小麥近等基因系TcLr19中TaABCF基因的克隆及表達(dá)分析

苑 瑩，胡亞亞,2，李建嫄，楊文香，劉大群,3

(1．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系/河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心/國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,河北保定 071001； 2.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北石家莊 050035； 3.中國(guó)農(nóng)科院作物所，北京 100081)

小麥近等基因系TcLr19中TaABCF基因的克隆及表達(dá)分析

苑 瑩1，胡亞亞1,2，李建嫄1，楊文香1，劉大群1,3

(1．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系/河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心/國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,河北保定 071001； 2.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北石家莊 050035； 3.中國(guó)農(nóng)科院作物所，北京 100081)

為了挖掘新的抗小麥葉銹病基因，以被無(wú)毒小麥葉銹菌誘導(dǎo)的TcLr19為研究對(duì)象，通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)在TcLr19中克隆到抗病相關(guān)基因TaABCF，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)分析。序列分析表明，TaABCF基因的DNA和cDNA序列長(zhǎng)度分別為3 100 bp和1 885 bp，包含4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子，含有兩個(gè)核苷酸結(jié)合域，具有WalkerA、WalkerB和WalkerC保守序列。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，TaABCF基因與來(lái)自烏拉爾圖小麥的EMS53714.1基因親緣關(guān)系最近。實(shí)時(shí)熒光定量分析表明，TaABCF基因在小麥TcLr19與小麥葉銹菌FHPL非親和互作前期表達(dá)提高，而在感病小麥Thatcher與小麥葉銹菌FHPL的親和互作后期表達(dá)受抑制，且在脫落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)處理下的表達(dá)早于水楊酸(SA)處理，說(shuō)明TaABCF基因參與小麥的抗葉銹反應(yīng)，且對(duì)ABA和MeJA的響應(yīng)要早于SA。

TaABCF；基因克??；小麥葉銹??；表達(dá)分析；信號(hào)途徑

小麥葉銹病是小麥主要病害之一，分布最為廣泛，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可造成5%～15%或者更高的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量損失[1]。近年來(lái)，小麥葉銹病在我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)日趨嚴(yán)重，就目前而言，有效利用小麥抗葉銹基因和抗葉銹相關(guān)基因成為防治該病的途徑之一。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一大類(lèi)跨膜蛋白，廣泛存在于自然界生物體中[2]。由于植物中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能多樣，參與植物一切生命活動(dòng)過(guò)程，從而引起人們的廣泛關(guān)注[3]。很多證據(jù)表明，PDR類(lèi)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與植物防衛(wèi)反應(yīng)。其中，一些PDR類(lèi)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以經(jīng)病原物產(chǎn)生的激發(fā)子誘導(dǎo)而產(chǎn)生抗菌、抗毒素物質(zhì)，也有一些對(duì)抗真菌成分和有毒物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[4-8]。小麥中已經(jīng)克隆的持久抗葉銹病基因 Lr34是一個(gè)ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因，兼抗條銹病和白粉病[9]。尚 毅等[10]從小麥望水白穗組織cDNA中克隆出PDR型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 TaPDR1，并證明 TaPDR1參與了植物對(duì)禾谷鐮刀菌的防御反應(yīng)。

植物-病原體相互作用的關(guān)鍵組成部分之一是激素信號(hào)傳導(dǎo)。其中，水楊酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、脫落酸(abscisic acid,ABA)已被證明在植物-病原體相互作用中發(fā)揮重要作用[11-13]。來(lái)源于長(zhǎng)穗偃麥草(Agropyronelongayum或Thinopyrumponticum)7Ag染色體上的小麥抗葉銹病基因 Lr19是一個(gè)具有應(yīng)用潛力的抗葉銹病基因。本實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用cDNA-AFLP技術(shù)從mRNA表達(dá)水平研究小麥抗葉銹病近等基因系TcLr19和感病對(duì)照Thatcher與小麥葉銹菌FHPL互作時(shí)基因表達(dá)的差異，分離得到與水稻的多效耐藥調(diào)控蛋白類(lèi)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PDR-type ABC transporter 9)編碼基因同源性達(dá)84%的片段[14]。由于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因普遍存在于各種生物體內(nèi)，而對(duì)其在植物抗病方面的研究較少，尤其是其關(guān)于小麥抗病的研究甚少。因此，本研究以TcLr19為研究對(duì)象，通過(guò)RACE技術(shù)獲得可能與抗病表達(dá)相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaABCF，利用生物信息學(xué)軟件分析TaABCF基因的特性，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)該基因在葉銹菌以及激素ABA、SA、MeJA(茉莉酸甲酯)誘導(dǎo)下的表達(dá)特性進(jìn)行分析，從而揭示TaABCF在小麥抗葉銹病中可能的作用，以及激素ABA、SA和MeJA對(duì)其表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

供試小麥材料為T(mén)cLr19(抗葉銹病近等基因系)、Thatcher(感病對(duì)照)和鄭州5389，供試小麥葉銹菌菌株為FHPL(對(duì)TcLr19表現(xiàn)低毒力，對(duì)Thatcher表現(xiàn)高毒力)，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)銹病研究室提供。

將TcLr19和Thatcher的種子按每盆15粒分別播種于直徑15 cm的花盆中，置于溫度18～25 ℃、光照10～14 h的溫室內(nèi)培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)至一葉一心期，取一部分幼苗將葉銹菌菌株FHPL的夏孢子均勻接種在葉片上，接種后噴水霧保濕，置黑暗條件下14～16 h，然后繼續(xù)轉(zhuǎn)入溫室培養(yǎng)。同時(shí)，取剩余幼苗，分別用5 mmol·L-1SA、0.01 mmol·L-1ABA和0.1 mmol·L-1MeJA[15-17]溶液噴灑葉片表面直至溶液滴下，然后繼續(xù)轉(zhuǎn)入溫室培養(yǎng)。分別于接種或噴灑激素后 0 h、6 h、12 h、18 h、1 d、1.5 d、2 d、3 d、4 d、6 d、9 d 和12 d剪取葉片0.1 g，液氮速凍，-70 ℃儲(chǔ)藏備用。其中，小麥葉片接種或噴灑清水為對(duì)照。

1.2 引 物

對(duì)小麥葉銹菌侵染的TcLr19的cDNA文庫(kù)進(jìn)行EST序列分析時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)六倍體小麥ABCF基因的同源序列，以此同源片段為參考序列[14]，按SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit中的要求，應(yīng)用Primer 5.0軟件，在其5′端設(shè)計(jì)反向特異引物RACE-TaABCF-5，在其3′端設(shè)計(jì)正向特異引物RACE-TaABCF-3。將TaABCF基因5′RACE和3′RACE的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接的全長(zhǎng)序列，在其開(kāi)放閱讀框兩端設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物TaABCF-F和TaABCF-R。同時(shí)，在其3′端設(shè)計(jì)特異性的實(shí)時(shí)熒光定量引物Y-TaABCF-F和Y-TaABCF-R。內(nèi)參引物為GAPDH-F和GAPDH-R。各引物序列見(jiàn)表1。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

采用TaKaRa公司的植物總RNA提取試劑盒提取小麥葉片總RNA，提取方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)合成第一鏈cDNA。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 TaABCF基因的克隆

1.4.1TaABCF基因的RACE擴(kuò)增

以小麥葉銹菌生理小種FHPL侵染的不同時(shí)間點(diǎn)小麥葉片總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板。利用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)進(jìn)行3′RACE和5′RACE cDNA的合成。PCR程序：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5次循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5次循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25次循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0將目的片段純化、回收，回收的PCR片段與pGEM-T Easy Vector載體(Promegra公司)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞[天根生化科技(北京)有限公司]，通過(guò)識(shí)別藍(lán)白斑初步篩選陽(yáng)性克隆，通過(guò)單酶EcoRⅠ雙切進(jìn)一步鑒定陽(yáng)性克隆(對(duì)照為PCR產(chǎn)物及未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒)，最后送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。酶切所用質(zhì)粒用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(生工生物工程)進(jìn)行提取。酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2TaABCF基因cDNA和DNA全長(zhǎng)的克隆

利用引物TaABCF-F和TaABCF-R，在小麥葉銹菌侵染的TcLr19的葉片cDNA和基因組DNA(CTAB法提取)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL，包括1.0 μL cDNA或DNA(100 ng· μL-1)、0.5 μL TaABCF-F(10 μmol·L-1)、0.5 μL TaABCF-R(10 μmol·L-1)、0.5 μL dNTPs(10 mmol·L-1)、2.5 μL 10×PCR Buffer、0.3 μLTaqDNA聚合酶(2.5 U· μL-1)、19.7 μL ddH2O。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3.5 min，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。然后依次進(jìn)行目的片段的回收純化、重組質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的提取、插入片段酶切檢測(cè)和測(cè)序，具體參照1.4.1。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序?qū)λ寺』蜻M(jìn)行相似性比對(duì)和同源性分析；利用DNAMAN 5.2.2對(duì)3′RACE和5′RACE序列進(jìn)行拼接；利用NCBI中的ORF Finder查找基因序列中可能的開(kāi)放閱讀框；利用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)和InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)對(duì)蛋白質(zhì)特性進(jìn)行分析；利用TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)或TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)多肽跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)結(jié)合BLASTX結(jié)果，選取與目標(biāo)基因同源性較高的氨基酸序列；利用MAGE 4.0軟件采用最大簡(jiǎn)約法(maximum parsimony method)分析目標(biāo)基因與其同源性較高基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

提取小麥葉銹菌株FHPL、5 mmol·L-1SA、0.01 mmol·L-1ABA和0.1 mmol·L-1MeJA處理下各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用LightCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)TaABCF在不同處理下的表達(dá)情況進(jìn)行分析。反應(yīng)體系20 μL，包括2.0 μL cDNA、0.5 μL Y-TaABCF-F(10 μmol·L-1)、0.5 μL Y-TaABCF-R(10 μmol·L-1)、10 μL TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、7 μL ddH2O。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，45次循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s；37 ℃ 30 s。GAPDH為內(nèi)參基因。3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束，觀察融解曲線(xiàn)，確保反應(yīng)產(chǎn)物是特異性擴(kuò)增。根據(jù)檢測(cè)到的Ct值，按照2-ΔCt法，計(jì)算目的基因在不同時(shí)間點(diǎn)樣品中的相對(duì)表達(dá)量，并用SPSS軟件對(duì)該基因在不同處理下各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaABCF基因的RACE擴(kuò)增結(jié)果

以小麥葉銹菌侵染的TcLr19的cDNA為模板，利用引物RACE-TaABCF-5和RACE-TaABCF-3進(jìn)行RACE擴(kuò)增后，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，3′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物約750 bp，5′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物約1 500 bp(圖1)。將擴(kuò)增得到的片段切膠回收后，分別與pGEM-T Easy Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α并篩選陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果表明，3′RACE產(chǎn)物長(zhǎng)742 bp，含有28 bp的polyA尾，能夠找到特異引物TaABCF-3及UPM引物，5′端與靶序列的3′端有667 bp的重疊區(qū)，采用DNAMAN 5.2.2的Sequence Assembly程序?qū)?′RACE測(cè)序結(jié)果與靶序列進(jìn)行拼接得到1 504 bp的拼接序列，表明所克隆的片段正是靶序列的末端；5′RACE產(chǎn)物長(zhǎng)1 460 bp，能夠找到特異引物TaABCF-5及UPM引物，3′端與靶序列的5′端有742 bp的重疊區(qū)，采用DNAMAN的Sequence Assembly程序?qū)?′RACE測(cè)序結(jié)果與靶序列進(jìn)行拼接得到2 165 bp的拼接序列，表明所克隆的片段正是靶序列的5′末端。將所得到的3′RACE和5′RACE序列用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，最終得到一個(gè)長(zhǎng)2 240 bp的拼接序列。

2.2 TaABCF基因全長(zhǎng)cDNA和DNA的擴(kuò)增結(jié)果

以小麥葉銹菌侵染的TcLr19葉片的cDNA和DNA為模板，利用引物TaABCF-F和TaABCF-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，cDNA中的擴(kuò)增產(chǎn)物小于2 000 bp，DNA中的擴(kuò)增產(chǎn)物大于2 000 bp(圖2)。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，TaABCF的cDNA長(zhǎng)1 885 bp，DNA長(zhǎng)3 100 bp，且測(cè)序結(jié)果和拼接序列一致。

M： DL2000；1： 3′RACE PCR產(chǎn)物; 2: 5′RACE PCR產(chǎn)物。

M： DL2000；C： cDNA的PCR產(chǎn)物；D: DNA的PCR產(chǎn)物。

圖3 TaABCF的基因結(jié)構(gòu)

2.3 TaABCF基因的生物信息學(xué)分析

NCBI網(wǎng)站分析結(jié)果顯示，TaABCF基因含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子(圖3)。ORF Finder預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TaABCF基因編碼區(qū)長(zhǎng)1 779 bp(193～1971 bp)，編碼592個(gè)氨基酸。SMART軟件對(duì)TaABCF基因的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)分析表明，在92～294 aa和404～571 aa存在與ABCF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相同的保守核苷酸結(jié)合域(圖4)，因此，TaABCF基因?qū)儆贏BCF類(lèi)，且發(fā)現(xiàn)TaABCF基因編碼產(chǎn)物具有WalkerA、WalkerB和WalkerC等保守氨基酸序列(圖5)。利用TMpred對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，TaABCF蛋白在212～235 aa處可能存在1個(gè)跨膜區(qū)(圖6)。利用MAGE 4.0對(duì)TaABCF基因編碼的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果(圖7)表明，TaABCF與來(lái)自烏拉爾圖小麥的EMS53714.1基因親緣關(guān)系最近，與二穗短柄草中的XP003573221.1基因和擬南芥中EMT20534.1基因的關(guān)系較近。

圖4 TaABCF基因的結(jié)構(gòu)域

加粗序列代表起始密碼子和終止密碼子；灰色序列代表核苷酸結(jié)合域；下劃線(xiàn)處代表WalkerA、WalkerB、WalkerC結(jié)構(gòu)域。

圖6 TaABCF蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

Zm：玉米；Sb：高粱；Si：谷子；Et：畫(huà)眉草；Mn：桑樹(shù)；Gm：大豆；Ob：短花藥野生稻；Os：水稻；Bd：二穗短柄草；At：擬南芥Tu：烏拉爾圖小麥。

2.4 葉銹菌誘導(dǎo)下TaABCF基因的表達(dá)模式

在TcLr19與小麥葉銹菌非親和互作組合中，TaABCF基因在0～6 h緩慢上升，6 h后有所下降，12 h后持續(xù)上升，1.5 d時(shí)達(dá)到表達(dá)量的小高峰，之后表達(dá)量下降，6 d時(shí)達(dá)到表達(dá)量的最大值，然后再次下降(圖8)。差異顯著性分析結(jié)果表明，在18 h、1 d、1.5 d、3 d和6 d時(shí)，非親和互作中TaABCF基因的表達(dá)量極顯著高于清水對(duì)照(圖8)。在Thatcher與小麥葉銹菌親和互作組合中，TaABCF基因在0～12 h緩慢上升，12 h時(shí)達(dá)到表達(dá)量的小高峰，之后表達(dá)量變化不大，1.5 d后表達(dá)量下降，2 d后再次上升，6 d達(dá)到表達(dá)量的最大值，隨后表達(dá)量下降(圖8)。差異顯著性分析結(jié)果表明，在2 d、9 d和12 d時(shí)，親和互作中TaABCF基因的表達(dá)量極顯著低于清水對(duì)照(圖8)。綜上所述，非親和互作中TaABCF基因的表達(dá)在前期明顯提高，而親和互作中該基因的表達(dá)在后期明顯受到抑制。

2.5 信號(hào)分子誘導(dǎo)下TaABCF基因的表達(dá)模式

在0.01 mmol·L-1ABA處理下，TaABCF基因在0 ～12 h表達(dá)量上升，在12 h達(dá)到表達(dá)量的最大值，隨后下降，18 h再次上升，到1.5 d達(dá)到表達(dá)量的第二個(gè)高峰后再次下降，2 d時(shí)表達(dá)量再次上升，于4 d時(shí)達(dá)到表達(dá)量的第三次高峰，隨后急劇下降，在12 d時(shí)表達(dá)量再次升高(圖9)。差異顯著性分析結(jié)果表明，在12 h、18 h和1.5 d時(shí)，0.01 mmol·L-1ABA處理下TcLr19中TaABCF基因的表達(dá)量極顯著的高于清水對(duì)照(圖9)。在0.1 mmol·L-1MeJA處理下，TaABCF基因在0～12 h表達(dá)量上升，在12 h達(dá)到表達(dá)量的第一個(gè)高峰，后急劇下降，18 h表達(dá)量再次上升，到1.5 d達(dá)到表達(dá)量的最大值，隨后下降，在3 d表達(dá)量開(kāi)始緩慢上升。差異顯著性分析結(jié)果表明，在12 h和1.5 d時(shí)，0.1 mmol·L-1MeJA處理下TcLr19中TaABCF基因的表達(dá)量極顯著的高于清水對(duì)照。在5 mmol·L-1SA處理下，TaABCF基因在0～6 h緩慢上升，6 h后有所下降，12 h后持續(xù)上升，1.5 d時(shí)達(dá)到表達(dá)量的最大值，之后表達(dá)量下降，4 d時(shí)達(dá)到表達(dá)量的第二高峰，然后再次下降，在12 d時(shí)表達(dá)量有所上升。差異顯著性分析結(jié)果表明，在18 h和1.5 d時(shí)，5 mmol·L-1SA處理下TcLr19中TaABCF基因的表達(dá)量極顯著的高于清水對(duì)照(圖8)。由圖中可以看出，三種激素均能誘導(dǎo)TaABCF基因的表達(dá)，且ABA和MeJA對(duì)TaABCF基因的誘導(dǎo)早于SA。

TcLr19+：TcLr19接種葉銹菌；TcLr19：TcLr19接種清水(對(duì)照);Tc+：Thatcher接種葉銹菌；Tc：Thatcher接種清水(對(duì)照)；**表示處理與對(duì)照差異在0.01水平上顯著。下同。

TcLr19 +：TcLr19 接種小麥葉銹菌；TcLr19 ABA：TcLr19經(jīng)ABA處理；TcLr19 MeJA：TcLr19經(jīng)MeJA處理；TcLr19 SA：TcLr19經(jīng)SA處理。TcLr19：TcLr19接種清水(對(duì)照)。

3 討 論

在植物中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能多樣，參與植物一切的生命活動(dòng)過(guò)程，從而引起人們的廣泛關(guān)注[3]。植物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅參與植物體內(nèi)激素、脂質(zhì)、金屬離子、次生代謝物和外源物質(zhì)的運(yùn)輸，而且有利于植物與病原體間的相互作用和植物體內(nèi)離子通道的調(diào)控[18]，從而參與了植物的抗病過(guò)程[19]。比如，在廣泛的擬南芥突變體遺傳篩選中，AtABCG36/AtPDR8/PEN3首次被認(rèn)為是侵染前的非宿主抗性的關(guān)鍵因素，對(duì)大麥白粉病病原體的敏感性增加[20]。 Lr34是目前唯一一個(gè)通過(guò)編碼ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)抵抗病原物的侵染與擴(kuò)展的基因。

ABCF亞族的基因包含兩個(gè)NBD結(jié)合域，沒(méi)有TMD結(jié)構(gòu)域，該亞族在植物中的功能還沒(méi)有確定。對(duì)本研究中已克隆的TaABCF基因的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)的分析結(jié)果表明，該基因包含兩個(gè)NBD結(jié)合域，每個(gè)NBD結(jié)合域編碼產(chǎn)物具有WalkerA、WalkerB和WalkerC等保守氨基酸序列，因此推斷TaABCF基因編碼的蛋白屬于ABCF家族。目前，在小麥中尚未對(duì)ABCF類(lèi)基因進(jìn)行克隆，因此本研究中所克隆的TaABCF基因是小麥中新發(fā)現(xiàn)的基因。

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量分析表明，TaABCF基因在非親和互作中從18 h開(kāi)始極顯著性表達(dá)，在1.5 d、3 d和6 d同樣存在較高的表達(dá)量；而在親和互作中，從2 d開(kāi)始TaABCF基因的表達(dá)量顯著性減少。由此可以表明,TaABCF參與了小麥的抗葉銹反應(yīng)。

植物-病原體相互作用的難題中的關(guān)鍵組成部分之一是激素信號(hào)傳導(dǎo)[21-22]。病原菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的信號(hào)通過(guò)精密復(fù)雜的傳導(dǎo)途徑逐級(jí)傳遞，最終激活防御反應(yīng)基因或者增強(qiáng)防御反應(yīng)基因的表達(dá)，從而使植株對(duì)病原菌表現(xiàn)出了抗性[23-24]。研究植物中對(duì)病原體防御起作用的激素中，最有主要的是SA、JA和ABA[25-29]。Kuromori等[30]研究表明，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtABCG25參與ABA的運(yùn)輸和響應(yīng)。而另一個(gè)全轉(zhuǎn)運(yùn)子蛋白AtABCG40也被證明其有助于ABA穿過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入氣孔[31]。在水稻轉(zhuǎn)錄組中分析顯示，ABCG成員中有近一半對(duì)JA和SA有積極反應(yīng)[32]。本試驗(yàn)研究表明，ABA和MeJA處理下0～12 h上升表達(dá)，到12 h開(kāi)始極顯著性表達(dá)，而在SA處理下TaABCF基因從18 h開(kāi)始極顯著性表達(dá)，說(shuō)明TaABCF基因明顯受ABA、MeJA和SA的誘導(dǎo)，但是響應(yīng)時(shí)間略有不同，對(duì)ABA和MeJA的響應(yīng)要早于SA，可能ABA和MeJA對(duì)TaABCF基因的調(diào)控位于SA的上游，也因此使TaABCF基因在受到這三種信號(hào)分子誘導(dǎo)后有不同的表達(dá)模式。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的VIGS結(jié)果(未發(fā)表)可知，TaABCF基因確實(shí)參與了小麥的抗葉銹性過(guò)程。對(duì)于TaABCF基因作用的受體和影響TaABCF參與抗病性的機(jī)制有待于今后進(jìn)行Co-IP深入研究。

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CloningandExpressionAnalysisofTaABCFinWheatNearIsogenicLineTcLr19

YUANYing1,HUYaya1,2,LIJianyuan1,YANGWenxiang1,LIUDaqun1,3
(1.Department of Plant Pathology,Agricultural University of Hebei/Biological Control Center of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province/National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas,Baoding,Hebei071001，China; 2.Institute of Cereal and Oil Crops,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang,Hebei 050035，China; 3.Institute of Crop Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081，China)

In order to discover new genes against wheat leaf rust,this study was carried out to clone resistance related genesTaABCFby RACE (rapid amplification of cDNA ends) technique from TcLr19 infected by a virulentPucciniatriticina,and its expression analysis was analysed. The full length cDNA and genomic DNA of theTaABCFgene are 1 885 bp and 3 100 bp,respectively.And it contains 4 introns and 5 exons,and has two nucleotide binding domains and each contains Walker A,Walker B and Walker C. The phylogenetic analyses showed thatTaABCFhas the closest relationship with EMS53714.1 gene fromTriticumurartuThum. ex Gandil. Expression analysis with real-time fluorescent quantitative PCR showed that the expression ofTaABCFwas improved in the incompatible interaction between TcLr19 andP.triticinaFHPL in the early stage,while inhibited in the compatible interaction between Thatcher and FHPL latterly. The expression ofTaABCFwere earlier when treated with ABA and MeJA than that of SA,which showed thatTaABCFgene is involved in the resistance of wheat leaf rust and it responds to ABA and MeJA earlier than SA.

TaABCF; Gene clone; Wheat leaf rust; Expression analysis; Signal pathway

時(shí)間：2017-12-11

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171211.1106.002.html

2017-06-14

2017-10-29

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2013204065)；河北省產(chǎn)業(yè)體系小麥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(HBCT2013010204)

E-mail:1126092776@qq.com(苑 瑩)；huyaya_002@126.com(胡亞亞，與第一作者同等貢獻(xiàn))

楊文香(E-mail：wenxiangyang2003@163.com)；劉大群(E-mail：ldq@hebau.edu.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)12-1525-09