǎn)物與pMD19-T Vector〔寶生物工程(大連)有限公司〕連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中做TA克隆，挑取單克隆菌落經(jīng)PCR(反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同上)驗(yàn)證后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。其中，MgCl2、dNTPs mixture和rTaq酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 將克隆的‘槜李’果實(shí)細(xì)胞壁降解相關(guān)基因的cDNA或氨基酸序列使用不同的網(wǎng)絡(luò)程序或本地軟件進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，即在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提交克隆序列，并運(yùn)行BLASTn查找同源序列(http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；再利用BioXM查找序列的最大開(kāi)放閱讀框并推導(dǎo)氨基酸序列；而后用pI/Mw tool(http：∥www.expasy.org/tools/pi_tool.html)、ProtParam(http：∥expasy.org/tools/protparam.html)和Kyte-Doolittle(http：∥fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；同時(shí)，用SMART預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，用GOR在線程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(http：∥smart.embl-heidelberg.de/)；利用DNAman 7.0進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)，利用MEGA 4.1[13]并運(yùn)用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，均用500次重復(fù)進(jìn)行bootstrap檢驗(yàn)，采用默認(rèn)的Poisson correction模型和Complete deletion選項(xiàng)。

1.2.4 基因表達(dá)分析 分別取各處理組‘槜李’果肉組織總RNA 1 μg，采用消除殘留DNA的試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser〔寶生物工程(大連)有限公司〕合成cDNA。

根據(jù)qRT-PCR引物設(shè)計(jì)原則及克隆獲得的‘槜李’PG基因，采用Beacon Designer 7.0設(shè)計(jì)并合成熒光定量特異引物；選取蛋白延伸因子(EF-2)作為看家基因。根據(jù)NCBI上已登錄的EF-2設(shè)計(jì)引物。PsPG-qF 的序列為 5′-ATCTGGTGTCACAATCCTC AACTC-3′，PsPG-qR的序列為5′-GCCTCTTCTTG CTCCTTGCC-3′；EF-2-qF的序列為5′-GGTGTGA CGATGAAGAGTGATG-3′，EF-2-qR的序列為5′-TGAAGGAGAGGGAAGGTGAAAG-3′。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

qRT-PCR反應(yīng)在Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System上進(jìn)行，反應(yīng)體系包括SYBR? Green qPCR Master Mix 10.0 μL、10 μmol·L-1上游和下游引物各0.3 μL及模板cDNA 1.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足至終體積20.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸43 s，40個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸5 min。溶解溫度設(shè)置為63 ℃～95 ℃?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法[14]進(jìn)行計(jì)算。為了使結(jié)果更直接化，將室溫貯藏條件下各采后貯藏時(shí)間‘槜李’PG基因的相對(duì)表達(dá)量作為其他3個(gè)處理組對(duì)應(yīng)采后貯藏時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量的參照，并將每個(gè)處理組“0”點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為“1”，高于或低于“1”分別表示上調(diào)或下調(diào)。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用EXCEL 2007、SPSS 22.0和Origin v10.2.1統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表制作。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’果實(shí)硬度的動(dòng)態(tài)變化

不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’果實(shí)硬度的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖1。由圖1可以看出：4個(gè)處理組‘槜李’果實(shí)的硬度均呈持續(xù)下降趨勢(shì)，且與采后貯藏時(shí)間呈線性負(fù)相關(guān)。其中，室溫貯藏(對(duì)照)條件下果實(shí)硬度下降最快，低溫貯藏條件下果實(shí)硬度下降較慢，1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理和減壓浸鈣處理?xiàng)l件下果實(shí)硬度下降速度居中。室溫貯藏條件下‘槜李’果實(shí)貯藏2 d，果實(shí)硬度急劇下降至0 kg·cm-2，即果實(shí)完全軟化；減壓浸鈣處理?xiàng)l件下果實(shí)貯藏4 d完全軟化；1-MCP處理和低溫貯藏條件下果實(shí)貯藏5 d完全軟化。

—●—： 室溫貯藏Room temperature storage； —○—： 低溫貯藏Low temperature storage； —▲—： 1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理1-methylcyclopropene (1-MCP) treatment； —△—： 減壓浸鈣處理 Immersed in Ca2+ solution with decompression treatment.圖1 不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’果實(shí)硬度的動(dòng)態(tài)變化Fig. 1 Dynamic change in fruit firmness of Prunus salicina ‘Zuili’ in different postharvest treatments and storage conditions

2.2 ‘槜李’PsPG基因的克隆及生物信息學(xué)分析

2.2.1PsPG基因的克隆 以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)登錄的多種植物PG基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)，克隆‘槜李’PG基因的cDNA序列，獲得該基因開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為1 134 bp，編碼377個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AG。NCBI比對(duì)結(jié)果顯示：該基因與Prunuspersica和PrunusarmeniacaLinn.的PG基因的相似度分別達(dá)到98%和97%，說(shuō)明獲得的cDNA序列為‘槜李’PsPG基因，GenBank登錄號(hào)KX149044。

2.2.2PsPG基因的生物信息學(xué)分析 運(yùn)用生物信息學(xué)在線軟件分析得出，‘槜李’PsPG蛋白的氨基酸總數(shù)為377。推導(dǎo)該蛋白質(zhì)的理論相對(duì)分子質(zhì)量為39 550，理論等電點(diǎn)pI 5.62。

應(yīng)用GOR在線程序預(yù)測(cè)PsPG蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由11.14%的α螺旋、31.03%的β折疊和57.82%的無(wú)規(guī)則卷曲組成，其中，無(wú)規(guī)則卷曲是該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組分。

‘槜李’PsPG基因與其他4種植物PG基因編碼的氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出：PsPG基因編碼的氨基酸序列含有果膠酸裂解酶3結(jié)構(gòu)域(pectate lyase 3 domain)和4個(gè)PbH1保守結(jié)構(gòu)域，其編碼的氨基酸序列與Prunuspersica、Prunusarmeniaca和西洋梨等果樹(shù)PG基因編碼的氨基酸序列相似度較高。

1： ‘槜李’Prunus salicina ‘Zuili’； 2： Prunus persica (Linn.) Batsch； 3： Prunus armeniaca Linn.； 4： 西洋梨Pyrus communis Linn.； 5： Solanum lycopersicum Linn.圖2 ‘槜李’PsPG基因與其他4種植物PG基因編碼的氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果Fig. 2 Alignment result of amino acid sequences encoded by PsPG gene from Prunus salicina ‘Zuili’ and PG genes from other four species

PsPG基因編碼的氨基酸序列與Prunuspersica的3個(gè)PG基因編碼的氨基酸序列(AAC64184、AAP21999和ABV32553)的相似度高達(dá)98%，與Prunusarmeniaca的2個(gè)PG基因編碼的氨基酸序列(ADT82706和AFD62267)的相似度在96%以上，與西洋梨的3個(gè)PG基因編碼的氨基酸序列(CAH18935、BAF42034和BAC22689)以及沙梨〔Pyruspyrifolia(Burm. f.) Nakai〕(AER27668)、Pyrus×bretschneideriRehd.(AGR44470)、甜橙〔Citrussinensis(Linn.) Osbeck〕(KDO51591)和葡萄(CAN78679)的PG基因編碼的氨基酸序列的相似度介于72%～79%之間。

基于‘槜李’PsPG基因與其他8種植物PG基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出：所選大部分植物的PG基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性?！畼椑睢疨sPG基因編碼的氨基酸序列與Prunuspersica(AAC64184)和Prunusarmeniaca(ADT82706)的PG基因編碼的氨基酸序列的親緣關(guān)系最近，與西洋梨(CAH18935)、沙梨(AER276668)和Pyrus×bretschneideri(AGR44470)的PG基因編碼的氨基酸序列的親緣關(guān)系也較近，與甜橙(KDO51591)、葡萄(CAN78679)和大桉(EucalyptusgrandisW. Hill ex Maiden)(KCW57484)的PG基因編碼的氨基酸序列的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

節(jié)點(diǎn)處數(shù)據(jù)表示自展值 Datums on the nodes indicate the bootstrap values. 1： ‘槜李’Prunus salicina ‘Zuili’； 2： Prunus persica (Linn.) Batsch； 3： 西洋梨Pyrus communis Linn.； 4： 沙梨Pyrus pyrifolia (Burm. f.) Nakai； 5： Prunus armeniaca Linn.； 6： Pyrus×bretschneideri Rehd.； 7： 甜橙Citrus sinensis (Linn.) Osbeck； 8： 大桉Eucalyptus grandis W. Hill ex Maiden； 9： 葡萄Vitis vinifera Linn.圖3 基于‘槜李’PsPG基因與其他8種植物PG基因編碼的氨基酸序列的系統(tǒng)樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of PsPG gene from Prunus salicina ‘Zuili’ and PG genes from other eight species

2.3 不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’PsPG基因的表達(dá)模式分析

不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示：低溫貯藏和減壓浸鈣處理?xiàng)l件下，‘槜李’PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量緩慢升高，貯藏5 d時(shí)達(dá)到最高值，隨后急劇降低(圖4-A，C)，且貯藏5 d時(shí)果實(shí)完全軟化，PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量分別約為同時(shí)期室溫貯藏條件下的30和60倍。1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理?xiàng)l件下，貯藏3 d時(shí)PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量急劇升高至最高值，隨后迅速降低(圖4-B)。

A： 低溫貯藏Low temperature storage； B： 1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理1-methylcyclopropene (1-MCP) treatment； C： 減壓浸鈣處理Immersed in Ca2+ solution with decompression treatment.圖4 不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expression of PsPG gene from Prunus salicina ‘Zuili’ in different postharvest treatments and storage conditions

3 討論和結(jié)論

3.1 PsPG蛋白的結(jié)構(gòu)域與果實(shí)軟化關(guān)系密切

‘槜李’PsPG基因中的果膠酸裂解酶3結(jié)構(gòu)域具有類果膠酸裂解酶的β螺旋，其與糖苷水解酶第28家族(glycoside hydrolase，family 28，GH28)密切相關(guān)，這些酶對(duì)細(xì)胞壁的代謝與降解具有重要作用。此外，在果膠酸裂解酶3結(jié)構(gòu)域內(nèi)還含有4個(gè)平行β螺旋重復(fù)(parallelβhelix repeats，PbH1)結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域是β片層垛疊區(qū)，可以形成較大的螺旋結(jié)構(gòu)，具有催化多糖水解的活性[15]。這說(shuō)明PsPG蛋白與果實(shí)軟化關(guān)系密切。

3.2 低溫有利于‘槜李’果實(shí)采后貯藏保鮮

目前，已有許多報(bào)道較為深入地研究了低溫脅迫對(duì)果實(shí)品質(zhì)和代謝的影響。首先，低溫使代謝過(guò)程中許多酶的活性減弱，并抑制乙烯的生物合成；其次，低溫能有效抑制微生物生長(zhǎng)，減少腐爛病發(fā)生。不同品種果實(shí)在不同溫度下的耐受能力不同。李(PrunussalicinaLinn.)、杏李(P.simoniiCarr.)和歐洲李(P.domesticaLinn.)部分品種在室溫條件下可貯藏20～30 d，在溫度4 ℃和空氣相對(duì)濕度90%～95%條件下貯藏時(shí)間可達(dá)50 d[16]；‘金太陽(yáng)’杏(Armeniacavulgaris‘Golden sun’)在溫度(0±1) ℃和空氣相對(duì)濕度90%～95%條件下可貯藏40～50 d，失重率僅為0.2%，可加工果率高達(dá)96%[17]；汪開(kāi)拓等[18]研究認(rèn)為，采用1 ℃貯藏楊梅〔Myricarubra(Lour.) Sieb. et Zucc.〕果實(shí)較5 ℃或10 ℃貯藏更為顯著地延緩了果實(shí)軟化，并降低了果實(shí)腐爛率，從而有效延長(zhǎng)了果實(shí)貯藏期。本研究中，低溫〔(4±1)℃〕貯藏條件下‘槜李’果實(shí)硬度的降幅較室溫〔(25±1)℃〕貯藏條件下明顯減小，說(shuō)明低溫貯藏有利于保持‘槜李’果實(shí)的商品品質(zhì)。此外，結(jié)合本研究中1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理和減壓浸鈣處理在抑制‘槜李’果實(shí)軟化相關(guān)基因的表達(dá)上的作用，推測(cè)在1-MCP處理或減壓浸鈣處理后采用低溫貯藏可進(jìn)一步延長(zhǎng)貨架期和保持良好的風(fēng)味品質(zhì)。

3.3 PsPG基因參與‘槜李’果實(shí)軟化過(guò)程

多聚半乳糖醛酸酶是植物體內(nèi)水解果膠物質(zhì)的基礎(chǔ)酶[19]，其基因的表達(dá)與果膠變性和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)[20]。研究結(jié)果表明：在不同種類果實(shí)軟化過(guò)程中，PG基因的表達(dá)增加，同時(shí)伴隨著果膠聚合物的變性和果實(shí)的軟化[10，20]。結(jié)合不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’果實(shí)硬度變化趨勢(shì)和PsPG基因表達(dá)模式推測(cè)，在果實(shí)完全軟化前，PsPG基因轉(zhuǎn)錄水平升高；當(dāng)果實(shí)完成軟化后，負(fù)反饋機(jī)制抑制該基因的進(jìn)一步表達(dá)，說(shuō)明PsPG基因參與了‘槜李’果實(shí)軟化的某些階段。

乙烯是一種內(nèi)源性的氣態(tài)植物激素，調(diào)控果實(shí)的發(fā)育進(jìn)程。Kyte等[21]在PG基因啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)乙烯應(yīng)答元件，PG基因的表達(dá)和內(nèi)源乙烯釋放量的增加在時(shí)間上有緊密相關(guān)性。1-MCP為乙烯受體抑制劑，能夠高效抑制內(nèi)源乙烯的釋放。本研究中，在1-MCP處理?xiàng)l件下，‘槜李’PsPG基因的表達(dá)模式與其果實(shí)硬度的下降趨勢(shì)相對(duì)應(yīng)，PsPG基因表達(dá)受抑制，果實(shí)硬度下降趨勢(shì)減緩，表明PsPG基因受乙烯調(diào)控參與‘槜李’果實(shí)軟化。在果實(shí)軟化初期，PsPG基因響應(yīng)乙烯信號(hào)，表達(dá)量升高，激活了多聚半乳糖醛酸酶活性促進(jìn)果實(shí)軟化；當(dāng)果實(shí)完全軟化后，不再需要多聚半乳糖醛酸酶發(fā)揮功能，乙烯信號(hào)減弱并協(xié)同負(fù)反饋機(jī)制阻斷PsPG基因進(jìn)一步表達(dá)。但具體響應(yīng)機(jī)制仍需RNAi技術(shù)結(jié)合目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)一步深入闡明。

鈣是果樹(shù)必不可缺的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，也是一種多功能的細(xì)胞信號(hào)分子，其在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著極其重要的作用。而在果實(shí)軟化方面，Silveira等[22]研究認(rèn)為，外源補(bǔ)鈣主要是增加組織中自由鈣離子(Ca2+)和結(jié)合鈣含量，促進(jìn)Ca2+與果膠的相互交鏈，減少細(xì)胞內(nèi)酶通過(guò)細(xì)胞壁與底物接觸的機(jī)會(huì)，從而有效地減緩果實(shí)的軟化。在本研究中，采用減壓浸鈣處理和低溫處理一方面延緩了‘槜李’PsPG基因表達(dá)，另一方面明顯提高了PsPG基因的表達(dá)水平，由此推測(cè)，PsPG基因不僅參與了‘槜李’果實(shí)軟化過(guò)程，同時(shí)能響應(yīng)Ca2+和低溫誘導(dǎo)參與其他重要生化過(guò)程。其原因可能是，Ca2+通過(guò)誘導(dǎo)果實(shí)中PsPG基因大量表達(dá)，激活了果實(shí)內(nèi)多聚半乳糖醛酸酶活性，從而增加了其與底物的接觸機(jī)會(huì)，完成果實(shí)軟化過(guò)程。另外，PsPG基因表達(dá)上升階段主要發(fā)生在‘槜李’果實(shí)快速軟化階段，說(shuō)明多聚半乳糖醛酸酶是參與果實(shí)軟化的誘導(dǎo)酶，而非啟動(dòng)酶。

3.4 結(jié)論

綜合研究結(jié)果顯示：‘槜李’果實(shí)在貯藏過(guò)程中，果實(shí)硬度呈下降趨勢(shì)，1-MCP處理、減壓浸鈣處理和低溫貯藏可以明顯延緩果實(shí)硬度下降。PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，PsPG基因可受到1-MCP的抑制，并能夠明顯響應(yīng)Ca2+誘導(dǎo)。低溫貯藏是‘槜李’果實(shí)采后品質(zhì)保鮮的有效手段，可以抑制PsPG基因的表達(dá)以延緩果實(shí)軟化過(guò)程。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示‘槜李’果實(shí)貯藏和軟化機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

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CloningandexpressionanalysisonfruitsofteningrelatedgenePsPGfromPrunussalicina‘Zuili’

WANG Gang， JIA Zhanhui， ZHANG Jiyu， JIA Xiaodong， WANG Tao， WENG Wenxin， XUAN Jiping①， GUO Zhongren①

(Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210014， China)，J.PlantResour. &Environ.， 2017，26(4)： 60-66

Dynamic changes in fruit firmness ofPrunussalicina‘Zuili’ in the conditions of room temperature 〔(25±1) ℃〕 storage， low temperature 〔(4±1) ℃〕 storage， 1-methylcyclopropene (1-MCP) treatment， and immersed in Ca2+solution with decompression treatment were studied， polygalacturonase gene (PsPG) fromP.salicina‘Zuili’ was cloned， and its bioinformatics and expression were analyzed. The results show that low temperature storage， 1-MCP treatment， and immersed in Ca2+solution with decompression treatment can effectively retard the decrease of fruit firmness ofP.salicina‘Zuili’. The length of open reading frame (ORF) ofPsPGgene fromP.salicina‘Zuili’ is 1 134 bp， which encodes 377 amino acids. The secondary structure of PsPG protein includes 11.14% ofαhelix， 31.03% ofβsheet， and 57.82% of random coil. The result of bioinformatics analysis shows that PsPG protein has pectate lyase 3 domain and four PbH1 domains； the relationships among amino acid sequences encoded byPsPGgene andPGgenes fromPrunuspersica(Linn.) Batsch andPrunusarmeniacaLinn. are close， with similarity more than 96%. The result of qRT-PCR analysis shows that with prolonging of postharvest storage time， all relative expressions ofPsPGgene increase firstly and then decrease in the conditions of low temperature storage， 1-MCP treatment， and immersed in Ca2+solution with decompression treatment， and reach the peak value when stored for 5， 3， and 5 d， respectively. It is suggested thatPsPGgene fromP.salicina‘Zuili’ has a close relationship with its fruit softening， low temperature storage is effective measure to retain freshness of fruit ofP.salicina‘Zuili’ after harvest， which can inhibit expression ofPsPGgene to postpone fruit softening.

Prunussalicina‘Zuili’；PsPGgene； cloning； gene expression； fruit softening

Q943.2； S662.3

A

1674-7895(2017)04-0060-07

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.04.08

2017-03-23

國(guó)家科學(xué)技術(shù)部“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD16B04)

王 剛(1984—)，男，山西興縣人，博士，助理研究員，主要從事果樹(shù)遺傳育種方面的研究。

①通信作者E-mail： xuanjiping@cnbg.net； zhongrenguo@cnbg.net

張明霞)