草銨膦對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯的藥害及田間雜草的防治效果

馬 勝，賈小霞*，文國(guó)宏，李高峰，齊恩芳，劉 石，李 掌，李建武，張 榮

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.農(nóng)業(yè)部西北旱作馬鈴薯科學(xué)觀(guān)測(cè)實(shí)驗(yàn)站，甘肅 渭源 748201）

草銨膦對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯的藥害及田間雜草的防治效果

馬 勝1,2,3，賈小霞1,2,3*，文國(guó)宏1,2,3，李高峰1,2,3，齊恩芳1,2,3，劉 石1,2,3，李 掌1,2,3，李建武1,2,3，張 榮1,2,3

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.農(nóng)業(yè)部西北旱作馬鈴薯科學(xué)觀(guān)測(cè)實(shí)驗(yàn)站，甘肅 渭源 748201）

為評(píng)價(jià)草銨膦對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯的藥害及田間雜草的防治效果，在‘隴薯3號(hào)’及其轉(zhuǎn)Bar基因株系苗期和現(xiàn)蕾期的地塊，用草銨膦對(duì)所有馬鈴薯植株和雜草進(jìn)行葉面噴施。通過(guò)觀(guān)察統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)藥后3 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系的所有植株葉色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)良好；未轉(zhuǎn)基因植株‘隴薯3號(hào)’和所有雜草的葉片表面出現(xiàn)枯斑并萎蔫變黃。苗期藥后9 d時(shí)，所有轉(zhuǎn)基因植株仍然葉色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)良好；未轉(zhuǎn)基因植株‘隴薯3號(hào)’和所有雜草全部干枯，完全死亡?，F(xiàn)蕾期藥后9 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因植株‘隴薯3號(hào)’與苗期藥后9 d時(shí)狀態(tài)一致，絕大部分雜草干枯死亡，但少數(shù)雜草仍保持綠色。苗期藥后25和35 d時(shí)，未轉(zhuǎn)基因植株‘隴薯3號(hào)’和絕大部分雜草仍處于完全死亡狀態(tài)，極少數(shù)殘存雜草正常生長(zhǎng)，但此時(shí)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的長(zhǎng)勢(shì)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于這些雜草，其生長(zhǎng)基本不受殘存雜草的影響?，F(xiàn)蕾期藥后25 d時(shí)，殘存雜草的種類(lèi)和數(shù)量較苗期增多，并且長(zhǎng)勢(shì)對(duì)馬鈴薯的生長(zhǎng)造成了一定的影響。

馬鈴薯；除草劑抗性；草銨膦；轉(zhuǎn)基因

馬鈴薯系寬行種植作物，生產(chǎn)中的除草作業(yè)主要依靠中耕及人工除草。隨著國(guó)家馬鈴薯“主糧化”戰(zhàn)略的推進(jìn)，馬鈴薯種植面積持續(xù)擴(kuò)大，規(guī)模化種植成為一種趨勢(shì)。然而，隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展和城市化進(jìn)程的加深，大量農(nóng)村勞動(dòng)力進(jìn)入城市，導(dǎo)致農(nóng)村勞動(dòng)力相對(duì)短缺，加之農(nóng)村漸漸富起來(lái)，人工和機(jī)械除草方式成本高。現(xiàn)在通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗除草劑馬鈴薯為這一問(wèn)題的解決提供了一種有效的方法。在馬鈴薯田施用除草劑可以有效滅殺雜草，且對(duì)馬鈴薯沒(méi)有影響。

目前研究最多的抗除草劑基因主要是抗草銨膦的Bar基因，草銨膦是德國(guó)艾格福公司開(kāi)發(fā)的有機(jī)磷類(lèi)滅生性除草劑[1]，因具有殺草譜廣、高效、低毒、易分解、低殘留、對(duì)環(huán)境相對(duì)安全等特點(diǎn)，得到廣泛應(yīng)用[2]。其被植物吸收后，能強(qiáng)烈抑制谷酰胺合成酶（GS）的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氨的迅速積累。進(jìn)而抑制光合反應(yīng)，減少跨膜梯度，使光合磷酸化解偶聯(lián)，隨之葉綠體結(jié)構(gòu)解體，最后整個(gè)植物體死亡[3]。

在前期研究的基礎(chǔ)上，以‘隴薯3號(hào)’及其3個(gè)轉(zhuǎn)Bar基因抗草銨膦株系‘DR1’、‘DR2’和‘DR5’為材料，在苗期和現(xiàn)蕾期用市售草銨膦進(jìn)行葉面噴施，通過(guò)觀(guān)察統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植株以及雜草的變化情況來(lái)評(píng)價(jià)草銨膦對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯的藥害及田間雜草的防治效果，為抗草銨膦馬鈴薯在生產(chǎn)上推廣與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬鈴薯‘隴薯3號(hào)’及其3個(gè)轉(zhuǎn)Bar基因株系‘DR1’、‘DR2’和‘DR3’，微型薯種薯由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究室提供。

1.2 試驗(yàn)藥劑

10%的草銨膦水劑，商標(biāo)百速刀，由浙江永農(nóng)生物科學(xué)有限公司生產(chǎn)。

1.3 田間主要雜草

禾本科狗尾草（Setaira viridis(L.)Beauv.），茄科曼陀羅（Datura stramoniumL.），菊科牛膝菊（Galinsoga parviflora Cav.）、刺兒菜（CephalanoplossegetumL.）和苣荬 菜（Sonchus brachyotus DC.）， 莧 科 反 枝 莧（Amaranthusretroflexus L.），馬齒莧科馬齒莧（Portulaca oleracea L.），藜科灰藜（ChenopodiumglaucumL.）和旋花科田旋花（Convolvulusarvensis L.）等。

1.4 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2016年在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州試驗(yàn)地隔離區(qū)進(jìn)行。7月5日翻耕穴播，每株系3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)4株，小區(qū)面積0.6m2。出苗后分別于7月30日（苗期，本時(shí)期設(shè)有空白對(duì)照，即對(duì)種植‘隴薯3號(hào)’的地塊噴施清水）和8月20日（現(xiàn)蕾期）用10%的草銨膦對(duì)地塊進(jìn)行均勻噴霧，草銨膦使用濃度為400mL/667m2加30 kg水（藥劑使用說(shuō)明為400～600mL/667m2加30～50 kg水），噴藥后定期觀(guān)察統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植株以及各類(lèi)雜草的變化情況。

第一輪調(diào)查分別于8月1日（噴藥前）、8月4日（苗期藥后3 d）、8月10日（苗期藥后9 d）、8月22日（現(xiàn)蕾期藥后3 d）和8月28日（現(xiàn)蕾期藥后9 d）進(jìn)行，目測(cè)轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植株以及各類(lèi)雜草的變化情況。第二輪調(diào)查分別于8月27日（苗期藥后25 d）、9月5日（苗期藥后35 d）和9月14日（現(xiàn)蕾期藥后25 d）進(jìn)行，調(diào)查雜草防效。

雜草所占比例=每種雜草的總數(shù)/所有雜草的總數(shù)×100%

雜草防效=（噴藥前每種雜草的總數(shù)－藥后統(tǒng)計(jì)日當(dāng)天每種雜草的總數(shù)）/噴藥前每種雜草的總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期噴施草銨膦前后轉(zhuǎn)基因、未轉(zhuǎn)基因株系和雜草的變化

8月4日（藥后3 d）目測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系‘DR1’、‘DR2’和‘DR3’所有植株葉色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)良好；未轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株（‘隴薯3號(hào)’）和所有雜草的葉片表面出現(xiàn)枯斑并萎蔫枯黃（圖1B）。8月10日（藥后9 d）目測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系‘DR1’、‘DR2’和‘DR3’仍然葉色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)良好；未轉(zhuǎn)基因植株（‘隴薯3號(hào)’）和所有雜草全部干枯，完全死亡（圖1C）。

圖1 苗期噴施草銨膦前后轉(zhuǎn)基因、未轉(zhuǎn)基因株系和雜草的變化Figure 1 Changes in transgenic and untransgenic plants and weeds after spraying glufosinate-ammoniumat seed ling stage

2.2 現(xiàn)蕾期噴施草銨膦前后轉(zhuǎn)基因、未轉(zhuǎn)基因株系和雜草的變化

8月22日（藥后3 d）目測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系‘DR2’所有植株葉色濃綠（由于試驗(yàn)地隔離區(qū)面積有限，現(xiàn)蕾期只選擇轉(zhuǎn)基因株系‘DR2’和對(duì)照‘隴薯3號(hào)’為試驗(yàn)材料），長(zhǎng)勢(shì)良好；未轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株（‘隴薯3號(hào)’）和所有雜草的葉片表面出現(xiàn)枯斑并萎蔫枯黃（圖2B）。8月28日（藥后9 d）目測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系‘DR2’仍然葉色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)良好；除極個(gè)別雜草保持綠色以外，未轉(zhuǎn)基因植株（‘隴薯3號(hào)’）和絕大部分雜草全部干枯，完全死亡（圖2C）。

2.3 草銨膦對(duì)雜草的防效

馬鈴薯播種后，由于種薯發(fā)芽率的問(wèn)題，導(dǎo)致各株系均有缺苗的情況，出苗數(shù)見(jiàn)表1。從表1和圖1（D和E）可以看出，苗期藥后25 d時(shí)，草銨膦對(duì)狗尾草、曼陀羅、牛膝菊、刺兒菜、苣荬菜、反枝莧和灰藜防效優(yōu)秀，株防效均達(dá)100%；對(duì)馬齒莧防效稍差，株防效平均為82.30%；田旋花防效較差，株防效平均為69.28%。藥后35 d時(shí)，草銨膦對(duì)狗尾草、曼陀羅、牛膝菊、苣荬菜和反枝莧的防效仍然是100%；由于部分雜草的殘存現(xiàn)象，灰藜、馬齒莧和田旋花的防效分別從25 d時(shí)的100%、82.30%和69.28%降低到92.13%、81.03%和53.05%，刺兒菜的防效從25 d時(shí)的100%降低到0。從圖2D可以看出，現(xiàn)蕾期藥后25 d時(shí)，沒(méi)有殘存的狗尾草、曼陀羅、牛膝菊、苣荬菜和反枝莧，但絕大部分馬齒莧、田旋花和刺兒菜仍然存活，而且長(zhǎng)勢(shì)良好，對(duì)馬鈴薯的長(zhǎng)勢(shì)造成了一定的影響。

圖2 現(xiàn)蕾期噴施草銨膦前后轉(zhuǎn)基因、未轉(zhuǎn)基因株系和雜草的變化Figure 2 Changes in transgenic and untransgenic plantsand weedsafter spraying glufosinate-ammoniumatbud flower stage

3 討 論

近年來(lái)，馬鈴薯的轉(zhuǎn)基因育種主要集中在抗蟲(chóng)[4-6]、抗病[7,8]、抗逆[9-11]和品質(zhì)改良[12]等方面，明顯提高了對(duì)病蟲(chóng)的抵抗和防御能力，增強(qiáng)了對(duì)干旱、高鹽和低溫的適應(yīng)性。

Padegimas等[13]將Bar基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入馬鈴薯并進(jìn)行了相關(guān)研究。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)抗除草劑轉(zhuǎn)基因研究在油菜、水稻和小麥等作物上有大量報(bào)道，但關(guān)于抗除草劑轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為了探討草銨膦對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯的藥害及田間雜草的防治效果，本研究分別在苗期和現(xiàn)蕾期對(duì)馬鈴薯田噴施草銨膦，通過(guò)觀(guān)察統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因及其對(duì)照株系和田間雜草的生長(zhǎng)及存活情況做出相關(guān)評(píng)價(jià)。雖然馬鈴薯播種后，由于種薯發(fā)芽率的問(wèn)題，導(dǎo)致各株系均有缺苗的情況，但可以明顯觀(guān)察到藥后9 d時(shí)，草銨膦可殺死未轉(zhuǎn)基因馬鈴薯‘隴薯3號(hào)’的所有植株和所有雜草，但對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的生長(zhǎng)和表型未造成任何傷害。苗期藥后25和35 d時(shí)，沒(méi)有殘存的狗尾草、曼陀羅、牛膝菊、反枝莧和苣荬菜，而灰藜、馬齒莧和田旋花有部分殘存并正常生長(zhǎng)，但此時(shí)馬鈴薯的長(zhǎng)勢(shì)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于這些雜草，其生長(zhǎng)基本不受殘存雜草的影響。表明本研究在苗期所使用的草銨膦濃度不僅對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因‘隴薯3號(hào)’馬鈴薯沒(méi)有藥害，對(duì)田間雜草的防治效果也很理想，這與浦惠明等[14]和魯軍雄等[15]在轉(zhuǎn)基因抗草銨膦雜交油菜上報(bào)道的研究結(jié)果一致。現(xiàn)蕾期藥后25 d時(shí)，草銨膦對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯仍沒(méi)有藥害，但殘存雜草的種類(lèi)和數(shù)量增多，對(duì)馬鈴薯的長(zhǎng)勢(shì)造成了一定的影響。所以苗期施用適當(dāng)濃度的草銨膦防效最佳。

針對(duì)馬鈴薯種植面積日益擴(kuò)大并規(guī)?；N植的趨勢(shì)和農(nóng)村勞動(dòng)力越來(lái)越緊缺的現(xiàn)實(shí)，除草劑的使用將趨向普及化、常規(guī)化。草甘膦（Glyphosate）和百草枯（Paraquat）以往是中國(guó)應(yīng)用最廣泛的滅生性除草劑，而然，隨著抗草甘膦作物的廣泛種植和草甘膦的大面積使用，草甘膦除草效率已呈下降趨勢(shì)，加之雜草抗性的不斷進(jìn)化，使得基于草甘膦的雜草防除系統(tǒng)已岌岌可危。另外，2016年7月百草枯在國(guó)內(nèi)被禁止銷(xiāo)售與使用[16]。而草銨膦因其安全性高等突出優(yōu)點(diǎn)已在日本、韓國(guó)、東南亞、美洲、歐洲等國(guó)家或地區(qū)普遍應(yīng)用，但因其生產(chǎn)工藝復(fù)雜、價(jià)格高昂等因素導(dǎo)致其尚未能在中國(guó)廣泛應(yīng)用。隨著百草枯的禁用和草甘膦除草效率的下降，草銨膦可能將在中國(guó)的化學(xué)除草方面占主導(dǎo)地位。轉(zhuǎn)Bar基因抗草銨膦作物的獲得，

明顯提高了對(duì)施用作物的安全性，人們將越來(lái)越重視抗草銨膦作物的選育和應(yīng)用，本研究為抗草銨膦馬鈴薯在生產(chǎn)上推廣與應(yīng)用提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

表1 田間雜草調(diào)查統(tǒng)計(jì)Table 1 Field weed statistics

[1] 張宏軍,崔海蘭,倪漢文,等.抗草銨膦轉(zhuǎn)基因水稻種的快速檢測(cè)方法的比較[J].生物技術(shù)通報(bào),2003(1):45-48.

[2]趙延存.稻茬移栽油菜田雜草群落發(fā)生規(guī)律及其化學(xué)防除研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[3] 段發(fā)平,梁承鄴,黎垣慶.Bar基因和轉(zhuǎn)Bar基因作物的研究進(jìn)展[J].廣西植物,2001,21(2):166-172.

[4] Haffani Y Z,Overney S,Yelle S,et al.Premature polyadenylation contributes to the poor expression of the Bacillus thuringiensis cry3Cal gene in transgenic potato plants[J].Molecular and GeneralGenetics,2000,264(1-2):82-88.

[5] Bell H A,Fitches E C,Marris G C,et al.Transgenic GNA expressing potato plants augment the beneficial biocontrol of Lacanobia oleracea(Lepidoptera:Noctuidae)by the parasitoid Eulophus pennicornis(Hymenoptera;Eulophidae)[J].Transgenic Research,2001,10(1):35-42.

[6] RumellhartDE,Mcclelland JL.Influence ofplantdevelopmentand environment on transgene expression in potato and consequences for insect resistance[J].Transgenic Research,2001,10(3):223-236.

[7] 王岫芳.馬鈴薯抗晚疫病和病毒病轉(zhuǎn)基因研究現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)馬鈴薯,2006,20(2):111-114.

[8] 張鶴齡.我國(guó)馬鈴薯抗病毒基因工程研究進(jìn)展[J].中國(guó)馬鈴薯,2000,14(1):25-30.

[9] 許昆朋.轉(zhuǎn)CBF3基因馬鈴薯提高抗冷性的研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[10] Dou H O,Xv K,Meng Q,etal.Potato plants ectopically expressing Arabidopsis thaliana CBF3 exhibit enhanced tolerance to high-temperature stress[J].Plant Cell and Environment,2015,38(1):61-72.

[11] 賈小霞,齊恩芳,王一航,等.轉(zhuǎn)錄因子DREB1A基因和Bar基因雙價(jià)植物表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2014,23(3):110-114.

[12] Coetzer C,CorsiniD,Love S,etal.Controlof emzymatic browning in potato(SolanumtuberosumL.)by sense and antisense RNA fromtomato polyphenol oxidase[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001,49(2):652-657.

[13] Padegimas L,Shul'ga O A,Skriabin K G.Creation of transgenic plants Nicotiana tabacumand Solanumtuberosum,resistant to the herbicide phosphinothricin[J].Molekuliarnaia Biologiia,1994,28(2):437-443.

[14] 浦惠明,高建芹,戚存扣,等.油菜抗草丁膦性狀的遺傳與利用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,31(2):15-18.

[15] 魯軍雄,陳社員,官春云,等.轉(zhuǎn)bar基因抗草銨膦油菜對(duì)草銨膦抗性的評(píng)價(jià)[J].作物研究,2013,27(1):33-39.

[16] 凌進(jìn).草銨膦、百草枯、草甘膦對(duì)非耕地雜草的防效比較[J].農(nóng)藥,2014,53(1):613-615.

Phytotoxicity ofG lufosinate-ammoniumApplication on Bar Transgenic Potato and Efficacy on Weed Control in Field

MASheng1,2,3,JIAXiaoxia1,2,3＊,WEN Guohong1,2,3,LIGaofeng1,2,3,QIEnfang1,2,3,LIU Shi1,2,3,
LIZhang1,2,3,LIJianwu1,2,3,ZHANG Rong1,2,3
(1.Potato Research Institute,Gansu Academy ofAgricu lturalSciences,Lanzhou,Gansu 730070,China;2.Gansu Engineering Laboratory o f Potato GermplasmResources Innovation,Lanzhou,Gansu 730070,China;3.Scientific Observation and ExperimentalStation o f Potato Dry Farming In NorthwestChina,ministry ofAgricu lture,The People's Republic of China,Weiyuan,Gansu 748201,China)

ract:Plants of untransgenic and Bar transgenic potato 'Longshu 3'and weeds were treated with glufosinate-ammoniumby foliage spray at seed ling and bud flower stages,respectively,to evaluate phytotoxicity of glufosinate-ammoniumapplication on Bar transgenic potato and efficacy on weed control in field.All the leaves of transgenic plants were very green and grewwell,while all the leaves of untransgenic potatoes and weeds appeared dry spots and wilted at3 d after treatment.At9 d after seed ling stage treatment,all the transgenic plants remained green and grewwell,while all the plants of untransgenic potatoes and weeds died.At 9 d after bud flower stage treatment,all the transgenic and untransgenic potatoes were very green and grewwell,whilemostof the weeds dried to death.At25 and 35 d after seedling stage treatment,except for a fewweeds,all the untransgenic potatoes and most ofweeds died.However,the transgenic potato grewmuch stronger than survivalweeds and their growth was almostnotaffected by survivalweeds.At25 d after bud flower stage treatment,the species and number of survivalweeds increased compared with the seedling stage,and the growth ofpotatoes had been affected by the survivalweeds.

ords:potato;herbicide resistance;glufosinate-ammonium;transgenic

S532

B

1672－3635（2017）06-0353-06

2016-10-11

甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2017GAAS38）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31560412、31060200）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金（CARS-10）。

馬勝（1978-），男，研究實(shí)習(xí)員，主要從事馬鈴薯遺傳育種研究工作。

賈小霞，副研究員，主要從事馬鈴薯遺傳育種與種質(zhì)改良工作，E-mail:289192272@qq.com。