黃柏水溶液對大鼠下肢靜脈性潰瘍創(chuàng)面修復(fù)中NF-κB、TNFAIP3/A20表達(dá)的影響

王茜,劉歧,趙鋼

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

黃柏水溶液對大鼠下肢靜脈性潰瘍創(chuàng)面修復(fù)中NF-κB、TNFAIP3/A20表達(dá)的影響

王茜1,劉歧1,趙鋼2*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：研究黃柏水溶液對大鼠下肢靜脈性潰瘍創(chuàng)面修復(fù)中NF-κB、TNFAIP3/A20表達(dá)的影響。方法: 將雄性SD大鼠80只隨機(jī)平均分為假手術(shù)組、模型組、治療組(黃柏水溶液)和對照組(復(fù)方黃柏液)。每組又分為7d和14d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只。分別于治療第 7天 , 第14天采用數(shù)碼相機(jī)照相電子計(jì)算機(jī)軟件分析及透明生物膜描膜法觀察潰瘍創(chuàng)面愈合情況。治療第7、14天進(jìn)行血流變及DD檢測，ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。取創(chuàng)面組織進(jìn)行病理學(xué)檢測，同時(shí)用PCR檢測NFκB、IκB、TNFAIP3的表達(dá)。結(jié)果:治療組與模型組比較，效果明顯，愈合率顯著升高，潰瘍面積不斷縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，IL-1β、IL-6、TNF-α的含量降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較NF-κB mRNA水平下降，IκBα、TNFAIP3/A20的水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療14天的效果要優(yōu)于藥物治療第7天。各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果顯示，對照組于治療組沒有明顯差異。結(jié)論:黃柏水溶液抑制了大鼠下肢靜脈性潰瘍創(chuàng)面修復(fù)中的NF-κB的表達(dá)，促進(jìn)了TNFAIP3/A20的表達(dá)。

黃柏水溶液；下肢靜脈性潰瘍；創(chuàng)面修復(fù)

下肢靜脈性潰瘍是外科常見病、多發(fā)病, 是下肢慢性靜脈功能不全后期的主要臨床表現(xiàn)之一[1],中醫(yī)稱“臁瘡”“老爛腿”, 該病可導(dǎo)致慢性疼痛、殘疾、生活質(zhì)量下降，常見發(fā)病部位為小腿中下段前內(nèi)側(cè)面,即足靴區(qū)，其次是內(nèi)踝、外踝和足背區(qū)[2]，深靜脈瓣膜功能不全引起的靜脈高壓是下肢靜脈潰瘍的主要原因。黃柏功效為清熱燥濕，瀉火解毒，外治法治療癰疽瘡毒，皮膚潰瘍等[3]。

本研究將對黃柏水溶液治療實(shí)驗(yàn)大鼠皮膚潰瘍中的基因表達(dá)以及可行性通絡(luò)進(jìn)行驗(yàn)證，為其臨床治療下肢靜脈性潰瘍提供臨床依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性SD大鼠80只，SPF級，體質(zhì)量(250±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,許可證號：SCXK魯20140001。在安靜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫(22±2)℃，相對濕度55%～60%。給予充足清潔飲水，自由攝食。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及儀器

黃柏水溶液(10 mL/支，含生藥0.3 g。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬一院藥廠生產(chǎn)制備);復(fù)方黃柏液(山東漢方制藥有限公司生產(chǎn));戊巴比妥鈉(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn))。

顯微鏡：(日本OLYMPUS)；HD-850型桌上式潔凈工作臺(蘇州凈化)；美國moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)；電子天平(梅特勒—托利多儀器上海有限公司)；切片機(jī)，包埋機(jī)，脫水機(jī)(德國 Leica公司);磁力加熱攪拌器(德國IKA公司)；全自動梯度PCR儀(美國Bio-Rad公司)；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公)；凝膠成像系統(tǒng)(以色列MiniLumi公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物模型制備

1.2.1.1 大鼠下肢深靜脈血栓形成模型制備

在無菌操作臺上，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，剪去左側(cè)大腿根部毛發(fā),仰臥位固定。常規(guī)無菌消毒,鋪好無菌孔巾。在左側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)做長約2 cm切口,分離皮下組織和淺筋膜等,分離并暴露髂-股靜脈約1.0 cm。在其近、遠(yuǎn)心端用動脈夾夾閉此靜脈,然后用自制無齒的12號蚊式鉗夾閉血管，于動脈夾位置相鄰，力量為血管鉗緊1扣,時(shí)間持續(xù)2～3 s。松開蚊式鉗并進(jìn)行縫合,局部皮膚常規(guī)消毒。手術(shù)后24 h,將放置血管夾取出[4]。

1.2.1.2 局部皮膚缺損模型

下肢深靜脈血栓模型制備成功3 d后, 在無菌操作臺上，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪去左側(cè)大腿外側(cè)毛發(fā)，保證皮膚完整無破損,然后取適量脫毛膏脫毛, 直徑約為3 cm。大鼠俯臥位固定，局部皮膚常規(guī)無菌消毒,鋪好無菌孔巾,用直徑1.5 cm打孔器標(biāo)記造模位置,剪取標(biāo)記位置全層皮膚,造成直徑1.5 cm圓形皮膚缺損，深度達(dá)皮下深筋膜。大鼠分籠單個(gè)飼養(yǎng)，籠具內(nèi)鋪墊無菌紗布，同時(shí)注意保暖，觀察大鼠皮損變化和一般行為狀態(tài)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠分組治療

將 80只大鼠隨機(jī)平均分為模型組、黃柏水溶液組和陽性藥對照組(復(fù)方黃柏液)。另設(shè)假手術(shù)組，除不夾閉血管和剪去皮膚外，其余操作同模型組。每組又分為7 d和14 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只。黃柏組在創(chuàng)面噴黃柏水溶液，為0.5 mL/創(chuàng)面，每天一次；復(fù)方黃柏組在創(chuàng)面噴復(fù)方黃柏液，0.5 mL/創(chuàng)面，每天1次。治療14天。

1.2.3 潰瘍創(chuàng)面的面積計(jì)算

于造模后藥物治療的第7天，第14天用數(shù)碼相機(jī)照相經(jīng)Photoshop軟件分析及透明生物膜覆蓋創(chuàng)面并沿創(chuàng)緣描膜以記錄創(chuàng)面面積,計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(初始面積-未愈合面積)/初始面積×100%。

計(jì)算皮膚潰瘍剩余面積[5]。

1.2.4 潰瘍創(chuàng)面的組織學(xué)檢查

于造模后藥物治療的第14天切取皮膚潰瘍創(chuàng)面組織，置于10%中性福爾馬林固定液中，常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察潰瘍創(chuàng)面愈合的情況。

1.2.5 ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平

按照ELISA試劑盒說明，使用酶標(biāo)儀檢測各樣本的吸光度A，計(jì)算IL-1β、IL-6 和TNF-α的各組小鼠血清中的濃度。

1.2.6 RT-PCR法檢測潰瘍組織中NFκBp65、IκBα和TNFAIP3mRNA表達(dá)

潰瘍組織中總DNA提取按Trizol試劑說明書進(jìn)行。取2 μgRNA 在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成DNA，用Podocin引物對cDNA 進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增,采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄,NFκBp65:上游引物:GCTCCTTTTCTCAAGCCGATGT;下游引物:CGTAGGTCCTTTTGCGTTTTTC。IκBα：上游引物：ACGAGGATTACGAGCAGATGGT；下游引物：GCAGGTTGTTCTGGAAGTTGAG。TNFAIP3：上游引物：GCAGTGTAAAAGGCAGGCTAAC；下游引物：TGGGGTTCTCTCTCGTATCTTC。GAPDH：上游引物：TTCCTACCCCCAATGTATCCG；下游引物：CATGAGGTCCACCACCCTGTT。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析，計(jì)算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對于對照樣品，目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)的變化

大鼠造模后陸續(xù)出現(xiàn)下肢腫脹、皮色暗紅,潰瘍創(chuàng)面有膿性分泌物滲出，食量減少、飲水減少、少動、弓背等癥狀。給藥后復(fù)方黃柏液組與黃柏水溶液組癥狀緩解較模型組明顯。

2.2 大鼠潰瘍面積以及愈合率的變化

由數(shù)據(jù)可示，隨著時(shí)間的進(jìn)展，治療組與模型組比較效果明顯，愈合率顯著升高，潰瘍面積不斷縮小，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 大鼠潰瘍面積與愈合率數(shù)值

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

2.3 組織病理學(xué)變化

假手術(shù)7天組：細(xì)胞呈梭形,組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊,大小均勻。模型7天組：炎細(xì)胞大量出現(xiàn)，組織水腫明顯，紅細(xì)胞明顯，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松。黃柏水溶液7天組：組織水腫開始消退，炎細(xì)胞減少，結(jié)締組織開始增生。復(fù)方黃柏液7天組：組織水腫開始消退，炎細(xì)胞減少，結(jié)締組織開始增生。黃柏水溶液14天：組織水腫消失，炎細(xì)胞減少明顯幾乎消失，結(jié)締組織增生明顯。復(fù)方黃柏液14天組：水腫消失，炎細(xì)胞消失不見，結(jié)締組織大量增生。

HE染色圖片(×400)見圖1。

圖1 大鼠組織病理學(xué)變化 注：A：假手術(shù)7天組;B：模型7天組;C：黃柏水溶液7天組;D:復(fù)方黃柏液7天組;E：黃柏水溶液14天組;F：復(fù)方黃柏液14天組

2.4 血液學(xué)檢測

通過數(shù)據(jù)檢測可看出，模型組與假手術(shù)組的血流變及血漿D-二聚體比較發(fā)現(xiàn)，模型組指標(biāo)均高于假手術(shù)組，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組與模型組的血流變及血漿D-二聚體比較可看出，治療組效果明顯，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組與治療組對比發(fā)現(xiàn)，P>0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以只能證明大鼠下肢靜脈性潰瘍模型的成功建立，以及黃柏水溶液治療的有效性。(見表2、3)

2.5 ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平結(jié)果

檢測數(shù)據(jù)提示，與假手術(shù)比較，模型組各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)值更高，說明炎癥反應(yīng)比假手術(shù)組重，模型成立。在給藥方面，治療組在7、14天與模型組比較，指標(biāo)數(shù)值明顯降低，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明黃柏水溶液效果明顯。對照組14天與治療組14天的比較中，不具有差異，P>0.05,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

2.6 RT-PCR法檢測潰瘍組織中NFκBp65、IκBα和TNFAIP3mRNA表達(dá)

以上數(shù)據(jù)表明，NFκBp65表達(dá)上，假手術(shù)組與模型組對比明顯表達(dá)量較少，有顯著性差異，P<0.05。治療組與模型組對比可見，NFκBp65表達(dá)量減少，說明黃柏藥物有效性，有顯著性差異，P<0.05。在IκBα基因表達(dá)上，假手術(shù)組表達(dá)明顯高于模型組，有顯著性差異，P<0.05；治療組與模型組比較，表達(dá)上也高于模型組，有顯著性差異，P<0.05；在治療第14天時(shí)，治療組與對照組對比得出P>0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明治療組與對照組沒有明顯差異。TNFAIP3基因表達(dá)上可見，假手術(shù)組表達(dá)明顯高于模型組，有顯著性差異，P<0.05；治療組與模型組比較，表達(dá)上也高于模型組，有顯著性差異，P<0.05；對照組與治療組比較P>0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

表2 血漿D-二聚體(DD)、纖維蛋白原(FIB)檢測數(shù)值變化

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3 全血黏度200s 、RCAI、CP檢測結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表4 IL-1β、IL-6、TNF-α檢測結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表5 各組基因的變化水平

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

下肢靜脈性潰瘍，由于各種原因引起的下肢靜脈瓣膜功能不全，靜脈血流動力學(xué)發(fā)生改變，產(chǎn)生淺靜脈、深靜脈或交通支靜脈血液異常反流，引起靜脈壓力升高，而形成的難治性潰瘍。目前醫(yī)學(xué)上尚無滿意的藥物及療法，但是中醫(yī)藥對本病的治療具有其獨(dú)特的優(yōu)勢。下肢靜脈性潰瘍屬中醫(yī)“臁瘡”的范疇，其為本虛標(biāo)實(shí)之證，氣虛血瘀為基本病機(jī)，益氣活血消除下肢瘀血是治療的關(guān)鍵。臨床上外用治療常用的有復(fù)方黃柏液，生肌玉紅膏等中成藥物。

檢測指標(biāo)中的血流變以及血漿第二聚體為衡量血栓的重要指標(biāo)，可用來證明模型的成立。α腫瘤壞死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α)是具有眾多生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，是由多核巨細(xì)胞產(chǎn)生。Carswell[6]等,最早命名其為腫瘤壞死因子。TNF-α由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,又稱惡液素[7]。TNF-α是炎性細(xì)胞因子，參與全身炎癥反應(yīng)通過產(chǎn)生IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等因子引起炎癥[8]。IL-1β：白細(xì)胞介素1 (interleukin-1,IL-1)擁有眾種生物學(xué)效應(yīng)，特別在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)，調(diào)整創(chuàng)傷組織的修復(fù)過程中作用明顯，也是體內(nèi)作用較強(qiáng)的炎癥細(xì)胞因子[9]。IL-6：IL-6由所有經(jīng)過TNF-α和 IL-1誘導(dǎo)的細(xì)胞核組織產(chǎn)生。IL-6擁有致炎作用和抗炎作用[10]。本實(shí)驗(yàn)通過酶聯(lián)反應(yīng)檢測創(chuàng)面組織中的IL-6、IL-1β 、TNF-α的變化，得出黃柏水溶液能夠有效地降低三種因子的表達(dá)，從而抑制了炎癥反應(yīng)的發(fā)生，達(dá)到了治療潰瘍的目的。

NF-KB是具有轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)功能的一種蛋白。正常情況下,NF-kB同IkB(inhibitor of NF-KB)即抑制因子相結(jié)合,對調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄功能進(jìn)行抑制。調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子[11]等。IL-10通過抑制IKK(IkB激酶)的活性,達(dá)到抑制NF-KB活化，同時(shí)加快了炎癥因子IL-1,IL-6,IL-8,G-CSF的mRNA的降解,降解后產(chǎn)物將導(dǎo)致NF-kB的持續(xù)活化,讓炎癥持續(xù)放大,從而炎癥再次加重[12]。 TNFAIP3為腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白，A20是其編碼的泛素化蛋白[13]。A20蛋白抑制NF-KB的表達(dá)和細(xì)胞凋亡[14]。TNFAIP3也是自身免疫性炎癥反應(yīng)形成的重要的候選基因[15]。在生理狀態(tài)下,NF-KB與其抑制蛋白IKB結(jié)合,以無活性的復(fù)合體形式存在于細(xì)胞漿中,適當(dāng)?shù)耐鈦硇盘柨蓪?dǎo)致IKB磷酸化降解,NF-KB活化并向細(xì)胞核內(nèi)移位,與相應(yīng)的DNA位點(diǎn)結(jié)合,啟動A20的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[16]。A20可通過多個(gè)不同的機(jī)制抑制IKB的磷酸化,而使IKB含量增加，從而抑制NF-KB的功能[17]。本研究通過對TNFAIP3/A20的基因表達(dá)測定得出了，在下肢潰瘍模型愈合過程中，A20表達(dá)越高，創(chuàng)面愈合情況越好，這就證明中藥黃柏可以通過刺激A20而使IKB含量增高，抑制了NF-KB 含量，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的目的，從而使創(chuàng)面愈合加快。

本課題從各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)來評價(jià)黃柏水煎液治療下肢靜脈性潰瘍的療效。結(jié)果證明:黃柏水溶液可以明顯緩解下肢靜脈性潰瘍患者的臨床表現(xiàn),促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。各項(xiàng)指標(biāo)及療效評價(jià)與模型組比較(P<0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用黃柏水溶液是治療下肢靜脈性潰瘍安全有效的方法。

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Wound-HealingEffectofAqueousSolutionofCortexPhellodendriontheExpressionsofNF-κβandTNFAIP3/A20inRatswithVenousUlcerofLowerLimbs

WANG Xi1, LIU Qi1, ZHAO Gang2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To investigate the wound-healing effect of aqueous solution ofCortexPhellodendrion the expressions of NF-κβ and TNFAIP3/A20 in rats with venous ulcer of lower limbs. Methods: 80 male SD rats were randomly divided into the sham surgery group, the model group, the observation group(aqueous solution ofCortexPhellodendri), and the control group(Compound Phellodendron Liquid). Each group was subdivided by 7 d and 14 d, 10 rats at each time point. Wound-healing degree was observed, tests of hemorheology DD were performed, serum levels of IL-1β, IL-6, and TNF-a, as well as the expressions of NF-κβ and TNFAIP3/A20 were detected on 7th and 14th day respectively. Results: The effect of the observation group was more obvious, the healing rate increased more significantly, the area of the ulcer was narrower, compared to the model group, and the difference was statistically significant(P<0.05). The levels of IL-1β, IL-6, and TNF-α were decreased significantly, and the difference was statistically significant, compared to the model group(P<0.05). The expression of NF-κβ was reduced, but TNFAIP3/A20 was raised when compared to the control group, with a significant difference(P<0.05). 14 d treatment was better than 7 d treatment. It showed that there were no obvious difference between the observation group and the control group in the above indicators. Conclusion: Aqueous solution ofCortexPhellodendrican inhibit the NF-κβ expression and promote TNFAIP3/A20 expression, which may be related to its wound-healing effect in rats with venous ulcer of lower limbs.

Aqueous solution ofCortexPhellodendri; Venous ulcer of lower limbs; Wound-healing

R285.5

A

1002-2392(2017)06-0052-05

2017-08-02

2017-09-10

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金(青年后備人才計(jì)劃類)(2016RAQXJ209)

王茜(1986-),女,博士研究生,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合治療周圍血管系統(tǒng)疾病及其并發(fā)癥。

*通訊作者：趙鋼(1958-),男,主任醫(yī)師,博士研究生導(dǎo)師,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合治療周圍血管系統(tǒng)疾病及其并發(fā)癥。