乳酸菌利用低聚果糖代謝機(jī)理的研究進(jìn)展*

陳臣，周方方，任婧，艾連中，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)2(光明乳業(yè)股份有限公司研究院，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，200436)

低聚果糖(fructooligosaccharides，F(xiàn)OS)又名寡果糖或蔗果三糖族，是指以2～10個(gè)果糖基為鏈節(jié)，以1個(gè)葡萄糖基為鏈的端基，以果糖基→果糖連接鍵(β(2－1)鍵或β(2－6)鍵)為主體骨架連結(jié)形成的碳水化合物。根據(jù)生產(chǎn)工藝的不同，低聚果糖分為兩種:一種是由蔗糖通過β-果糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基作用來生產(chǎn)的，包括蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的混合物，簡稱為GFn類型的低聚果糖;另一種是菊粉通過內(nèi)切菊粉酶部分水解得到，聚合度范圍在2～10，簡稱為FFn類型的低聚果糖［1］。

低聚果糖除具有一般功能性低聚糖的物理化學(xué)性質(zhì)外，最引人注目的生理特性是它能明顯改善腸道內(nèi)微生物種群比例。由于低聚果糖特殊的糖苷鍵組成，不能夠被消化道的胃酸和酶消化，而直達(dá)大腸，被雙歧桿菌、乳桿菌等選擇性的利用，使其迅速增殖;此外低聚果糖經(jīng)代謝后產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，可以使腸道內(nèi)pH值趨向酸性，抑制外源性致病菌和腸道內(nèi)固有真菌等的生長繁殖。另外，低聚果糖作為一種天然存在的的水溶性膳食纖維，還有降低血清膽固醇，促進(jìn)鈣質(zhì)吸收等功能。因而低聚果糖做為一種最為常用的益生元已被廣泛的應(yīng)用于食品工業(yè)中。

盡管低聚果糖對(duì)雙歧桿菌和乳桿菌的選擇性增殖作用早已被大量體內(nèi)和體外研究證實(shí)，但是乳酸菌的代謝低聚果糖的分子機(jī)理則是近年來剛開始展開研究的。前期研究發(fā)現(xiàn)不同菌株代謝低聚果糖的途徑不同，存在明顯的菌株特異性。因而研究乳酸菌代謝低聚果糖的途徑和代謝過程中產(chǎn)物的變化對(duì)于進(jìn)一步了解乳酸菌的代謝狀況，選擇合適的益生元、益生菌組合均具有重要的借鑒意義。本文在描述乳酸菌代謝低聚果糖的基本途徑之上，分別對(duì)目前雙歧桿菌、乳桿菌及其他乳酸菌利用低聚果糖的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 乳酸菌代謝低聚果糖的基本途徑

乳酸菌代謝低聚果糖基本都是通過兩種方式進(jìn)行的(圖1)，一是低聚果糖完整的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞內(nèi)后再由胞內(nèi)的果糖苷酶進(jìn)行水解;另一種是先由胞外的酶對(duì)低聚果糖進(jìn)行水解，再將水解產(chǎn)物運(yùn)輸入胞內(nèi)。負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)低聚果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括3種:①ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，是一組跨膜蛋白，具有ATP結(jié)合區(qū)域的單向底物轉(zhuǎn)運(yùn)泵，以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式完成多種分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，該系統(tǒng)主要在嗜酸乳桿菌和彎曲乳桿菌中發(fā)現(xiàn);②PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，屬于基團(tuán)移位的一種，磷酸烯醇丙酮酸(PEP)將磷?；D(zhuǎn)移至其糖類底物同時(shí)伴有PTS糖類易位穿過細(xì)菌膜轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)，該系統(tǒng)在桿菌、乳球菌中比較常見。③透性酶系統(tǒng)，屬于主動(dòng)運(yùn)輸?shù)囊环N，透性酶在胞膜外與底物高親和力牢固結(jié)合，在能量供給的條件下，逆濃度差將物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到菌體內(nèi)，該系統(tǒng)主要在雙歧桿菌中發(fā)現(xiàn)。

負(fù)責(zé)水解低聚果糖的酶有多個(gè)(表1)，包括:果糖苷酶(EC 3.2.1.26)，菊粉酶(EC3.2.1.7)，果聚糖酶(EC 3.2.1.65)，果聚糖β-果糖苷酶(EC 3.2.1.80)，2，6-β-果聚糖6-果聚糖水解酶(EC 3.2.1.64)等。盡管這些酶命名和酶分類有所差異，但是他們都是屬于糖苷水解酶32家族和68家族。這些酶一個(gè)共同點(diǎn)是結(jié)構(gòu)中均含有保守域NDPNG、FRDP 和 ECP，催化中心含有 Asp，Glu、Cys等［2］。然而，乳酸菌對(duì)糖類的代謝與其生存環(huán)境息息相關(guān)，因而存在多種類型的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和水解酶系，使得不同種的乳酸菌，甚至同種不同株細(xì)菌之間也存在著差異。

圖1 乳酸菌代謝低聚果糖的基本途徑Fig.1 The basic pathways for fructooligosaccharides metabolism in lactic acid bacteria

2 雙歧桿菌代謝低聚果糖的研究進(jìn)展

大部分雙歧桿菌都可以高效的利用低聚果糖，因而低聚果糖做為一種最常用的雙歧因子，被廣泛的應(yīng)用于增殖雙歧桿菌。雙歧桿菌主要是通過透性酶系統(tǒng)對(duì)低聚果糖進(jìn)行運(yùn)輸，后再通過胞內(nèi)的β-呋喃果糖苷酶進(jìn)行水解［12］。

表1 低聚果糖水解相關(guān)酶系Table 1 β-fructosidases involved in hydrolysis of fructooligosaccharides

雙歧桿菌的果糖苷酶性質(zhì)最早是在B.adolescentis G1［13］中發(fā)現(xiàn)的，后來陸續(xù)報(bào)道了6種來自雙歧桿菌的果糖苷酶。通過比較發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌的果糖苷酶分子質(zhì)量大小存在顯著差異，大部分報(bào)道的在59.4～74.0 kDa之間，然而對(duì) B.infantis JCM no.7007的研究發(fā)現(xiàn)［14］，該菌負(fù)責(zé)水解蔗果三糖和蔗果四糖的果糖苷酶分子質(zhì)量為232 kDa，由3個(gè)75 kDa亞基組成。雙歧桿菌的果糖苷酶最適宜生長溫度一般為37℃，最適pH為5.5～6.5，活性普遍受到Cu2+，Ag+，Hg2+的顯著影響，表明含有巰基的氨基酸基團(tuán)對(duì)于果糖苷酶的活性非常重要。雙歧桿菌的果糖苷酶的一個(gè)顯著特點(diǎn)是對(duì)低聚果糖的親和力顯著強(qiáng)于蔗糖，這與非腸道細(xì)菌來源的果糖苷酶正好相反;此外這些果糖苷酶大部分均不具有轉(zhuǎn)糖基的活性，除了對(duì)B.adolescentis G1的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用GF2做為底物時(shí)，該酶還具有很低的轉(zhuǎn)糖基活性［13］。

雙歧桿菌的果糖苷酶主要作用于果聚糖中非還原末端的β(2-1)糖苷鍵，包括低聚果糖、蔗糖、菊粉、棉子糖等，然而對(duì)B.breve UCC2003的果糖苷酶研究發(fā)現(xiàn)，該酶特異性地水解低聚果糖中葡萄糖和果糖之間的β(2-1)糖苷鍵而對(duì)果糖基之間的糖苷鍵沒有活性，即以葡萄糖為最終產(chǎn)物，這種特性是在雙歧桿菌中第一次被發(fā)現(xiàn)的［15］。除了對(duì)含有β(2-1)糖苷鍵的低聚糖具有水解能力外，少數(shù)雙歧桿菌的果糖苷酶還具有水解細(xì)菌果聚糖(levan)的能力，表明這些酶還可以水解β(2-6)糖苷鍵，但報(bào)道的活性都比較低［3，16］。

雙歧桿菌果糖苷酶的三維晶體結(jié)構(gòu)于2011年被首次解析［17］，研究發(fā)現(xiàn)來自B.longum KN29.1的果糖苷酶具有典型的糖苷水解酶32家族蛋白的結(jié)構(gòu)組成:一個(gè)N-端β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C-端的β-三明治結(jié)構(gòu)域?；钚灾行奈挥讦?螺旋槳結(jié)構(gòu)域中，含有Asp-23和Glu-204分別作為親核供體和酸堿催化劑。與其他報(bào)道的糖苷水解酶32族成員相比，在該酶的結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)獨(dú)有的N-端α-螺旋，推測與雙歧桿菌定殖于人體腸道中有關(guān)。雙歧桿菌果糖苷酶結(jié)構(gòu)的解析有助于我們增加對(duì)雙歧桿菌代謝低聚果糖機(jī)理的理解，同時(shí)也為我們通過基因工程手段改善果糖苷酶的活性打下了基礎(chǔ)。

除了對(duì)果糖苷酶的研究外，在雙歧桿菌利用低聚果糖的生長中發(fā)現(xiàn)，其代謝低聚果糖存在有顯著的代謝阻遏效應(yīng)。在早期的對(duì)3株雙歧桿菌B.adolescentis ATCC 15703，B.longum ATCC 15707 和B.thermophilum ATCC 25525 研 究 中［18］，發(fā) 現(xiàn) 除B.longum ATCC 15707外，另外2株菌的果糖苷酶活性均被葡萄糖和果糖抑制，表明這些糖對(duì)果糖苷酶的表達(dá)存在代謝阻遏效應(yīng)。B.thermophilum ATCC 25525合成果糖苷酶需要菊粉的誘導(dǎo)，表明該菌的代謝調(diào)控是通過誘導(dǎo)/抑制模式進(jìn)行的;而B.adolescentis ATCC 15703是持續(xù)合成果糖苷酶的，表明該菌的通過抑制/去抑制模式進(jìn)行調(diào)控的。對(duì)B.infantis strain ATCC 15697在混合碳源培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)［19］，葡萄糖的存在會(huì)抑制其果糖苷酶的活力，菌株只會(huì)利用葡萄糖而對(duì)蔗糖或低聚果糖均不利用。而在以果糖為碳源的培養(yǎng)基馴化至少5代后，低聚果糖會(huì)和葡萄糖同時(shí)被利用，表明果糖會(huì)誘導(dǎo)相應(yīng)的果糖苷酶。對(duì) B.breve UCC2003［15］的研究發(fā)現(xiàn)，其fos操縱子在蔗糖、低聚果糖為碳源的培養(yǎng)基生長中被激活而被果糖和葡萄糖抑制。根據(jù)同源性的比較和分析，推測該操縱子受到和它臨近的調(diào)控蛋白LacIfos和葡萄糖激酶GlkA的調(diào)控，其具體的調(diào)控機(jī)理尚待研究。

3 乳桿菌代謝低聚果糖的研究進(jìn)展

研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有乳桿菌都能利用低聚果糖，大部分的 L.acidophilus，L.plantarum和 L.casei都能利用低聚果糖，而被廣泛研究的益生菌株LGG卻不能利用低聚果糖，此外常用于生產(chǎn)酸奶的L.delbrueckii subsp.bulgaricus也不能利用低聚果糖［20］。這糾正了曾被廣泛認(rèn)可的低聚果糖可以增殖所有的乳酸菌的誤區(qū)，從而幫助我們更加科學(xué)地選擇合適的益生元和益生菌的組合以達(dá)到最大的效果。

隨著的發(fā)展，表達(dá)譜芯片技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究細(xì)菌在不同環(huán)境應(yīng)激下基因表達(dá)的差異，而乳桿菌代謝低聚果糖的途徑最早是也是通過該方法研究L.acidophilus NCFM［21］提出的。研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)大小為9 Kb的基因簇負(fù)責(zé)L.acidophilus NCFM低聚果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和分解。該基因簇由7個(gè)基因組成，包括一個(gè)LacI家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，MsmR;4個(gè)基因組成的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，MsmEFGK，負(fù)責(zé)低聚果糖從胞外到胞內(nèi)的運(yùn)輸;一個(gè)果糖苷酶BfrA，負(fù)責(zé)胞內(nèi)水解低聚果糖;和一個(gè)蔗糖磷酸酶GtfA。Goh［22］等人采用類似的的手段研究了L.paracasei 1195對(duì)低聚果糖代謝的途徑，比較了該菌在葡萄糖和低聚果糖分別做為唯一碳源下生長的差異。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1個(gè)大小為12 Kb的操縱子，由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(fosR)，4組分果糖/甘露糖特異PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(fosABCD)，1個(gè)假設(shè)蛋白(fosX)和1個(gè)β-果糖苷酶(fosE)基因組成。對(duì) L.plantarum WCFS1的研究則發(fā)現(xiàn)其代謝低聚果糖的途徑與其代謝蔗糖的途徑相類似，由5個(gè)基因組成的基因簇來參與，包括1個(gè)果糖激酶(SacK1)，1個(gè)PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(PTS)，1個(gè) β-果糖苷酶(SacA)、1 個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(SacR)及1個(gè)α-葡萄糖苷酶(Agl2)組成。這些乳桿菌利用低聚果糖的基因都是通過1個(gè)基因簇來控制的，其主要包括轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，水解酶系及相應(yīng)調(diào)控蛋白組成。但是其作用方式卻不盡相同。對(duì)于L.plantarum WCFS1和L.acidophilus NCFM來說，它們是通過先轉(zhuǎn)運(yùn)再水解的方式進(jìn)行的，由于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能力的限制，使得他們對(duì)低聚合度的低聚果糖有更好的利用能力，而不能利用高聚合度的低聚果糖;對(duì)于L.paracasei 1195來說，它是通過先水解再轉(zhuǎn)運(yùn)的方式進(jìn)行的，這就決定了他們對(duì)不同聚合度的低聚果糖都可以利用。然而由于L.paracasei 1195是在胞外進(jìn)行低聚果糖水解的，使得部分水解生成的單糖也可以被周圍的其他共棲菌群所利用，對(duì)其選擇性增殖并不有利。

低聚果糖代謝相關(guān)的基因簇在蔗糖或者低聚果糖存在條件下是共轉(zhuǎn)錄的，但是葡萄糖抑制他們的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。對(duì)于代謝調(diào)控的研究發(fā)現(xiàn)，這些基因簇一方面受到底物誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)控，例如葡萄糖的存在會(huì)使低聚果糖相關(guān)基因簇轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子磷酸化程度不夠，從而造成相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄受到抑制;另一方面葡萄糖通過PTS轉(zhuǎn)運(yùn)，會(huì)造成大量果糖1，6-二磷酸的產(chǎn)生，它會(huì)使HPr蛋白磷酸化，而磷酸化的HPr蛋白做為輔助阻遏物和代謝控制蛋白A(CcpA)一起與位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的代謝反應(yīng)元件(cre)結(jié)合來抑制該操縱子的轉(zhuǎn)錄［23］。

通過基因結(jié)構(gòu)和序列比較，發(fā)現(xiàn)乳桿菌利用低聚果糖的能力并不是與生俱來的。NCFM的低聚果糖代謝基因簇與Streptococcus mutans的msm操縱子和Streptococcus pneumoniae的raf操縱子有很大的相似性。而對(duì)L.plantarum WCFS1的研究發(fā)現(xiàn)，該菌的果糖苷酶和PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)與其他乳桿菌相比差異很大，但是卻與Pediococcus spp.相關(guān)基因有很高的相似性。這些結(jié)果表明這些他們在環(huán)境中可能通過水平轉(zhuǎn)移方式從共棲的微生物中獲得利用低聚果糖的能力。

對(duì)乳桿菌的果糖苷酶報(bào)道相對(duì)較少，Muller［10］于2002年從L.pentosus B235發(fā)酵上清中分離得到胞外的果聚糖-β果糖苷酶(EC 3.2.1.80)，該酶分子質(zhì)量為126 kDa，對(duì)β(2-6)果糖苷鍵活力最強(qiáng)，也可以水解β(2-1)果糖苷鍵。該酶可由蔗糖、大蒜低聚糖和菊粉等誘導(dǎo)，但是受到葡萄糖抑制。對(duì)乳桿菌L.paracasei 1195的研究發(fā)現(xiàn)，該菌果糖苷酶N端包含信號(hào)肽，在C端包括細(xì)胞壁錨定位點(diǎn)LPQAG，表明該酶是位于細(xì)胞壁表面的胞外酶。在大腸桿菌克隆表達(dá)該酶的核心區(qū)域，發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)細(xì)菌果聚糖中的β(2-6)果糖苷鍵活力最強(qiáng)，隨后是低聚果糖、菊粉，對(duì)蔗糖的水解能力最弱，該酶的廣泛的底物特性預(yù)測與其催化中心中含有特殊的氨基酸集團(tuán)Ser-472、Gln-475、Tyr-476 有關(guān)［24］。

4 對(duì)其他乳酸菌的研究

關(guān)于其他類乳酸菌代謝低聚果糖的研究較少，主要集中在鏈球菌屬。在早期研究乳酸菌和雙歧桿菌的實(shí)驗(yàn)中，四株S.thermophilus均不能使添加了的溴甲酚紫的以低聚果糖為碳源的培養(yǎng)平板變色［20］，而采用同樣的方法則發(fā)現(xiàn)S.thermophilus NCIM 2904能在低聚果糖為碳源的培養(yǎng)基上生長［25］。Hartemink［26］等發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬的部分菌株 S.mutans、S.gordinii和S.mitis能利用低聚果糖，其中S.mutans和S.gordonii能降解所有的低聚果糖，而S.mitis主要水解的是Fn類型的低聚果糖。這些結(jié)果表明鏈球菌屬代謝低聚果糖也具有明顯的菌株特異性。

5 展望

低聚果糖作為一種典型的益生元，在調(diào)節(jié)腸道菌群方面的卓越功效已經(jīng)得到公認(rèn)。然而由于腸道菌群組成數(shù)量多且十分復(fù)雜，非益生菌群如擬桿菌等也具有利用低聚果糖的能力，因而選擇特定的具有選擇性增殖益生菌能力益生元就十分重要。同時(shí)不同乳酸菌代謝低聚果糖都有其菌種特異性，因而需要探索不同乳酸菌利用低聚果糖的途徑，選擇最合適的乳酸菌/低聚果糖組合以達(dá)到更大的益生效應(yīng)。此外，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌代謝低聚果糖存在著多種調(diào)控機(jī)制，如何合理利用調(diào)控機(jī)制促進(jìn)低聚果糖更好地被乳酸菌利用也是未來研究的重點(diǎn)。隨著新技術(shù)手段的發(fā)展，特別是基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的應(yīng)用，將為研究益生乳酸菌與益生元的相互作用提供更好的平臺(tái)，促進(jìn)益生菌和益生元在腸道內(nèi)發(fā)揮更大的作用，為人類造福。

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