非洲馬瘟病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立

姜睿姣，鄔旭龍，張鵬飛，王 印,2*，楊澤曉,2，姚學(xué)萍,2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130；2.動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130)

研究論文

非洲馬瘟病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立

姜睿姣1，鄔旭龍1，張鵬飛1，王 印1,2*，楊澤曉1,2，姚學(xué)萍1,2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130；2.動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130)

為了建立非洲馬瘟病毒(AHSV)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)快速檢測(cè)方法，基于AHSV VP7基因保守序列，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性擴(kuò)增引物。通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系中各組分濃度，反應(yīng)溫度及時(shí)間的優(yōu)化，建立了快速、靈敏的AHSV RT-LAMP檢測(cè)方法，并對(duì)該方法特異性、靈敏度、重復(fù)性進(jìn)行探索。結(jié)果表明，在63℃恒溫下反應(yīng)45 min，便可進(jìn)行高效率的特異性擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和染料可視化鑒定，能夠快速有效檢測(cè)AHSV。用建立的方法檢測(cè)馬屬動(dòng)物易感的4種疫病病原，結(jié)果均為陰性，證實(shí)具有較高的特異性。靈敏度是RT-PCR的1 000倍。建立了AHSV RT-LAMP檢測(cè)方法，具有快速、特異、靈敏、操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低的特點(diǎn)，適合用于現(xiàn)場(chǎng)AHSV快速檢測(cè)。

非洲馬瘟病毒；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；檢測(cè)

非洲馬瘟(African horse sickness,AHS)是由非洲馬瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)引起馬屬動(dòng)物的一種急性或亞急性的蟲(chóng)媒傳染病[1-2]。其主要病理特征有發(fā)熱、皮下組織水腫、肺水腫、臟器出血等。所有馬屬動(dòng)物中，馬對(duì)此病最易感，病死率可高達(dá)90%。AHS被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。AHS主要流行于非洲撒哈拉沙漠以南地區(qū)，在歐洲、中東的部分國(guó)家和地區(qū)偶有發(fā)生[3]。

AHSV屬呼腸病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbiviru)，現(xiàn)已知有9種血清型，不同型病毒的毒力強(qiáng)弱不相同，各型之間具有交互免疫關(guān)系，如5型與8型、6型與9型[3-4]。該病毒無(wú)囊膜，直徑約75 nm，基因組由10個(gè)大小不等的雙鏈RNA片段構(gòu)成，共編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3A)。其中VP7在ASHV各血清中高度保守，是該病毒的血清群特異性抗原[5]。

日本學(xué)者Notomi T等[6]發(fā)明了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。目前，RT-LAMP技術(shù)也廣泛用于RNA病毒的檢測(cè)，如SARS冠狀病毒、口蹄疫病毒[7-11]。與傳統(tǒng)PCR相比，該技術(shù)通?？稍?5min～60min內(nèi)實(shí)現(xiàn)109倍～1010倍的擴(kuò)增，白色產(chǎn)物焦磷酸酶沉淀可通過(guò)肉眼觀察到，除此以外，還能用熒光染色劑SYBR Green I染色觀察。LAMP不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，僅依靠2對(duì)～3對(duì)特異引物和一種鏈置換 DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)，在恒溫下短時(shí)間內(nèi)便能高效、快捷、特異擴(kuò)增靶序列。目前，LAMP方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原體的檢測(cè)，如豬細(xì)小病毒[12]。本研究建立了一種檢測(cè)非洲馬瘟病毒的RT-LAMP方法。

目前中國(guó)雖無(wú)非洲馬瘟的發(fā)生，但隨著各國(guó)貿(mào)易往來(lái)變頻繁、氣候改變，加之此病通過(guò)蚊蟲(chóng)傳播，并不能完全保證AHS不會(huì)傳入進(jìn)中國(guó)。因此，建立一種快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法，有助于現(xiàn)場(chǎng)立即檢測(cè)出本病或排除本病，盡可能減小損失。

1 材料與方法

1.1 材料

馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、鏈球菌(Streptococcus)、狂犬病病毒(Rabies virus,RV)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供。利用DNA/RNA提取試劑盒提取病毒DNA/RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Bst DNA聚合酶、Mg2+購(gòu)于New England Biolabs(NEB)；dNTP、2×TaqPCR Master Mix、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker DL 2 000購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 DNA的制備 在NCBI中獲取AHSV VP7基因序列(GenBank：KT030566.1)，通過(guò)DNAStar軟件比對(duì)分析，人工合成AHSV VP7保守基因序列。將載有目的基因質(zhì)粒的菌株純培養(yǎng)后，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取目的基因質(zhì)粒作為模板，送至華大公司測(cè)序鑒定后，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的AHSV VP7保守基因序列，利用在線(xiàn)軟件 Primer Explorer V5，設(shè)計(jì)并篩選出2對(duì)引物(包括2條外引物F3、B3，2條內(nèi)引物FIP、BIP)。引物序列見(jiàn)表1，由擎科生物公司合成。

表1 引物序列

1.3.3 AHSV RT-LAMP反應(yīng)優(yōu)化 AHSV RT-LAMP的反應(yīng)體系為25 μL，依次對(duì)dNTP濃度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度、引物濃度及溫度進(jìn)行優(yōu)化。具體梯度如下：dNTP終濃度為0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L；Mg2+終濃度分別為2、4、6、8、10 mmol/L；甜菜堿終濃度分別為0、0.5、1、1.5、2 mol/L；內(nèi)引物終濃度分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 μmol/L；外引物終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μmol/L，10×Bst buffer 2.5 μL，Bst DNA 聚合酶8 U，模板2 μL，反應(yīng)溫度優(yōu)化分別為61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化分別為30、45、60、75、90 min。所有體系恒溫反應(yīng)后，80℃加熱 2 min終止反應(yīng)。取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物于20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以確定最佳的反應(yīng)體系。添加 SYBR Green Ⅰ染料，并在紫外燈下觀察。

1.3.4 RT-LAMP產(chǎn)物酶切鑒定 用Primer Premier 5軟件分析目的片段的酶切位點(diǎn)，并篩選出具有單一位點(diǎn)的酶EcoRV，預(yù)計(jì)酶切產(chǎn)物為163 bp和65 bp。20 μL反應(yīng)體系中含EcoRV 10 U，RT-LAMP 產(chǎn)物5 μL，10×緩沖液2 μL，37℃反應(yīng)4 h，取8 μL的酶切產(chǎn)物在20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳鑒定。

1.3.5 RT-PCR檢測(cè) 利用外引物F3、B3進(jìn)行AHSV RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，F(xiàn)3、B3各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。按如下程序進(jìn)行：94℃ 3 min；94℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s共34個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物于20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，將產(chǎn)物送至華大基因測(cè)序鑒定。

1.3.6 RT-LAMP靈敏度檢測(cè) 利用Nano Drop 2 000核酸蛋白分析儀對(duì)AHSV重組質(zhì)粒進(jìn)行定量測(cè)定，根據(jù)核酸濃度計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)[13]。將AHSV重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫腁HSV RT-LAMP和RT-PCR檢測(cè)方法，分別對(duì)1×106copies/μL～1 copies/μL的DNA進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)比兩者檢測(cè)靈敏度。

1.4 RT-LAMP特異性和重復(fù)性試驗(yàn)

根據(jù)建立的AHSV RT-LAMP檢測(cè)方法，分別對(duì)AHSV、EIAV、JEV、Streptococcus、RV進(jìn)行特異性試驗(yàn)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。以AHSV陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，3次不同時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)設(shè)立3次重復(fù)，對(duì)建立的RT-LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行重復(fù)性探索及檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 AHSV RT-LAMP方法的建立

經(jīng)過(guò)對(duì)AHSV RT-LAMP反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化，最終反應(yīng)體系為25 μL：外引物F3、B3各0.2 μmol/L；內(nèi)引物FIP、BIP各1.6 μmol/L；Mg2+6 mmol/L；甜菜堿1 mol/L；dNTP混合液1.2 mmol/L；10×Bst buffer 2.5 μL；Bst DNA 聚合酶8 U；模板2 μL；ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)在63℃恒溫反應(yīng)45 min后，80℃滅活2 min。產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)清晰的階梯狀條帶。在體系反應(yīng)結(jié)束后添加 SYBR Green Ⅰ熒光染料，在紫外燈照下，陰性反應(yīng)管呈橘紅色，而陽(yáng)性反應(yīng)管散發(fā)綠色熒光，介于兩者之間的反應(yīng)管有黃綠色熒光(圖1)。

2.2 RT-LAMP特異性試驗(yàn)

以AHSV質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)馬傳染性貧血病病毒、日本腦炎病毒、鏈球菌、狂犬病病毒進(jìn)行特異性試驗(yàn)，驗(yàn)證所建立RT-LAMP方法的特異性。結(jié)果表明，只有AHSV呈陽(yáng)性，其他試驗(yàn)樣品呈陰性(圖2)。

2.3 RT-LAMP靈敏度檢測(cè)

將AHSV重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)謩e對(duì)1×106copies/μL～1 copies/μL的DNA進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，對(duì)比兩者檢測(cè)靈敏度。結(jié)果表明，用傳統(tǒng)RT-PCR的檢測(cè)極限為1×104copies/μL，而用RT-LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)量為1×101copies/μL，RT-LAMP的靈敏度為傳統(tǒng)RT-PCR的1 000倍，RT-PCR目的擴(kuò)增條帶為228 bp(圖3)。

1.空白對(duì)照；2.未優(yōu)化的反應(yīng)體系；3.最優(yōu)反應(yīng)體系

1.Blank control; 2.Not optimized reaction system; 3.The optimal reaction system

圖1 SYBR GreenⅠ染色結(jié)果

Fig.1 Coloration results of SYBR GreenⅠ

2.4 RT-LAMP產(chǎn)物酶切鑒定

RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)EcoRV酶切后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物上樣于20 g/L瓊脂糖凝膠電泳(圖4)，可以看到一條163 bp和65 bp的條帶，與理論值相符，說(shuō)明RT-LAMP 擴(kuò)增的條帶是AHSV的VP7基因。以F3、B3為外引物，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物測(cè)序鑒定后，在NCBI BLAST進(jìn)行比對(duì)，證實(shí)擴(kuò)增序列為AHSV特異性序列。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～5.依次為AHSV、EIAV、JEV、Streptococus、RV樣本；6.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-5.Simples of AHSV,EIAV,JEV,Stretococus,RV respectively; 6.Blank control

圖2 RT-LAMP特異性檢測(cè)

Fig.2 Specificity test for RT-LAMP

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～6.樣品依次為106、105、104、103、102、101copies/μL；8～13.樣品依次為106、105、104、103、102、101copies/μL；7、14.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-7.106,105,104,103,102,101copies/μL samples,respectively; 8-13.106,105,104,103,102,101copies/μL samples,respectively; 7,14.Blank control

圖3靈敏度檢測(cè)

Fig.3 Sensitivity test

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1.RT-LAMP酶切產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000; 1.RT-LAMP products digested withEcoRV

圖4 RT-LAMP產(chǎn)物酶切鑒定

Fig.4 Determination of RT-LAMP products digested withEcoRV

3 討論

AHS作為一種高致病性的蟲(chóng)媒傳染病，能引起馬屬動(dòng)物皮下組織水腫、肺水腫、內(nèi)臟出血等癥狀。由于AHS發(fā)病迅速，病死率極高，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。各國(guó)貿(mào)易往來(lái)越發(fā)頻繁、進(jìn)出口馬匹越多，此病的傳播就會(huì)越發(fā)迅速。因此，中國(guó)現(xiàn)在雖未發(fā)生本病，但建立一種高效、迅速檢測(cè)方法的儲(chǔ)備，有利于及時(shí)檢測(cè)此病病原，將該病拒亡國(guó)門(mén)之外。

RT-LAMP是一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，此方法相比較于RT-PCR有諸多優(yōu)點(diǎn)。首先，RT-LAMP的擴(kuò)增效率極高，在短短的15min～60 min內(nèi)，就能將目的片段擴(kuò)增109～1010倍，極大程度節(jié)省了檢測(cè)的時(shí)間，對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)及時(shí)檢測(cè)具有重大的意義。其次，RT-LAMP檢測(cè)方法的靈敏度高，特異性強(qiáng)。就本研究而言，RT-LAMP的靈敏度是傳統(tǒng)RT-PCR的1 000倍；1對(duì)外引物和1對(duì)內(nèi)引物保證了擴(kuò)增時(shí)的高特異性。使得檢測(cè)的結(jié)果更加清晰、準(zhǔn)確。再者，結(jié)果的檢測(cè)簡(jiǎn)單，可通過(guò)肉眼觀察是否有白色的焦磷酸鎂產(chǎn)生，亦或加入SYBR Green I染料觀察是否有熒光綠，便判斷是否有產(chǎn)物生成，且全程無(wú)需復(fù)雜的設(shè)備。因而，此技術(shù)已用于人、動(dòng)物、植物的多種病原體檢測(cè)檢測(cè)，具有很高的實(shí)用價(jià)值。由于RT-LAMP的靈敏度極高，一旦開(kāi)蓋容易形成氣溶膠污染，加之實(shí)驗(yàn)室并無(wú)嚴(yán)格分區(qū)，假陽(yáng)性的情況發(fā)生較頻繁。所以在操作時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎，切忌把反應(yīng)后的反應(yīng)管打開(kāi)。

本研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)本套引物，在整個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)Mg2+濃度為6 mmol/L反應(yīng)條帶最佳，與大多文獻(xiàn)報(bào)道最佳Mg2+濃度為8 mmol/L不一致[7,12-13]。內(nèi)、外引物濃度比值比引物的絕對(duì)濃度更重要，本研究濃度比值為8∶1時(shí)，擴(kuò)增的效率最高。這與以往文獻(xiàn)報(bào)道的一般選取4∶1或8∶1的內(nèi)、外引物比值有高擴(kuò)增效率一致。一般情況下，RT-LAMP在15 min～60 min之內(nèi)、61℃～65℃之間能觀察到明顯的條帶。本研究在45 min之后才能觀察到條帶，反應(yīng)溫度以63℃最佳。由此可見(jiàn)，對(duì)于不同的引物和模板，反應(yīng)體系各組分的最佳濃度、反應(yīng)最短時(shí)間以及最適溫度也會(huì)隨之改變。因此，優(yōu)化一個(gè)反應(yīng)體系，對(duì)于建立某種病毒最理想的檢測(cè)方法是必不可少的。

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2017-03-28

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BADl2804)

姜睿姣(1996-)，女，四川雅安人，本科生，主要從事動(dòng)物傳染病病原微生物及其分子生物學(xué)研究。*

S852.65

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1007-5038(2017)12-0001-05