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    基于骨架化模型的染色體形態(tài)表征

    2017-12-26 08:26:48王一鳴
    關(guān)鍵詞:著絲粒二值毛刺

    高 明, 王 婷, 王一鳴, 田 寧

    (沈陽師范大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 沈陽 110034)

    材料科學(xué)

    基于骨架化模型的染色體形態(tài)表征

    高 明, 王 婷, 王一鳴, 田 寧

    (沈陽師范大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 沈陽 110034)

    染色體作為遺傳物質(zhì)的重要載體,其空間構(gòu)象(主要指染色體數(shù)量、結(jié)構(gòu)、定位等形態(tài)信息)與包括基因表達(dá)、表觀遺傳在內(nèi)的一些基本的細(xì)胞生命活動(dòng)關(guān)聯(lián)緊密。染色體形態(tài)改變是引起人類某些重大疾病(如唐氏綜合癥、惡性腫瘤等)的重要原因之一。為實(shí)現(xiàn)染色體形態(tài)的準(zhǔn)確、量化分析,針對光學(xué)成像設(shè)備采集染色體圖像含冗雜信息過多的問題,基于骨架化理論,通過二值轉(zhuǎn)換及距離變換等計(jì)算方法,抽取染色體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),以減少冗余信息。進(jìn)一步,提出利用骨架長度、端粒數(shù)目及著絲粒分界比,數(shù)字化表征染色體的拓?fù)湫螒B(tài)。因此,利用自動(dòng)化手段建立了一種量化表征染色體形態(tài)信息的方法,這將為染色體識(shí)別及形態(tài)研究提供重要思路。

    骨架化; 染色體; 拓?fù)湫螒B(tài)

    0 引 言

    染色體作為遺傳物質(zhì)的重要載體,其生物形態(tài)與表觀修飾,遺傳與變異,及重大疾病的產(chǎn)生關(guān)聯(lián)緊密[1-3]。染色體形態(tài)主要通過熒光標(biāo)記技術(shù)(如熒光原位雜交)結(jié)合光學(xué)成像技術(shù)而獲得[4-5]。并通過染色體圖像的體積、表面積、形狀等幾何指標(biāo)來表征染色體的生物形態(tài)[2]。這些幾何指標(biāo)只是一種半定量的形態(tài)表征手段,它們的精確度往往受到光學(xué)成像技術(shù)分辨率的限制。因此需要更完善的方法來全面表征染色體的生物形態(tài)[6]。

    在自動(dòng)化研究中,骨架提取及邊緣檢測在圖像識(shí)別領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛[7-10]。其中利用圖像骨架來表征圖像形態(tài),是有效剔除冗雜信息,保留圖像拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征的有效技術(shù)手段[8]。骨架化方法已廣泛應(yīng)用于植物根莖模擬、葉片脈絡(luò)分析、肺血管重建等領(lǐng)域[11-13]。鑒于此,本文以骨架化理論為基礎(chǔ),獲得染色體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(即染色體骨架),并以長度、端點(diǎn)數(shù)目、著絲粒分界比等指標(biāo)數(shù)字化表征染色體骨架,以區(qū)分不同染色體的形狀特征。本文提出的染色體骨架分析,將為染色體識(shí)別及形態(tài)研究提供重要的途徑。

    1 實(shí)驗(yàn)方法

    1.1 樣品制備

    1) 將雌性ICR小鼠于處死前4 h注射3 μg/g的秋水仙素,4 h后脫頸椎處死,摘取后肢股骨;

    2) 用低滲液(0.075 mol/L KCl)反復(fù)沖洗骨髓腔,收集骨髓細(xì)胞;

    3) 再將骨髓細(xì)胞移入預(yù)溫至37 ℃的低滲液至8 mL,置于37℃水浴鍋內(nèi)30 min;

    4) 然后,加入1 mL新制固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1),混勻后以1 500 r/min離心5 min;

    5) 棄上清,再加入5 mL固定液,混勻固定15 min,離心5 min后,再棄上清;

    6) 再加入0.3 mL固定液制成細(xì)胞懸混液;

    7) 在干凈、濕冷載玻片上20 cm處滴2滴細(xì)胞懸液;

    8) 氣干后,DAPI染色5 min,清洗后,即可顯微鏡下觀察。

    1.2 染色體骨架化

    1) 圖像預(yù)處理

    光學(xué)系統(tǒng)成像時(shí),在數(shù)據(jù)采集與傳輸?shù)倪^程中,常受到外界干擾,從而對光學(xué)圖像引入噪聲及失真。這些噪聲或圖像失真使得人們對熒光圖像的觀察受到影響,對圖像信息的理解受到干擾。成像系統(tǒng)采集的圖像g,與真實(shí)圖像f的關(guān)系為g=f×h+n。其中h為成像系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù),n為噪聲。鑒于此,本文圖像預(yù)處理過程,首先為去噪。熒光顯微鏡產(chǎn)生的主要噪聲為椒鹽噪聲,中值濾波是有效去除椒鹽噪聲的方法[1]。隨后進(jìn)行盲反卷積操作。根據(jù)成像設(shè)備的參數(shù)(激發(fā)波長為358 nm,物鏡為尼康100倍油鏡,物鏡油折射率為1.515),構(gòu)建系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù),再盲反卷積,以盡量恢復(fù)真實(shí)的熒光圖像。

    2) 圖像分割

    光學(xué)圖像獲得后,需要將圖片中前景與背景分離開,以便研究前景圖像的形態(tài)特點(diǎn)。圖像分割是指將數(shù)字圖像根據(jù)不同的特征,細(xì)分為若干個(gè)圖像子區(qū)域的過程。每個(gè)子區(qū)域?qū)?yīng)的是一個(gè)具有某種共同視覺特性的像素集合。本文以人機(jī)交互的方式設(shè)定分割閾值,即人眼的視覺識(shí)別與圖像數(shù)字直方圖的分界協(xié)同確定閾值,并將灰度大于閾值的像素點(diǎn)設(shè)定為前景圖像,小于閾值的設(shè)定為背景圖像。

    3) 二值化

    圖像的二值化就是將圖像上的所有像素點(diǎn)的灰度值分別設(shè)置為0或255這兩個(gè)不同的值,這樣就將整個(gè)圖像的視覺效果呈現(xiàn)出只有黑和白的(二值)圖像。在這里將要處理圖像的前景像素的灰度值均設(shè)置為255,圖像的背景像素的灰度值均設(shè)置為0,使灰度圖像變?yōu)楹诎?二值)圖像。

    4) 骨架提取

    5) 圖像后處理

    由不規(guī)則的染色體邊界及圖像噪聲等因素的干擾,所抽取的染色體骨架存在著很多毛刺(異化分支)。這種畸變(毛刺)將影響染色體拓?fù)湫螒B(tài)的表征。本文以分支長度和方向?yàn)橹笜?biāo),判定原骨架中各分支是否為毛刺,以保證修剪后骨架質(zhì)量更能準(zhǔn)確地表征染色體拓?fù)湫螒B(tài)。分支長度的劃分標(biāo)準(zhǔn)一般為小于最長分支1/3的視為毛刺。分支方向的劃分標(biāo)準(zhǔn)為分叉中夾角小于90°的一般視為毛刺。自動(dòng)化修剪后骨架仍需人工檢驗(yàn),以摒除計(jì)算誤差。

    1.3 染色體骨架分析

    1) 骨架長度

    對二值圖像骨架提取后的骨架進(jìn)行長度的計(jì)算。結(jié)合單個(gè)像素代表的幾何大小(0.84 μm×0.84 μm),計(jì)算染色體骨架的8鄰域長度,獲得染色體骨架尺寸。

    2) 端粒數(shù)目

    處理后的圖像骨架由單個(gè)像素點(diǎn)連接而成,每個(gè)染色體骨架端點(diǎn)數(shù)目代表染色體的端粒數(shù)目。(端點(diǎn)在8鄰域范圍內(nèi)只有一個(gè)像素點(diǎn))。分別對每個(gè)染色體骨架進(jìn)行觀察、記錄并整理出端粒數(shù)。

    3) 著絲粒分界比

    不同染色體的著絲粒位置也各有不同,對圖像進(jìn)行骨架提取的染色體骨架中分叉點(diǎn)代表染色體的著絲粒位置。(分叉點(diǎn)在8鄰域范圍內(nèi)有≥3個(gè)像素點(diǎn))。一條染色體骨架中,端點(diǎn)到分叉點(diǎn)的距離之比,定義為著絲粒分界比。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 染色體圖像預(yù)處理、分割、二值化結(jié)果

    依實(shí)驗(yàn)方法,原始圖片(圖1a)經(jīng)2×2中值濾波去除噪聲(圖1b),而后經(jīng)盲反卷積修復(fù)(圖1c),圖像質(zhì)量得到了極大的改善。以灰度64為閾值分界,分割染色體圖像的前景與背景,圖片中灰度值64~255的像素選定為染色體區(qū)域,即為前景目標(biāo);灰度值0~63的像素設(shè)定為背景目標(biāo),圖1d顯示分割結(jié)果。隨后,將分割圖像進(jìn)行二值變換,灰度圖轉(zhuǎn)變?yōu)槎祱D(圖1e)。

    圖1 染色體原始圖像的預(yù)處理(a~c)、分割(d)及二值轉(zhuǎn)換(e)Fig.1 Preprocessing(a~c), segmentation(d) and binaryzation(e) of original image of chromosomes

    2.2 染色體骨架提取及毛刺去除結(jié)果

    由上節(jié)骨架提取算法,從染色體二值圖像中可獲得染色體骨架,可以看到染色體的初提取骨架存在很多毛刺(圖2a),這些毛刺是一種非結(jié)構(gòu)性分支,由圖像噪聲及細(xì)節(jié)引入。以分支長度和方向?yàn)橹笜?biāo),設(shè)置毛刺劃分門限,并以人類視覺觀察為最終較驗(yàn)體系,對初提取骨架進(jìn)行毛刺篩查及剔除,毛刺去除后的染色體最終骨架見圖2b和圖2c??梢?最終骨架可正確反映染色體臂長及著絲粒位置,是染色體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確體現(xiàn)。

    圖2 染色體骨架初提取示意(a)及毛刺去除效果(b,c)Fig.2 Initial skeleton extraction of chromosomes (a) and deburring (b, c)

    2.3 染色體骨架分析結(jié)果

    本文以長度、端粒數(shù)目及著絲粒分界比來分析染色體骨架(圖3),從而確定染色體的形態(tài)特點(diǎn)。本文中,以染色體骨架長度長短的順序依次命名染色體(圖4),并在表1中顯示了ICR雌性小鼠中期骨髓細(xì)胞40條染色體骨架的形態(tài)分析結(jié)果。

    圖3 染色體骨架分析示意Fig.3 Illustration of chromosome skeleton analysis

    圖4 依骨架長度命名染色體Fig.4 Chromosomes named after skeleton length

    染色體編號(hào)長度/μm端粒數(shù)目著絲粒分界比rst15.7441.11rst25.7841.25rst35.0741.89rst45.0542.03rst55.0541.57rst65.0441.62rst75.042>10rst85.022>10rst94.732>10rst104.732>10rst114.7142,76rst124.7042.89rst134.4142.15rst144.4042.13rst154.3842.23rst164.3742.26rst174.0641.52rst184.0441.34rst193.7239.83rst203.7139.94染色體編號(hào)長度/μm端粒數(shù)目著絲粒分界比rst213.7041.19rst223.7041.25rst233.7041.29rst243.6941.51rst253.682>10rst263.682>10rst273.6834.21rst283.6734.03rst293.4041.56rst303.3941.37rst313.392>10rst323.392>10rst333.362>10rst343.352>10rst353.0541.23rst363.0341.47rst372.732>10rst382.722>10rst392.702>10rst402.692>10

    3 討 論

    染色體是遺傳物質(zhì)在細(xì)胞分裂中期的存在形式,是染色質(zhì)緊密蜷縮的結(jié)果,其作為遺傳物質(zhì)的重要載體, 其形態(tài)研究對發(fā)育、遺傳及變異等基礎(chǔ)研究有重要作用,在臨床應(yīng)用中, 也是白血病等惡性血液病的重要診斷依據(jù)[1,14]。生物醫(yī)學(xué)中, 染色體形態(tài)研究的常用方法是基于Giemsa染色的G帶帶型分析[15-16],該方法比較成熟,可準(zhǔn)確呈現(xiàn)染色體組型, 但該方法需要較多的生化操作, 且由于成像及染色的影響容易造成帶紋壓縮誤差。 因此,本文嘗試提出一種更簡潔方便的染色體形態(tài)研究方法。 利用骨架化理論分析ICR小鼠中期骨髓細(xì)胞的染色體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),并以骨架長度、端粒數(shù)目及著絲粒分界比(著絲粒位置)標(biāo)記染色體形態(tài)。 一副圖像的骨架是這幅圖像的重要形態(tài)特征,是圖像拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的直觀描述, 通常以計(jì)算圖像中軸線的方式獲得骨架。 利用骨架化方法獲得染色體的拓?fù)湫畔?是利用計(jì)算機(jī)技術(shù)輔助人類視覺觀察的重要改進(jìn), 這提高了染色體識(shí)別的工作效率,將染色體形態(tài)研究推向自動(dòng)化。 本文獲得的ICR雌性小鼠染色體骨架形態(tài)包括X型、V型及U型, 其中X型對應(yīng)著中著絲粒和近中著絲粒染色體,V型和U型對應(yīng)的是近端著絲粒和端著絲粒染色體。 著絲粒分界比為1~1.70的染色體定義為中著絲粒染色體;1.71~3.00的定義為近中著絲粒染色體; 3.01~7.00的定義為近端著絲粒染色體;大于7.00的定義為端著絲粒染色體[16]。按此定義,本文數(shù)據(jù)顯示ICR雌性小鼠骨髓細(xì)胞中共有40條染色體,長度范圍為2.69~5.74 μm,其中14個(gè)為中著絲粒,8個(gè)為近中著絲粒,2個(gè)為近端著絲粒,16個(gè)為端著絲粒。 不同品系的實(shí)驗(yàn)小鼠在基因表達(dá)、遺傳與變異、及惡性腫瘤研究中均具有非常重要的應(yīng)用。 ICR小鼠是藥物篩查及病理研究中常用的動(dòng)物模型,非常廣泛地應(yīng)用于藥理、毒理、腫瘤等科學(xué)研究中[1,6-7]。本文對ICR雌性小鼠染色體形態(tài)的研究也為基于該品系小鼠的相關(guān)研究應(yīng)用提供重要參考。

    本文利用去噪、盲反卷積技術(shù)對染色體圖像進(jìn)行預(yù)處理,并通過三維自動(dòng)分割技術(shù)分離出染色體前景圖像;基于骨架化理論,應(yīng)用距離變換算法獲得了染色體骨架;最后,通過長度、端粒數(shù)目及著絲粒分界比量化表征了染色體的拓?fù)湫螒B(tài)。該方法可以準(zhǔn)確提取染色體的結(jié)構(gòu)化骨架,并能數(shù)字化染色體形態(tài)。這對于基于染色體形態(tài)的臨床診斷及基礎(chǔ)研究有重要實(shí)用價(jià)值。

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    Morphologicalcharacterizationofchromosomesbasedonskeletonmodel

    GAOMing,WANGTing,WANGYiming,TIANNing

    (College of Physics Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

    Chromosome is the important carrier of genetic material, the spatial configuration(namely chromosomal numbers, structure and localization) of which has a close link with the fundamental biological processes in cell such as gene expression and epigenetic inheritance. Chromosomal morphology aberrations are related to the serious disease(such as down’s syndrome, malignant tumor) which threaten human health. To realize the accurate and quantitative analysis of chromosomal morphologies, this work extracted the topology structure of chromosomes based on the skeletonization theory of binary image conversion and distance transform, to overcome the problem of too much miscellaneous information caused by optical imaging equipment. Further, topological morphology of chromosomes was quantitatively characterized by skeleton length, telomere number and centromere boundary ratio. Based on the automation, this paper established a method of quantitatively characterizing the chromosomal morphology, and this paper will provide important thought for chromosome recognition and morphological study.

    skeletonization; chromosome; topological morphology

    2017-07-18。

    遼寧省科技廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015020715)。

    高 明(1964-),男,遼寧沈陽人,沈陽師范大學(xué)教授,博士;

    田 寧(1985-),女,遼寧沈陽人,沈陽師范大學(xué)副教授,博士。

    1673-5862(2017)04-0395-05

    Q63

    A

    10.3969/ j.issn.1673-5862.2017.04.003

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