橘皮素對PC-12細胞Aβ水平的影響及機制研究

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(1.南華大學醫(yī)學院神經科學研究所、生理學教研室，湖南 衡陽 421001；2.北京航天總醫(yī)院ICU；3.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院廣西桂林；4.湖南中醫(yī)藥高等專科學校湖南株洲；5.南華大學醫(yī)學院心血管疾病研究所；6.南華大學護理學院)

·基礎醫(yī)學·

橘皮素對PC-12細胞Aβ水平的影響及機制研究

歐陽新平1，鄭莉2，周壽紅1，陸素青3，陳歆4，張敏5，何平平6*，唐朝克5*

(1.南華大學醫(yī)學院神經科學研究所、生理學教研室，湖南 衡陽 421001；2.北京航天總醫(yī)院ICU；3.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院廣西桂林；4.湖南中醫(yī)藥高等專科學校湖南株洲；5.南華大學醫(yī)學院心血管疾病研究所；6.南華大學護理學院)

目的觀察橘皮素對PC-12細胞β淀粉樣蛋白(Aβ)水平的影響并探討其可能的機制。方法不同濃度(0.1、1、10、100 μmol/L)的橘皮素，作用不同時間(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h)處理PC-12細胞后，采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)液Aβ40和Aβ42水平，Western blot檢測PC-12細胞三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ABCA1)蛋白水平，RT-PCR檢測PC-12細胞ABCA1 mRNA水平。ABCA1 SiRNA抑制ABCA1蛋白表達。結果10 μmol/L及100 μmol/L橘皮素組Aβ40和Aβ42水平顯著下降，ABCA1蛋白水平明顯增加，而所有組ABCA1 mRNA水平沒有改變。使用100μmol/L橘皮素處理PC-12細胞，處理后ABCA1 mRNA表達與對照組比較差異無顯著性，24 h及48 h組ABCA1水平顯著增加，Aβ40和Aβ42水平顯著下降。使用ABCA1 SiRNA抑制PC-12細胞ABCA1蛋白表達后，ABCA1 siRNA處理組與對照組比較，Aβ40和Aβ42水平顯著增加。結論橘皮素可通過增加ABCA1蛋白來降低PC-12細胞Aβ40和Aβ42水平。

橘皮素； PC12細胞； ABCA1； β淀粉樣蛋白； 阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種在老年人群中發(fā)病率較高且危害性較大的一種神經退行性疾病。目前研究表明，腦內過量的β淀粉樣蛋白(β-Amyloid protein，Aβ)聚集形成老年斑，從而對神經元產生毒性并導致其變性死亡[1]。三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)是一種跨膜蛋白，其主要作用之一是維持細胞內外膽固醇的動態(tài)平衡[2]。研究顯示，在ABCA1敲除小鼠其腦內Aβ水平增加[3]，而ABCA1過表達小鼠則其腦Aβ水平減少[4-5]。因此，現在認為ABCA1可作為治療AD的一個重要潛在靶點，因此尋找一種能有效上調ABCA1表達的物質變得至關重要。橘皮素(Tangeretin)是中國傳統(tǒng)中藥材橘皮中所含的有效成分之一，屬于黃酮類化合物。大量研究表明黃酮類具有抑制細菌、抗腫瘤、抗病毒及抗氧化等廣泛的藥理作用，近年來研究表明同為黃酮類的花青素具有上調ABCA1蛋白的作用[6-7]，那是否橘皮素能通過增加ABCA1表達，進而降低Aβ水平，目前尚未見文獻報道。

1 材料和方法

1.1材料與試劑橘皮素購自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自杭州四季清公司；兔抗鼠ABCA1、β-actin一抗、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗、小鼠特異性ABCA1小干擾RNA(SiRNA)購自Santa Cruz公司；Aβ40和Aβ42ELISA檢測試劑盒采購自美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購于芬蘭Finnzymes公司；其他所有試劑均為國產分析純。

1.2細胞培養(yǎng)PC-12細胞由中山大學生理教研室提供，使用1640培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)在恒溫細胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)內培養(yǎng)細胞。當細胞生長至80%融合時，進行胰酶消化后傳代。當細胞進入對數生長期時，更換培養(yǎng)液，24 h加入1 640培養(yǎng)液(對照)或不同濃度(100 nmol/L 、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L)的橘皮素，作用不同時間(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h)后分別收取上清液凍存?zhèn)溆?。使用RIPA細胞裂解液裂解細胞，4 ℃ 12 000 rpm離心30 min，轉移上清液至新EP管后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 將收集到的細胞培養(yǎng)液離心(4 ℃，12 000 rpm，10 min)，取上清液。使用Aβ40或Aβ42試劑盒進行測定，根據試劑盒說明書采用雙抗體夾心酶標免疫法檢測樣本中Aβ40或Aβ42的水平。先把純化后的抗體包被在96孔板中，制成為固相抗體后，再將Aβ40或Aβ42抗原、生物素化的抗體以及HRP標記的親和素依次加入含有包被抗體的孔中，然后采用底物TMB顯色，顏色的深淺和樣本中的Aβ40或Aβ42呈正向相關。隨后使用酶標儀(設定450nm波長)測定每個樣本吸光度值(OD值)，最后計算出樣本的濃度。

1.4小干擾RNA轉染小鼠特異性ABCA1小干擾RNA(siRNA)由圣克魯斯生物技術公司提供。ABCA1 siRNA：sense 5′-GGAUUUUUUGCUCAGAUUGTT-3′，antisense 5′-CAAUCUGAGCAAAAAAUCCTT-3′。將PC-12細胞放入六孔板(2×106細胞/孔)24 h。使用脂質體2000分別進行轉染48 h。使用Western blot檢測ABCA1siRNA對相應蛋白抑制效果。

1.5蛋白質免疫印跡實驗(Western Blot) 收集細胞，使用預冷的PBS洗滌2次，蛋白裂解液500 μL裂解細胞，冰上孵育30 min后，將樣本于4 ℃、15 000 rpm離心30 min，收集上清，即為細胞的總蛋白。采用BAC法測定蛋白含量。煮沸變性，上樣后進行電泳，電壓為80 mV，在6%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h分離蛋白質。將分離的蛋白質用濕轉法轉膜至硝酸纖維素膜上，10%脫脂牛奶室溫下封閉2～3 h或4 ℃封閉過夜，加入兔抗鼠β-actin(1∶200)、ABCA1(1∶200)一抗孵育4～6 h。使用TBST緩沖液洗膜10 min×3次，隨后加入二抗，孵育2～3 h，TBST緩沖液洗膜10 min×3次。顯影劑顯影后，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描，并進行半定量分析。

1.6 RNA提取和實時定量PCR(Real-time Quantitative PCR，Real-time PCR) 先提取PC-12細胞總RNA，然后使用SYBR綠色熒光測定試劑盒，采用Roche light Cycler Run 5.32 Real-Time PCR系統(tǒng)進行Real-time PCR分析。合成小鼠ABCA1引物序列：5′-GGGTGAACGAGTTTCGGTATG-3′和5′-CTGAAGATGCTTGGCTTTGCT-3′。最后采用ΔΔCt方法進行定量測定。

1.7統(tǒng)計學分析使用均數±標準差表示所得的實驗數據。兩組間的比較采用Student’st檢驗，三組或多組之間的比較采用one-way ANOVA分析。所有數據均使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異具有顯著性標準。

2 結 果

2.1橘皮素減少PC-12細胞Aβ40和Aβ42水平ELISA方法檢測PC-12細胞培養(yǎng)液Aβ40和Aβ42水平(Aβ由膜上剪切生成后進入細胞培養(yǎng)液)。結果顯示10 μmol/L、100 μmol/L組Aβ40和Aβ42水平顯著下降，且100 μmol/L組下降更明顯(圖1A，圖1B);24 h及48 h組Aβ40和Aβ42水平顯著下降(圖1C，圖1D)，說明橘皮素能減少PC-12細胞Aβ40和Aβ42水平。

圖1 橘皮素對PC-12細胞Aβ40及Aβ42水平的影響(n=3) 與對照組比較，*P<0.05

2.2橘皮素增加PC-12細胞ABCA1蛋白水平Western blot和RT-PCR結果顯示10μmol/L、100μmol/L橘皮素組與對照組相比，ABCA1蛋白水平明顯增加(圖2A)，而ABCA1 mRNA水平則沒有改變(圖2C);24 h及48 h組PC-12細胞ABCA1水平顯著增加(圖2B)，ABCA1 mRNA表達與對照組比較差異無顯著性(圖2D)，說明橘皮素增加PC-12細胞ABCA1蛋白水平，但不影響ABCA1 mRNA水平。

2.3橘皮素通過PC-12細胞ABCA1蛋白減少Aβ水平

2.3.1 ABCA1 siRNA抑制效果檢測 Western blot檢測ABCA1 siRNA 后PC-12細胞ABCA1蛋白水平，結果顯示ABCA1 siRNA能有效抑制PC-12細胞ABCA1表達(圖3)。

2.3.2 橘皮素通過PC-12細胞ABCA1蛋白減少Aβ水平 ELISA結果顯示橘皮素處理組與對照組比較，Aβ40和Aβ42水平顯著下降。ABCA1 siRNA處理組與對照組比較，Aβ40和Aβ42水平顯著增加。橘皮素+ABCA1 siRNA處理組與橘皮素處理組比較，Aβ40和Aβ42水平顯著增加(圖4)。說明橘皮素通過PC-12細胞ABCA1蛋白減少Aβ40和Aβ42水平。

3 討 論

橘皮素屬于多甲氧基黃酮類(polymethoxylated flavones，PMFs)，研究證明其具有很強的抗氧化、抗炎、抗癌、抗腫瘤、抗菌及降低膽固醇水平的功能[8-11]。近年來研究表明同為黃酮類的花青素具有上調ABCA1蛋白的作用[9]，那是否橘皮素能通過作用于ABCA1，進而降低Aβ水平，目前尚未見文獻報道。因此，本研究中觀察橘皮素對PC-12細胞ABCA1及Aβ水平的影響。

沉積的Aβ是AD病變中老年斑的核心組成成分，它在AD這種神經退行性疾病的病變過程中起關鍵作用[12-13]。在AD中，Aβ可以導致線粒體功能的破壞、氧化和應激、破壞細胞膜的完整性以及損傷神經軸突運輸和突觸傳遞，最終引起神經元的變性丟失[13]。在這些病理生理過程中，Aβ的產生是其中的關鍵步驟，因此，針對腦內Aβ代謝的調節(jié)是治療AD的一種有效且至關重要的策略[14]。

圖2.橘皮素對PC-12細胞ABCA1蛋白及mRNA的影響(n=3)

圖3 ABCA1 SiRNA對PC-12細胞ABCA1表達的影響

圖4 橘皮素通過PC-12細胞ABCA1蛋白影響Aβ40及Aβ42水平(n=3)與對照組比較，*P<0.05；與橘皮素比較，#P<0.05，##P<0.01

我們研究結果表明橘皮素處理PC-12細胞24 h后，PC-12細胞培養(yǎng)液Aβ40和Aβ42水平顯著降低。說明橘皮素能降低Aβ40和Aβ42水平。

研究表明，一些參與AD病理過程的關鍵因子，例如膽固醇代謝異常會影響淀粉樣前體蛋白(β-Amyloid protein，APP)及β位淀粉樣前體蛋白分解酶1(beta-site APP cleaving enzyme 1，BACE1)的募集[14]。膽固醇代謝的異常和Aβ沉積都與AD的發(fā)生發(fā)展有非常密切的聯(lián)系，而且兩者經常伴隨存在，另外膽固醇代謝的異常會增加Aβ沉積[15]。

ABCA1是調節(jié)細胞膜內外膽固醇平衡的一個非常重要的因子。在腦內，ABCA1可轉運細胞內的膽固醇和磷脂流出細胞外到載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)，并且可以影響apoE的荷脂以及腦內apoE水平。許多研究表明，ABCA1缺乏會增加Aβ水平。Koldamova等研究發(fā)現在過表達APP的APP23和PDAPP模型小鼠中，敲除腦內ABCA1水平可降低apoE荷脂和apoE水平，并增加腦內Aβ40及Aβ42的水平[15]。腦內ABCA1高表達則降低Aβ水平。研究發(fā)現使用促進ABCA1高表達的人工合成藥物T0901317處理APP23轉基因小鼠，可以增加腦內ABCA1蛋白表達并且顯著降低Aβ40和Aβ42的腦水平[15]。本實驗的研究結果也證實了這一點，使用ABCA1 siRNA削弱ABCA1蛋白表達后，PC-12細胞的Aβ40和Aβ42水平顯著增加。因此，ABCA1可以作為降低Aβ水平以及治療AD的一個潛在靶點。

我們使用橘皮素處理PC-12細胞24 h后，ABCA1蛋白水平明顯增加，而ABCA1 mRNA水平則沒有改變，說明橘皮素能增加ABCA1蛋白表達的同時降低Aβ40和Aβ42水平。隨后，使用ABCA1 siRNA抑制ABCA1蛋白表達，結果顯示橘皮素降低Aβ40和Aβ42水平的能力顯著減弱，說明橘皮素能通過增加ABCA1蛋白表達來降低Aβ40和Aβ42水平。因此，橘皮素有望對阿爾茨海默病的治療提供一個方向，其機制有待進一步探討。

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TheinfluenceandmechanismresearchoftangeretinonthePC-12cellbetaamyloidproteinlevels

OUYANG Xinping，ZHENG Li，ZHOU Shouhong，et al

(DepartmentofPhysiology,TheNeuroscienceInstitute,MedicalCollege,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo observe the effect that the Tangeretin on the PC-12 cell beta Amyloid (Aβ) protein levels and discuss the possible mechanism.MethodsUsing different concentrations (0.1,1,10,100μmol/L) of the Tangeretin to treat PC-12 cells at different time (0h,6h,12h,24 h,48 h),the level of Aβ40and Aβ42inthe cell culture were detected by the method of ELISA,the levels of ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) protein in the PC-12 cells were detected by western blot,the levels of ABCA1 mRNA in the PC-12 cells were detected by RT-PCR.After using ABCA1 SiRNA to inhibit the expression of ABCA1 protein.ResultsAβ40and Aβ42levels decreased significantly in 10μmol/L and 100μmol/L Tangeretin group,ABCA1 protein level increased significantly,and ABCA1 mRNA level of all groups didn’t change.With the treatment of 100μmol/L Tangeretin on PC-12 cells,ABCA1 mRNA expression hadn’t significant difference compared with the control group,ABCA1 protein level of 24 h and 48 h group increased significantly,Aβ40and Aβ42levels decreased significantly.ConclusionThe Taneretin can reduce Aβ40and Aβ42levels through increasing ABCA1 protein level.

tangeretin;PC-12 cells;ABCA1;amyloid beta;alzheimer’s disease

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.003

2016-12-25；

2017-03-01

湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2014B393)；湖南省中醫(yī)藥管理局重點項目(201524)；南華大學校內博士啟動基金(2014XQD36、2015XQD37)。

*通訊作者，E-Mail：tangchaoke@qq.com；E-Mail：hpp-612@163.com。

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