pcDNA3.1/ SjDLC 和pcDNA3.1/mIFN-γ重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)

,， ,2， ,3， ,3，，，*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所 湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)護(hù)理學(xué)院內(nèi)護(hù)教研室；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

pcDNA3.1/ SjDLC和pcDNA3.1/mIFN-γ重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)

高勇強(qiáng)1,陽(yáng)青蘭1，胡麗1,2，梁瑜1,3，劉彥1,3，張愉快1，王可耕1，肖建華1*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所 湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)護(hù)理學(xué)院內(nèi)護(hù)教研室；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室)

目的構(gòu)建日本血吸蟲(chóng)動(dòng)力蛋白輕鏈DNA疫苗和小鼠干擾素真核表達(dá)質(zhì)粒，研究其在HeLa細(xì)胞及動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)。方法設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增獲取動(dòng)力蛋白輕鏈(SjDLC)與干擾素-γ(IFN-γ)基因，克隆于pcDNA3.1真核質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定。將兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，Western blot鑒定其表達(dá)。真核質(zhì)粒經(jīng)左腿股四頭肌免疫小鼠，在末次免疫2周后，PCR法檢測(cè)小鼠肌組織內(nèi)SjDLC和IFN-γ基因，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)基因的表達(dá)，MTT法檢測(cè)T細(xì)胞增殖水平。結(jié)果PCR和雙酶切能檢測(cè)到280 bp的SjDLC基因及480 bp的IFN-γ基因；Western blot顯示在12 kDa和19 kDa處有陽(yáng)性反應(yīng)條帶，與SjDLC和IFN-γ分子量大小一致，兩種基因能在HeLa細(xì)胞中表達(dá)。PCR及免疫組化顯示兩種基因能在小鼠肌肉組織中存在和表達(dá)。MTT法顯示兩種質(zhì)粒均能刺激T細(xì)胞增殖。結(jié)論成功構(gòu)建pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA 3.1/ mIFN-γ真核質(zhì)粒，兩種質(zhì)粒能在HeLa細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)。

DNA疫苗； 動(dòng)力蛋白輕鏈； 干擾素-γ

在血吸蟲(chóng)病防治方面，尋找疫苗候選抗原分子和加強(qiáng)疫苗的保護(hù)效果是血吸蟲(chóng)病研究工作的熱點(diǎn)。本課題組前期通過(guò)構(gòu)建日本血吸蟲(chóng)cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了日本血吸蟲(chóng)新基因即動(dòng)力蛋白輕鏈(dynein light chain of Schistosoma japonicum，SjDLC)基因，并對(duì)其進(jìn)行了初步的生物學(xué)特性研究[1]。細(xì)胞因子具有增強(qiáng)免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答類型的作用，目前已作為佐劑廣泛應(yīng)用，如IFN-γ具有刺激Th1細(xì)胞增殖及抑制Th2細(xì)胞作用，應(yīng)用IFN-γ能調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫向Th1型極化，從而減輕Th2型細(xì)胞免疫所致疾病[2]。為進(jìn)一步研究日本血吸蟲(chóng)pcDNA3.1/SjDLC DNA疫苗及IFN-γ在日本血吸蟲(chóng)感染中的保護(hù)性作用，本研究通過(guò)構(gòu)建pcDNA3.1/ SjDLC及pcDNA 3.1/ mIFN-γ真核質(zhì)粒并鑒定其在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況，為疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑6～8周雌性BALB/C小鼠購(gòu)自長(zhǎng)沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，pcDNA3.1，DH5α由本研究所保存。Trizol購(gòu)于Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于大連寶生物工程有限公司，T4DNA連接酶、BamH I、Hind III、EcoR I限制性內(nèi)切酶購(gòu)于NEB公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒去內(nèi)毒素大量提取試劑盒購(gòu)于OMEGA生物技術(shù)公司，MTT購(gòu)于Sigma公司。

1.2 pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA3.1/mIFN-γ真核質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定根據(jù)DLC基因和mIFN-γ基因序列使用PRIMER5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，在上游引物中引入BamH I 酶切位點(diǎn)(GGATCC)，在下游引物中分別引入Hind III酶切位點(diǎn)(AAGCTT)和EcoRI酶切位點(diǎn)(GGATCC)，其中DLC基因上游引物：5′-CGCGGATCCAGAATGAATGAACGTAAAGCCG-3′,下游引物：5′-CCC AAGCTTTTATCCTGATTTAAATAGTAGAA ATGC-3′，mIFN-γ基因上游引物：5′-CGCGGATCCACAATGAACGCTACACACTGCA-3′，下游引物：5′-CCGGA ATTCTCAGCAGCGACTCCTTTTCC-3′，上述引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

DLC基因擴(kuò)增方法如下，新西蘭兔腹部敷貼法感染尾蚴，42天后取成蟲(chóng)，使用Trizol提取成蟲(chóng)RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。mIFN-γ基因擴(kuò)增方法如下，健康8周齡BALB/c小鼠，無(wú)菌取脾臟后，剪碎放入70 μm細(xì)胞篩孔中，加PBS研磨洗滌；加2mL紅細(xì)胞裂解液裂解10 min，1 700 rpm，離心5 min，棄上清；加入 2 mL 含 10 μL/mL ConA 的完全 RPM I1640培養(yǎng)基于 5% CO237 ℃ 培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)3天；然后收集細(xì)胞提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以兩者cDNA為模板,PCR條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性60 s、58 ℃ 退火60 s、72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)后72 ℃保溫10 min，4 ℃終止反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠鑒定后，純化PCR產(chǎn)物。純化后的產(chǎn)物與pcDNA3.1常規(guī)連接方法連接后，轉(zhuǎn)化至DH5α，篩選陽(yáng)性克隆菌，同時(shí)進(jìn)行BamH I和Hind III雙酶切，鑒定后測(cè)序。

1.3真核質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)HeLa細(xì)胞分別接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔2 mL，5.0×105個(gè)細(xì)胞/孔)，生長(zhǎng)達(dá)90%時(shí)，按照Lip2000說(shuō)明書(shū)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入5倍細(xì)胞體積的 RIPA 裂解液，懸浮細(xì)胞，冰上裂解半小時(shí)，13 000 rpm 4 ℃離心5 min，收集蛋白，SDS-PAG電泳，用半干式電轉(zhuǎn)移法將蛋白電泳條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜，進(jìn)行Western blot分析。一抗為日本血吸蟲(chóng)感染兔血清(1∶1 000稀釋)，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜；TBST液洗膜5 min，重復(fù) 3次，加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶1000稀釋)4 ℃反應(yīng)2 h。洗膜同上，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.4真核質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)的接種及表達(dá)15只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組：pcDNA3.1組、pcDNA3.1 / SjDLC組及pcDNA3.1 / mIFN-γ組，分別經(jīng)左腿股四頭肌注射重組質(zhì)粒，每2周免疫1次，共免疫3次。末次免疫后2周，麻醉后斷頸處死小鼠，取腿部肌肉提取總DNA，PCR法檢測(cè)小鼠肌組織內(nèi)SjDLC和mIFN-γ基因。另取每組小鼠的股四頭肌用4%多聚甲醛固定4 h后,常規(guī)制作石蠟切片，免疫組化法檢測(cè)SjDLC和IFN-γ基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)。

1.5 MTT法檢測(cè)SjDLC和mIFN-γ刺激T細(xì)胞增殖情況末次免疫后2周， 麻醉后斷頸處死小鼠，分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×106/mL，接種于96孔板，每組分別用RPMI1640培養(yǎng)液、SWA(10 μg/mL)和Con A(10 μg/mL)作為刺激物進(jìn)行刺激，于5% CO237 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL) 20 μL培養(yǎng)4 h，800 rpm離心15 min棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，檢測(cè)每孔OD570nm值。

1.6統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pcDNA3.1/ SjDLC及pcDNA3.1/mIFN-γ真核質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

2.1.1 SjDLC和mIFN-γ基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 1%瓊脂糖膠電泳后在280 bp處可見(jiàn)目的條帶，與SjDLC基因大小相符(圖1 A)；在480 bp處可見(jiàn)目的條帶，與mIFN-γ 基因大小一致(圖1 B)。

圖1.SjDLC基因(A)和mIFN-γ 基因(B)PCR的擴(kuò)增M:Marker;1:SjDLC基因擴(kuò)增產(chǎn)物；2：mIFN-γ 基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.1.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SjDLC及pcDNA3.1/mIFN-γ雙酶切鑒定 利用BamH I和Hind III雙酶切方法檢測(cè)到重組質(zhì)粒的兩條目的條帶，條帶大小與PCR 檢測(cè)結(jié)果一致 (圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定M:Marker;1:雙酶切驗(yàn)證pcDNA3.1/ SjDLC質(zhì)粒；2：雙酶切驗(yàn)證pcDNA3.1/mIFN-γ質(zhì)粒；3：雙酶切驗(yàn)證pcDNA3.1質(zhì)粒

2.2 pcDNA3.1/SjDLC及pcDNA3.1/mIFN-γ在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)HeLa細(xì)胞分別接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，按照Lip2000說(shuō)明書(shū)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行Western blot分析。Western blot顯示在12 kDa(圖3A)和19 kDa(圖3B)處有陽(yáng)性反應(yīng)條帶，與SjDLC和IFN-γ分子量大小一致。

圖3 pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA3.1 / IFN-γ在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)A：1:pcDNA3.1; 2:pcDNA3.1/ SjDLC;B：1:pcDNA3.1；2:pcDNA3.1/IFN-γ

2.3 pcDNA3.1/ SjDLC及pcDNA3.1 / mIFN-γ真核質(zhì)粒在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)

2.3.1 PCR法檢測(cè)小鼠肌肉組織中SjDLC和mIFN-γ基因 取腿部肌肉組織提取總DNA，使用SjDLC及mIFN-γ特異性引物，擴(kuò)增各基因，結(jié)果可見(jiàn)能從小鼠肌肉組織中擴(kuò)增出280 bp的SjDLC基因及480 bp的mIFN-γ基因(圖4)。

圖4 PCR法檢測(cè)小鼠肌肉組織中SjDLC及mIFN-γ基因M:DNA Maker;1:pcDNA3.1/ SjDLC;2:pcDNA3.1/ mIFN-γ

2.3.2 免疫組化法檢測(cè)pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA3.1/mIFN-γ在小鼠肌肉組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示各組肌細(xì)胞區(qū)域可見(jiàn)pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA3.1/mIFN-γ在肌肉組織中表達(dá)的棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)顆粒(圖5)。

圖5 免疫組化法檢測(cè)小鼠肌肉組織內(nèi)重組質(zhì)粒的表達(dá)(200×)A:pcDNA3.1; B:pcDNA3.1/ SjDLC; C:pcDNA3.1/ mIFN-γ

2.4 MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞體外增殖試驗(yàn)MTT法結(jié)果顯示：用SWA刺激后SjDLC組和IFN-γ組T細(xì)胞增殖水平均顯著性高于pcDNA3.1對(duì)照組，P<0.05，IFN-γ組高于SjDLC組，P<0.05。Con A刺激組與SWA刺激組比較，P>0.05。RPMI1640刺激后各組T細(xì)胞均不增值，與SWA刺激組比較，P<0.05。見(jiàn)圖6。

圖6 MTT檢測(cè)免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞增值率與pcDNA3.1比較，*：P<0.05，與SWA組比較，#：P<0.05

3 討 論

核酸疫苗是近年來(lái)快速發(fā)展的新型疫苗，將編碼抗原基因或基因片段插入質(zhì)粒載體中構(gòu)成重組質(zhì)粒，直接免疫后，機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞表達(dá)這一抗原，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，達(dá)到抗感染的目的[3]。核酸疫苗能誘導(dǎo)有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，也沒(méi)有死疫苗、減毒疫苗的致病作用，并且生產(chǎn)簡(jiǎn)單，成本低廉，因此受到廣泛青睞。

目前血吸蟲(chóng)病的疫苗研究仍未得到令人滿意的結(jié)果[4]，因此，尋找有效的候選疫苗抗原分子仍然是日本血吸蟲(chóng)疫苗研究工作的重要基礎(chǔ)。血吸蟲(chóng)抗原作為疫苗常常免疫效果有限，為了加強(qiáng)疫苗的免疫效果聯(lián)合佐劑十分重要，運(yùn)用細(xì)胞因子作為佐劑也是目前血吸蟲(chóng)病疫苗研究的方向。

本研究通過(guò)構(gòu)建日本血吸蟲(chóng)SjDLC DNA疫苗及mIFN-γ真核質(zhì)粒，初步研究其在真核細(xì)胞及小鼠體內(nèi)表達(dá)狀況，為尋找有效的候選疫苗抗原分子及應(yīng)用IFN-γ作為佐劑加強(qiáng)血吸蟲(chóng)疫苗免疫接種效果奠定基礎(chǔ)。

日本血吸蟲(chóng)動(dòng)力蛋白輕鏈基因(SjDLC)是由本課題組前期發(fā)現(xiàn)的新基因，已獲得GenBank 登錄號(hào)(AY225851)，該基因序列與曼氏血吸蟲(chóng)DLC基因序列同源性較高，相似性為86%[1]。該蛋白位于血吸蟲(chóng)體被，介導(dǎo)其與“外界分子”的相互識(shí)別，可結(jié)合血吸蟲(chóng)體被需要轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)通過(guò)微管進(jìn)行運(yùn)輸，是血吸蟲(chóng)生存和發(fā)揮免疫逃逸的重要基因之一[5-6]。

IFN-γ主要是由Th1細(xì)胞分泌，具有抗感染、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，能抑制Th2型細(xì)胞免疫，有利于減輕由血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵抗原誘導(dǎo)的Th2型細(xì)胞免疫介導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷[7-8]。

本研究構(gòu)建了pcDNA3.1/SjDLC及pcDNA3.1/mIFN-γ真核質(zhì)粒，通過(guò)PCR和雙酶切方法檢測(cè)到280 bp的SjDLC基因及480 bp的mIFN-γ基因，測(cè)序結(jié)果顯示這兩個(gè)基因的核苷酸序列與GenBank中的序列完全一致。 Western blot顯示在12 kDa和19 kDa處有陽(yáng)性反應(yīng)條帶，與SjDLC和IFN-γ分子量大小一致，說(shuō)明兩種基因能在HeLa細(xì)胞中表達(dá)。PCR能從小鼠肌肉組織中擴(kuò)增出280 bp的SjDLC基因及480 bp的mIFN-γ基因，免疫組化結(jié)果顯示小鼠肌組織中出現(xiàn)兩種蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)顆粒。說(shuō)明pcDNA3.1/SjDLC及pcDNA3.1/ mIFN-γ能在小鼠肌肉組織中存在和表達(dá)，這是疫苗發(fā)揮作用的免疫學(xué)基礎(chǔ)。MTT法檢測(cè)到SjDLC和IFN-γ能顯著性誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和活化。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建的pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA 3.1/mIFN-γ真核表達(dá)質(zhì)粒，能在小鼠體內(nèi)良好表達(dá)，為進(jìn)一步研究其在日本血吸蟲(chóng)感染中的保護(hù)性作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] 劉彥,肖建華,廖力,等.日本血吸蟲(chóng)肌動(dòng)蛋白輕鏈基因的獲得和分析[J].中國(guó)人獸共患病雜志,2004,20 (11):960-962.

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ConstructionandexpressionofthepcDNA3.1/SjDLCandpcDNA3.1/mIFN-γ

GAO Yongqiang,YANG Qinglan,HU Li,et al

(InstituteofPathogenicBiology,MedicalCollege,UniversityofSouthChina；Hengyang421001，Hunan，China)

ObjectiveTo construct the dynein light chain of Schistosoma japonicum DNA vaccine and IFN-γ recombinant plasmid of mice,so as to investigate their expression in HeLa cells and mouse.MethodsA pair of primers designed by PRIMER5.0 software was synthesized;the gene fragments of SjDLC and mIFN-γ were amplified by PCR，and inserted into eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1,where the recombinant plasmids were identified with restrictive enzymes and sequenced.The recombinant vectors pcDNA3.1/SjDLC and pcDNA3.1 /mIFN-γ were transfected into HeLa cells;the expressed proteins were identified by Western blot.These plasmids were injected into BALB /c mice too,the gene of SjDLC and IFN-γ in quadriceps femoris were identified by PCR.The expression of SjDLC,IFN-γ were observed with immunohistochemistry.The proliferation of splenic lymphocytes in mice was detected by MTT.ResultsThe 280 bp of SjDLC gene and 480 bp of IFN-γ gene were observed through PCR and double enzyme digestion;Western blot displayed that positive response bands in 12 kDa and 19 kDa which is consistent with the molecular weight of SjDLC and IFN-γ were successfully expressed in HeLa cells.PCR and immunohistochemistry showed that two genes expressed in mouse muscle tissue.MTT showed that two plasmids could stimulate the proliferation of T cells.ConclusionThe pcDNA /SjDLC DNA vaccine and recombinant plasmid pcDNA /mIFN-γ were successfully constructed and then expressed in HeLa cells and mouse.

DNA vaccine; SjDLC; IFN-γ

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.06.006

2016-07-20；

2017-08-28

湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(編號(hào)：13C824)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2015B415)；湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目(NO.2015-351)；特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(NO.2014-5).

*通訊作者，E-mail:jhxiao223@163.com.

R383.24

A

蔣湘蓮)