二次諧波顯微成像技術(shù)

郝淑娟+崔海瑛+何巍巍+邱忠陽+丁軍榮

摘要：二次諧波顯微成像技術(shù)是一種新型的非線性光學(xué)成像方法，在生物醫(yī)學(xué)成像、新型材料科學(xué)等領(lǐng)域都有十分廣泛的應(yīng)用。本文介紹了光學(xué)二次諧波顯微成像的產(chǎn)生原理、主要特點(diǎn)和其技術(shù)發(fā)展應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：二次諧波；顯微成像；應(yīng)用

中圖分類號：G712 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2017）52-0194-02

微觀世界的很多有用信息可以通過采用顯微技術(shù)獲得，顯微成像技術(shù)在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)測量等不同領(lǐng)域有著巨大的研究價值和廣泛的應(yīng)用，因此，顯微成像技術(shù)一直是人們研究的熱點(diǎn)。非光學(xué)顯微術(shù)，如電子顯微技術(shù)、掃描隧道顯微技術(shù)等，存在對觀察樣品環(huán)境要求嚴(yán)格、對觀察對象造成傷害、對觀察樣品限制較多等弱點(diǎn)，而光學(xué)顯微術(shù)沒有這些弱點(diǎn)缺陷，因此，光學(xué)顯微術(shù)的發(fā)展完善和功能拓展具有重要意義。近年來，計算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)和精密機(jī)械電子等技術(shù)得到飛速發(fā)展，隨著這些技術(shù)的提高，出現(xiàn)了激光共焦掃描顯微成像技術(shù)、雙光子激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù)、光學(xué)相干層析成像等很多種不同功能和特性的現(xiàn)代光學(xué)顯微術(shù)。二次諧波顯微成像技術(shù)是其中的一種現(xiàn)代非線性光學(xué)顯微術(shù)，它利用光與物質(zhì)相互作用時產(chǎn)生的二次諧波信號進(jìn)行顯微成像或探測。

一、二次諧波顯微成像原理

在非線性光學(xué)過程中，在強(qiáng)激光作用下的非線性介質(zhì)，其電極化強(qiáng)度與激發(fā)光場的關(guān)系可以表示為[1]：

二次諧波產(chǎn)生過程是和頻過程的一種特殊情況，即倍頻。倍頻效應(yīng)是指兩個頻率相同的入射光發(fā)生和頻作用，其輸出光波的頻率為入射光場頻率的二倍，其中入射光波稱為基頻，輸出倍頻光波稱為二次諧波。相應(yīng)的極化強(qiáng)度為：

二次諧波產(chǎn)生過程也可以看作是不同頻率光子的交換過程。兩個頻率為ω的光子在諧波產(chǎn)生過程中湮滅，同時生成一個新的光子，頻率為2ω。

二次諧波產(chǎn)生需要滿足兩個條件：一是要求介質(zhì)要具有非中心對稱性。在電偶極子近似下，具有中心對稱性的介質(zhì)，其二階電極化率張量為零，則不能產(chǎn)生二次諧波信號。二是要求滿足相位匹配條件。相位匹配直接決定一個非線性光學(xué)過程的效率。如果二次諧波產(chǎn)生過程中完全滿足相位匹配條件，則傳播中的倍頻光波和不斷產(chǎn)生的倍頻極化波之間保持相位的一致性，相互干涉，產(chǎn)生的二次諧波強(qiáng)度由零開始逐漸增大，直至基頻波的功率完全轉(zhuǎn)為二次諧波的功率，獲得最大的二次諧波輸出功率。

二次諧波顯微成像裝置由四個部分組成：第一部分是光源，通常需要提供功率適中的激發(fā)光，既可以保證產(chǎn)生較強(qiáng)的二次諧波信號，也可以避免樣品受損。在二次諧波顯微技術(shù)中光源通常采用可在整個紅外區(qū)內(nèi)可調(diào)諧的摻鈦藍(lán)寶石飛秒激光器。第二部分是物鏡，可以減小激發(fā)光的激發(fā)區(qū)域，并收集樣品產(chǎn)生的非軸向輻射的二次諧波信號，避免能量損失。通常采用數(shù)值孔徑足夠大的物鏡。第三部分是濾光片組，可保證收集到的信號為二次諧波信號，過濾干擾信號。在前向探測模式中，通常采用短通濾光片和窄帶濾光片，在背向探測模式中，通常采用窄帶濾光片。第四部分為信號探測系統(tǒng)，可以進(jìn)行二次諧波信號的收集探測。通常采用高靈敏度的PMT探測器，或與激發(fā)光源同步的信噪比高的鎖相放大器。

二、二次諧波顯微成像技術(shù)特點(diǎn)

不同于其他的現(xiàn)代光學(xué)顯微成像技術(shù)，二次諧波顯微成像技術(shù)由于利于樣品的非線性特性產(chǎn)生的二次諧波信號進(jìn)行成像和探測，因此，具有以下主要特點(diǎn)：

1.傳統(tǒng)的激光共焦顯微鏡采用共焦小孔成像，二次諧波顯微成像產(chǎn)生的信號光由于非線性效應(yīng)的強(qiáng)局域特性被局限在焦點(diǎn)附近很小的區(qū)域里，在成像過程中非焦點(diǎn)區(qū)域發(fā)光對測量結(jié)果的影響大大減小，因此，它不采用共焦小孔就可以實現(xiàn)高分辨率成像，還具有較高的信噪比，具有較高的三維空間分辨率，并且可以對具有一定厚度的樣品進(jìn)行層析成像。

2.在二次諧波顯微成像技術(shù)中，通常激發(fā)光源采用近紅外的飛秒激光器，這樣減小了對生物樣品的光損傷，降低了光漂泊，增加了樣品的穿透深度。

3.二次諧波信號是樣品的原發(fā)性信號，成像過程不需要使用染料進(jìn)行染色，這樣避免了光化學(xué)毒性及染色過程中的物理損傷，沒有染色過程也使該技術(shù)可用于很多被測樣品不能進(jìn)行熒光標(biāo)記的成像探測。

4.利用二次諧波信號進(jìn)行成像或探測時，二次諧波信號的相干性使其對樣品局部微觀結(jié)構(gòu)具有較高的敏感性，因此探測到的二次諧波信號不僅能反映與樣品有關(guān)的強(qiáng)度信息，還可以反映樣品的分子取向、排列方式等局部微觀結(jié)構(gòu)，這些重要而本質(zhì)的信息可以通過分析信號的角度分布或偏振特性等得到。

5.二次諧波顯微鏡雖未商品化，但雙光子熒光顯微系統(tǒng)已經(jīng)商品化，二次諧波成像顯微鏡可以很容易地在其基礎(chǔ)上經(jīng)過簡單改造獲得，如通過更換濾光片改造而成，耗費(fèi)較小。

6.二次諧波成像顯微鏡可以收集背向信號，可以和其他的成像技術(shù)進(jìn)行同時探測，如雙光子熒光顯微鏡、光學(xué)相干層析成像，實現(xiàn)多通道顯微成像或探測，更加有利于進(jìn)行成像結(jié)果對比研究，實現(xiàn)信號互補(bǔ)。

三、二次諧波顯微成像技術(shù)的應(yīng)用

在生命科學(xué)領(lǐng)域，二次諧波顯微成像技術(shù)由于其無光損傷、無光毒性、無光漂白等特點(diǎn)，在生物組織成像中有廣泛的應(yīng)用。研究表明，一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白、肌動球蛋白復(fù)合、微管蛋白等，都具有很強(qiáng)的二次諧波信號，不同的膠原蛋白類型在同等激發(fā)條件下，呈現(xiàn)不同的二次諧波信號強(qiáng)度，因此二次諧波顯微成像技術(shù)可以用于生物組織的結(jié)構(gòu)蛋白成像。生物細(xì)胞和組織成像也可以通過二次諧波顯微成像技術(shù)實現(xiàn)，Shi-Wei Chu等人曾用此技術(shù)觀察到了斑馬魚體內(nèi)細(xì)胞分芽繁殖、原腸胚的形成、組織的形成等晶胚發(fā)育過程[2]。Andrew等人用苯乙烯基染劑產(chǎn)生二次諧波信號，研究發(fā)現(xiàn)其對膜電壓的敏感度達(dá)到40/100mV。二次諧波成像可以實現(xiàn)膜之間分離距離的測量，測量的精度比其他顯微鏡都高。不僅如此，根據(jù)二次諧波信號對分子分布的對稱性的依賴，可以實時觀察膜上分子的動力學(xué)變化規(guī)律，這比通常使用的核磁共振更加方便快捷。因此二次諧波顯微技術(shù)在膜成像和動態(tài)測量中有重要的應(yīng)用[3]。另外，二次諧波顯微成像可以對基因組DNA溶液、細(xì)胞核提取物、培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核等不同DNA樣品進(jìn)行檢測，獲取DNA樣品的二次諧波信號并進(jìn)行高解析度成像[4]。

在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，二次諧波顯微成像技術(shù)在腫瘤、皮膚科、牙科等研究方向都有廣泛的應(yīng)用。二次諧波顯微成像技術(shù)能探測到子宮頸、口腔、食道、耳朵、鼻子等處的粘膜組織的病變，為腫瘤的診斷和分析提供了一份很好的參考，在癌癥的早期診斷中能起到一定的作用。另外，通過二次諧波顯微成像可以實現(xiàn)藥物通透性的活體監(jiān)控。二次諧波顯微成像技術(shù)可以實現(xiàn)牙齒的成像，為牙科提供了一種新的光學(xué)診斷方法。此外，該技術(shù)還可以在不損傷角膜的情況下觀察到角膜的結(jié)構(gòu)，以及實現(xiàn)對眼底視網(wǎng)膜的成像研究。

在材料科學(xué)領(lǐng)域，二次諧波顯微成像技術(shù)在納米材料方向中也有廣泛的應(yīng)用。二次諧波顯微成像技術(shù)可以對單個有機(jī)納米晶體的取向進(jìn)行探測，從而判斷納米晶體的晶體類型，也可以通過分析二次諧波信號的偏振特性來分析氧化鋅薄膜的結(jié)晶品質(zhì)和晶體生長取向，還可以通過偏振分析和離焦成像的方法獲得單個KTP納米粒子的三維取向信息和晶軸的歐拉角[5]。對于中心對稱材料，其表面由于對稱性遭到破壞而可以產(chǎn)生表面二次諧波信號，不僅能反映各向同性媒質(zhì)屬性，還可以反映長程有序材料的晶體結(jié)構(gòu)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Boyd R W.Nonlinear Optics.Boston：Academic，1992.

[2]Chu Shi wei，Chen Szu Yu，Tsung Han Tsai，等.非侵入性的多次諧波顯微法用于活體發(fā)育生物學(xué)研究[J].光學(xué)快報：英文版，2003，11（23）.

[3]莊正飛.二次諧波顯微成像及其在前列腺組織中的應(yīng)用[D].華南師范大學(xué)，2007.

[4]羅冬梅，鄧小元，卓雙木，譚淑雯，莊正飛，金鷹.腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生的非線性光譜學(xué)成像[J].光譜學(xué)與光譜分析，2012，（3）.

[5]王琳瑞.二次諧波顯微術(shù)的尺寸特性和取向探測研究[D].南開大學(xué)，2010.