不同類型枇杷葉三萜酸類成分含量及降糖活性的比較

吳月嫻， 呂 寒， 簡暾昱， 陳 劍， 馬 麗， 任冰如， 李維林

〔江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省抗糖尿病藥物篩選技術(shù)服務(wù)中心， 江蘇 南京 210014〕

不同類型枇杷葉三萜酸類成分含量及降糖活性的比較

吳月嫻， 呂 寒， 簡暾昱， 陳 劍， 馬 麗， 任冰如， 李維林①

〔江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省抗糖尿病藥物篩選技術(shù)服務(wù)中心， 江蘇 南京 210014〕

枇杷葉； 成熟葉； 落葉； HPLC-ELSD； 三萜酸類成分；α-葡萄糖苷酶

枇杷葉又名巴葉、蘆桔葉，為薔薇科(Rosaceae)枇杷屬(EriobotryaLindl.)常綠小喬木枇杷〔E.japonica(Thunb.) Lindl.〕的干燥葉，主產(chǎn)于江蘇、浙江、安徽、江西、福建等地，為中國傳統(tǒng)民間中草藥，味苦，性微寒，具有清肺止咳、降逆止嘔的作用[1]204，主要用于治療呼吸系統(tǒng)疾病[2]和糖尿病[3-5]等疾病。枇杷葉含有三萜酸類[6-7]、黃酮類[8]及倍半萜類[9]等成分，其中，三萜酸類為主要活性成分。

在實際生產(chǎn)中，枇杷的成熟葉和落葉均可炮制為枇杷葉中藥材。呂寒等[10]認為，枇杷葉的三萜酸類成分總含量在11月份最高。鑒于此，以11月份采自江蘇蘇州西山島的枇杷成熟葉和落葉為實驗材料，分別對2種枇杷葉生品和炮制品的總灰分和浸出物含量進行比較，并采用HPLC-ELSD法對其三萜酸類成分含量進行比較，同時，還比較了枇杷成熟葉和落葉生品和炮制品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以期為采收優(yōu)質(zhì)枇杷葉提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的枇杷成熟葉和落葉均于2015年11月采自江蘇蘇州西山島，經(jīng)江蘇省中國科學院植物研究所李維林研究員鑒定。將葉片洗凈，曬干，切絲，備用。分別取成熟葉和落葉500 g，加入125 g蜂蜜，拌勻，文火炒制10 min后，置于60 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，備用。

主要儀器包括EL204萬分之一電子天平〔梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司〕、UltiMate-3000液相色譜儀(戴安中國有限公司)、3300蒸發(fā)光散射檢測器(美國Alltech公司)、5810R多功能臺式離心機(德國Eppendorf公司)和SpectraMax Plus384光吸收酶標儀(美國Molecular Devices公司)。使用的蜂蜜購自南京老山藥業(yè)股份有限公司；α-葡萄糖苷酶(批號050M7415)購自美國Sigma-Aldrich公司；對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG，批號H1425007)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿卡波糖(批號BJ13634)購自德國Bayer公司；乙醇和乙酸銨為分析純；乙腈和甲醇為色譜純；齊墩果酸(批號0809-9803)和熊果酸(批號110742-200516)購自中國食品藥品檢定研究院；薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸和科羅索酸為實驗室自制(純度高于98.0%)。

1.2 方法

1.2.1 總灰分和浸出物含量測定 將供試葉片粉碎，過60目篩，采用文獻[11]204中的方法測定總灰分含量，采用熱浸法[11]202測定浸出物含量，各指標重復(fù)取樣測定3次。

1.2.2 HPLC-ELSD分析條件 色譜柱：Acclaim 120 C18(150 mm×4.6 mm， 5.0 μm)；流速1.0 mL·min-1；柱溫 25 ℃；進樣量10 μL。流動相A為乙腈、流動相B為體積分數(shù)0.5%乙酸銨，梯度洗脫流程：0～5 min，50%A；5～23 min，50%～54%A；23～48 min，54%～90%A；48～50 min，90%～100%A。漂移管溫度70 ℃，載氣為N2，體積流量1.5 L·min-1。

1.2.3 對照品溶液配制及標準曲線繪制 精密稱取薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸對照品，用甲醇分別配制成質(zhì)量濃度為0.533 3、0.516 7、0.550 0、0.633 3、0.633 3和0.666 7 mg·mL-1的對照品溶液；取各對照品溶液0.1 mL，混勻，配成對照品混合溶液。

精密吸取對照品混合溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，用甲醇補足至1.0 mL，按照上述分析條件進樣20 μL，以峰面積為縱坐標y、對照品質(zhì)量為橫坐標x繪制標準曲線。其中，薔薇酸質(zhì)量與峰面積的線性回歸方程為y=3.6×106x-350 853(r=0.999 9)，線性范圍為1.06～10.60 μg；委陵菜酸質(zhì)量與峰面積的線性回歸方程為y=3.7×106x-292 805(r=0.999 9)，線性范圍為1.03～10.30 μg；科羅索酸質(zhì)量與峰面積的線性回歸方程為y=6.9×106x-1 028 520(r=0.999 3)，線性范圍為1.10～11.00 μg；馬斯里酸質(zhì)量與峰面積的線性回歸方程為y=5.9×106x-696 036(r=0.999 5)，線性范圍為1.27～12.70 μg；齊墩果酸質(zhì)量與峰面積的線性回歸方程為y=3.3×106x-146 324(r=0.999 1)，線性范圍為0.63～6.30 μg；熊果酸質(zhì)量與峰面積的線性回歸方程為y=4.4×106x-866 373(r=0.999 7)，線性范圍為1.33～13.33 μg。

1.2.4 供試品溶液提取及測定 取樣品粉末約2.0 g，精密稱量后，加入體積分數(shù)80%乙醇100.0 mL；稱量后，加熱回流提取2 h；冷卻，用體積分數(shù)80%乙醇補足質(zhì)量；過濾，量取濾液50.0 mL，減壓濃縮后用甲醇定容至20.0 mL；用微孔濾膜(孔徑0.45 μm)過濾，濾液即供試品溶液。按照上述分析條件進行檢測，進樣量10 μL。每種樣品3份，每份樣品測定3次。

1.2.5 方法學考察 精密吸取對照品混合溶液10 μL，按照上述分析條件重復(fù)進樣6次，峰面積RSD值分別為1.34%、0.96%、1.53%、1.64%、0.65%和1.01%，表明儀器精密度良好。

取落葉生品的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12和24 h按照上述分析條件進樣，24 h內(nèi)薔薇酸、委陵菜酸、科羅索酸、馬斯里酸、齊墩果酸和熊果酸的峰面積RSD值分別為1.04%、1.68%、0.69%、0.64%、0.91%和0.21%，表明這6種三萜酸類成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

分別稱取落葉生品6份，采用前述方法制備供試品溶液，并按照上述分析條件進樣，薔薇酸、委陵菜酸、科羅索酸、馬斯里酸、齊墩果酸和熊果酸的峰面積RSD值分別為0.54%、1.21%、1.76%、0.91%、1.04%和1.43%，表明該方法重復(fù)性較好。

稱取約1.0 g已知三萜酸類成分含量的樣品粉末9份，平均分成3組，每組視為1個重復(fù)。精密稱量后，分別加入薔薇酸對照品溶液2.4、3.0和3.6 mL，委陵菜酸對照品溶液3.7、4.7和5.6 mL，科羅索酸對照品溶液1.6、2.0和2.4 mL，馬斯里酸對照品溶液4.4、5.5和6.6 mL，齊墩果酸對照品溶液0.7、0.9和1.1 mL，熊果酸對照品溶液9.0、11.2和13.4 mL，采用前述方法制備供試品溶液，并按照上述分析條件進樣，薔薇酸、委陵菜酸、科羅索酸、馬斯里酸、齊墩果酸和熊果酸的加樣回收率分別為98.83%、99.07%、98.95%、99.44%、98.20%和100.28%，加樣回收率RSD值分別為0.27%、0.67%、1.54%、0.45%、1.14%和1.04%。

1.2.6α-葡萄糖苷酶活性抑制實驗 在96孔板中依次加入α-葡萄糖苷酶2 μL、磷酸鹽緩沖液(67 mmol·L-1，pH 6.8)78 μL，37 ℃保溫10 min；加入0.1 mmol·L-1pNPG 20 μL，37 ℃保溫10 min；測定波長405 nm處吸光度(A0)。用等體積磷酸鹽緩沖液代替α-葡萄糖苷酶，測定波長405 nm處吸光度(A0′)。

在反應(yīng)孔中依次加入α-葡萄糖苷酶2 μL、磷酸鹽緩沖液77 μL、供試品溶液或阿卡波糖1 μL，37 ℃保溫10 min；加入0.1 mmol·L-1pNPG 20 μL，37 ℃保溫10 min；測定波長405 nm處吸光度(A1)。用等體積磷酸鹽緩沖液代替供試品溶液，測定波長405 nm處吸光度(A1′)。每個供試品溶液重復(fù)檢測3次。

根據(jù)公式“抑制率=〔1-(A1-A1′)/(A0-A0′)〕×100%”計算供試品溶液對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，并計算其半抑制濃度(IC50)值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 6軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同類型枇杷葉總灰分和浸出物含量的比較

檢測結(jié)果表明：枇杷成熟葉和落葉生品的總灰分含量分別為(6.840±0.195)%和(7.963±0.261)%，炮制品的總灰分含量分別為(6.330±0.154)%和(6.887±0.156)%；并且，炮制品的總灰分含量顯著(P<0.05)低于生品，落葉的總灰分含量顯著高于成熟葉。枇杷成熟葉和落葉生品的浸出物含量分別為(22.37±0.50)%和(19.83±0.31)%，炮制品的浸出物含量分別為(28.57±0.87)%和(25.40±0.60)%；并且，炮制品的浸出物含量顯著高于生品，落葉的浸出物含量顯著低于成熟葉。

2.2 不同類型枇杷葉三萜酸類成分含量的比較

檢測結(jié)果(表1)表明：4個類型枇杷葉的三萜酸類成分含量均以熊果酸最高、齊墩果酸最低。落葉的6種三萜酸類成分含量總體顯著(P<0.05)高于成熟葉；成熟葉炮制品的委陵菜酸、科羅索酸和馬斯里酸含量以及落葉炮制品的6種三萜酸類成分含量低于或顯著低于各自生品，而成熟葉炮制品的薔薇酸、齊墩果酸和熊果酸含量則高于或顯著高于其生品。

由表1還可見：三萜酸類成分總含量在落葉生品中最高，在落葉炮制品中較高，在成熟葉炮制品中較低，在成熟葉生品中最低；并且，落葉的三萜酸類成分總含量顯著高于成熟葉，成熟葉炮制品的三萜酸類成分總含量略高于其生品，而落葉炮制品的三萜酸類成分總含量卻顯著低于其生品。

材料2)Sample2)三萜酸類成分含量/% Contentoftriterpenoidacidcomponents薔薇酸Euscaphicacid委陵菜酸Tormenticacid科羅索酸Corosolicacid馬斯里酸Maslinicacid齊墩果酸Oleanolicacid熊果酸Ursolicacid總計TotalL10.1629±0.0098a0.2417±0.0106a0.1138±0.0036a0.3482±0.0102b0.0554±0.0012a0.7472±0.0119a1.6710±0.0096aL20.2032±0.0049b0.2222±0.0122a0.1026±0.0117a0.2655±0.0093a0.0592±0.0019a0.8165±0.0152b1.6900±0.0264aL30.6450±0.0048d1.0646±0.0348c0.3635±0.0139c0.4630±0.0059d0.0942±0.0046c1.1436±0.0086c3.7741±0.0343cL40.4830±0.0121c0.7544±0.0018b0.2543±0.0107b0.3867±0.0020c0.0747±0.0011b0.8042±0.0132b2.7175±0.0130b

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)L1： 成熟葉生品 Crude product of mature leaves； L2： 成熟葉炮制品 Processed product of mature leaves； L3： 落葉生品 Crude product of fallen leaves； L4： 落葉炮制品 Processed product of fallen leaves.

2.3 不同類型枇杷葉對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的比較

檢測結(jié)果表明：阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度(IC50)為(560.000±0.021) μg·mL-1；4個類型枇杷葉對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用顯著(P<0.05)優(yōu)于阿卡波糖，且彼此間的抑制作用差異顯著。其中，落葉生品對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用最強，其IC50值為(64.170±0.021) μg·mL-1；然后依次為成熟葉生品、落葉炮制品和成熟葉炮制品，其IC50值分別為(86.160±0.026)、(106.200±0.025)和(122.600±0.023) μg·mL-1。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：枇杷成熟葉和落葉生品及炮制品的總灰分和浸出物含量均符合《中華人民共和國藥典》[1]204中關(guān)于枇杷葉中藥材的有關(guān)標準；不同類型枇杷葉的三萜酸類成分含量存在一定差異，并且，落葉的三萜酸類成分含量總體上顯著高于成熟葉，這可能與枇杷葉三萜酸類成分的積累隨葉片發(fā)育進程不斷增大有關(guān)。齊墩果酸和熊果酸總含量是《中華人民共和國藥典》[1]205中規(guī)定的枇杷葉有效成分的質(zhì)控指標，根據(jù)本研究結(jié)果落葉的有效成分優(yōu)于成熟葉。另外，落葉的三萜酸類成分含量高于成熟葉，且對α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果優(yōu)于成熟葉，表明枇杷葉的藥理活性與三萜酸類成分含量有關(guān)。綜上所述，落葉是枇杷葉作為降血糖中藥材的首選。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典： 2015版(一部)[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015.

[2] 王立為， 劉新民， 余世春， 等. 枇杷葉抗炎和止咳作用研究[J]. 中草藥， 2004， 35(2)： 174-176.

[3] Lü H， CHEN J， LI W L， et al. Hypoglycemic and hypolipidemic effects of the total triterpene acid fraction from Folium Eriobotryae[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2009， 122： 486-491.

[4] 謝筱琳， 鐘 穎. 枇杷葉乙醇提取物降血糖的實驗研究[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報， 2009， 15(5)： 93-94.

[5] CHEN J， LI W L， WU J L， et al. Hypoglycemic effects of a sesquiterpene glycoside isolated from leaves of loquat (Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.)[J]. Phytomedicine， 2008， 15： 98-102.

[6] 任冰如， 陳智坤， 陳 劍， 等. 蘇州西山島產(chǎn)枇杷葉的藥材品質(zhì)分析[J]. 植物資源與環(huán)境學報， 2014， 23(2)： 119-120.

[7] 呂 寒， 陳 劍， 李維林， 等. 枇杷葉中三萜酸類成分的提取工藝研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2007， 18(11)： 2791-2792.

[8] 呂 寒， 于 盱， 陳 劍， 等. 枇杷葉黃酮類化學成分研究[J]. 中成藥， 2014， 36(2)： 329-332.

[9] 趙 磊， 陳 劍， 印 敏， 等. UPLC-Q-TOF-MS法分析枇杷葉的倍半萜苷類化合物[J]. 中成藥， 2015， 37(7)： 1498-1502.

[10] 呂 寒， 習超鵬， 陳 劍， 等. 不同生長季節(jié)枇杷葉中三萜酸成分的含量變化[J]. 中國中藥雜志， 2009， 34(18)：2353-2355.

[11] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典： 2015版(四部)[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015.

ComparisonsoncontentsoftriterpenoidacidcomponentsandhypoglycemicactivityindifferenttypesofEriobotryajaponicaleaves

WU Yuexian， LYU Han， JIAN Tunyu， CHEN Jian， MA Li， REN Bingru， LI Weilin①

(Jiangsu Provincial Service Center for Anti-diabetic Drugs Screening， Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210014， China)，J.PlantResour. &Environ.， 2017，26(4)： 101-103

To select Chinese medicineEriobotryajaponica(Thunb.) Lindl. leaves with high hypoglycemic activity， contents of total ashes， extracts and triterpenoid acid components in crude and processed products of mature leaves and fallen leaves ofE.japonicafrom Xishan Island in Suzhou of Jiangsu in November were compared， and their ability to inhibitα-glucosidase activity was also compared. The results show that contents of total ashes and extracts in different types ofE.japonicaleaves are in accord with related criteria. Contents of each triterpenoid acid component in fallen leaves are significantly higher than those in mature leaves in general， and total contents of triterpenoid acid components in crude and processed products of mature leaves， and crude and processed products of fallen leaves are 1.671 0%， 1.690 0%， 3.774 1%， and 2.717 5%， respectively.α-glucosidase inhibitory activity of different types ofE.japonicaleaves is significantly higher than that of acarbose， in which， half-inhibitory concentration (IC50) of crude product of fallen leaves is the lowest with only 64.170 μg·mL-1. In conclusion， fallen leaves are the optimum choice for takingE.japonicaleaves as hypoglycemic Chinese medicine.

Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl. leaf； mature leaf； fallen leaf； HPLC-ELSD； triterpenoid acid component；α-glucosidase

Q946.8； R284.2； S567.1+9

A

1674-7895(2017)04-0101-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.04.13

2017-04-14

江蘇省重點研發(fā)計劃-社會發(fā)展面上項目(BE2015690)； 江蘇省科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計劃-科技公共服務(wù)平臺項目(BM2011117)

吳月嫻(1993—)，女，江蘇揚州人，碩士研究生，主要從事植物天然產(chǎn)物化學方面的研究。

①通信作者E-mail： lwlcnbg@cnbg.net

佟金鳳)