應(yīng)用γH2AX評估消炎痛對胃癌SGC-7901細(xì)胞DNA損傷的影響

賈金海，何英輝，李 勇，李紅蕖，彭子衡，張曉琳*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)門診部，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

·論著·

應(yīng)用γH2AX評估消炎痛對胃癌SGC-7901細(xì)胞DNA損傷的影響

賈金海1，何英輝1，李 勇2，李紅蕖1，彭子衡3，張曉琳3*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)門診部，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

目的以磷酸化組蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX,γH2AX)為檢測指標(biāo)，觀察分析非甾體類抗炎藥物消炎痛對體外胃癌SGC-7901細(xì)胞DNA損傷的影響。方法分別選用消炎痛終濃度為0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L的培養(yǎng)液孵育體外培養(yǎng)的SGC-7901胃癌細(xì)胞，孵育時間均設(shè)置為0 h、12 h、24 h和48 h，處理結(jié)束，再采用免疫熒光技術(shù)觀察得到各組SGC-7901細(xì)胞的平均γH2AX焦點數(shù)和γH2AX焦點細(xì)胞率，采用Western-Blotting技術(shù)檢測各組SGC-7901細(xì)胞的γH2AX蛋白水平。結(jié)果不同組細(xì)胞的平均γH2AX焦點數(shù)和γH2AX焦點細(xì)胞率均呈先升高后降低趨勢，其組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。γH2AX蛋白水平亦呈先升后降趨勢，24 h組SGC-7901細(xì)胞γH2AX蛋白水平最高，與其他各時間組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論以γH2AX作為標(biāo)志物，評估化學(xué)藥物對腫瘤細(xì)胞損傷的研究思路具有可行性和可操作性。

胃腫瘤；非甾體類抗炎藥； DNA斷裂，雙鏈

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.021

多項流行病學(xué)調(diào)查顯示，胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，胃癌發(fā)病率排在所有惡性腫瘤的第4位，胃癌病死率更是位列全球癌癥死亡譜的第2位[1-2]。目前，胃癌治療的主要手段仍是以外科手術(shù)輔以化學(xué)藥物治療。近年來的研究表明，非甾體類抗炎藥不僅能明顯降低胃腸道腫瘤的發(fā)生風(fēng)險，還具有明顯的抑制腫瘤生長作用[3]，其機制可能與抑制胃癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)有關(guān)[4]。磷酸化組蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX,γH2AX)是檢測DNA雙鏈斷裂存在的“金標(biāo)準(zhǔn)”，一個γH2AX焦點就代表著一處DNA雙鏈斷裂，γH2AX的焦點數(shù)越多，表明細(xì)胞內(nèi)的DNA雙鏈斷裂越多[5-6]。本研究以γH2AX為檢測指標(biāo)，探討非甾體類代表性藥物消炎痛對體外胃癌細(xì)胞DNA損傷的影響。

1 資 料 與 方 法

1.1主要實驗材料、試劑及設(shè)備 胃癌細(xì)胞SGC-7901購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，小鼠抗人γH2AX單克隆抗體、小鼠抗人β-actin單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，消炎痛為北京東亞生物制品研究所產(chǎn)品，F(xiàn)V1000激光共聚焦掃描顯微鏡為OLYMPUS公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組 選用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μmol/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基復(fù)蘇傳代后，接種于100 mL培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，加入消炎痛處理，并使各實驗組培養(yǎng)液終濃度分別達(dá)0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L，分別于繼續(xù)孵育至12 h、24 h、48 h時，收集細(xì)胞用于實驗。每組實驗重復(fù)3次。

1.3激光共聚焦掃描顯微鏡檢測γH2AX焦點 應(yīng)用倒置生物顯微鏡計數(shù)SGC-7901胃癌細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×107個/mL，然后按照每孔2 mL的體積，接種SGC-7901細(xì)胞至已放有蓋玻片的6孔板中，選用含有不同濃度消炎痛藥物的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞，待各組干預(yù)結(jié)束，用4%多聚甲醛冰上固定細(xì)胞30 min，PBS溶液洗滌，0.2% Triton-X 100破膜15 min，PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，5 min/次，山羊血清工作液37 ℃封閉細(xì)胞1.5 h，一抗4 ℃孵育細(xì)胞過夜，熒光二抗孵育細(xì)胞1 h，DAPI室溫避光孵育細(xì)胞10 min，待其自然涼干，加入抗淬滅劑，用激光共聚焦掃描顯微鏡計數(shù)細(xì)胞，每組至少計數(shù)100個細(xì)胞，之后用Image Pro Plus軟件計算各組平均γH2AX焦點數(shù)和γH2AX焦點細(xì)胞率。平均γH2AX焦點數(shù)=γH2AX焦點總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)，γH2AX焦點細(xì)胞率=含γH2AX焦點的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4Western-Blotting技術(shù)檢測γH2AX蛋白 應(yīng)用倒置生物顯微鏡計數(shù)SGC-7901胃癌細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整1×107個/L，按照每瓶4 mL的體積，接種各組SGC-7901細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，待處理因素干預(yù)結(jié)束，棄掉培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS溶液漂洗細(xì)胞3次，每次5 min，細(xì)胞刷刮取細(xì)胞，然后將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，4 ℃、1 000 g條件離心細(xì)胞溶液3 min，棄上清，每管加入裂解液A溶液1 mL(用前加PMSF，終濃度為1 mmol/L)，渦旋振蕩15 s，冰浴15 min，每管加入NP-40溶液6 μL，振蕩混勻，4 ℃、12 000 g條件離心5 min，棄盡上清，每管再加入裂解液B溶液0.1 mL(用前加PMSF，終濃度1 mmol/L)，渦旋振蕩15 s，冰浴20 min，4 ℃、12 000 g條件離心20 min，上清液即為核蛋白提取液。采用Lowry法定量蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行15%的SDS-PAGE凝膠電泳，4 ℃、80 V條件濕轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜(NC膜)1 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，小鼠抗人γH2AX單克隆抗體孵育細(xì)胞2 h，Tween-PBS溶液(PBS溶液中加入0.05%Tween-20)洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體孵育細(xì)胞1 h，Tween-PBS溶液洗膜3次，最后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影、定影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描計算各組灰度值，內(nèi)參蛋白選用β-actin。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較分別采用F檢驗、SNK-q檢驗和重復(fù)測量的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1平均γH2AX焦點數(shù)比較 各時點平均γH2AX焦點數(shù)均呈先升高后降低趨勢，其組間、時點間、組間·時點間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2γH2AX焦點細(xì)胞率比較 各時點γH2AX焦點細(xì)胞率均呈先升后降趨勢，其組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 不同濃度組各時間點平均γH2AX焦點數(shù)比較 個)

表2不同濃度組各時間點γH2AX焦點細(xì)胞率比較

組別0h12h24h48h 0μmol/L 24.61±2.4424.31±3.8525.90±1.2223.84±3.06200μmol/L 24.31±3.8535.93±1.0446.55±2.6737.26±1.38400μmol/L 25.90±1.2247.47±1.8875.89±2.4852.62±2.12600μmol/L 23.84±3.0642.46±3.2158.21±2.8947.72±2.10組間 F=261.152 P=0.000時點間 F=220.218 P=0.000組間·時點間F=39.321 P=0.000

2.3不同組γH2AX蛋白水平比較 不同時間組γH2AX蛋白水平呈先升高后降低趨勢，0 h組低于12 h組、2 4h組和48h組(P<0.05)，12 h組低于24h組、48h組(P<0.05)，48 h組與24 h組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3不同時間γH2AX蛋白水平比較

組別γH2AX蛋白0h9.620±1.81212h17.570±2.070*24h37.577±2.724*#48h33.687±2.152*#F106.979P0.000

*P<0.05與0 h比較 #P<0.05與12 h比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

DNA損傷有多種形式，包括DNA單鏈斷裂、DNA與DNA的交聯(lián)、DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)、DNA雙鏈斷裂等，其中，雙鏈斷裂是DNA損傷中最為嚴(yán)重的形式，會影響DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA遺傳物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，具體表現(xiàn)為染色體重排或染色體缺失，雙鏈斷裂若得不到及時修復(fù)，最終會導(dǎo)致細(xì)胞的增殖抑制直至凋亡[7]。研究表明，外部環(huán)境和生物體自身因素，如電離輻射、遺傳毒性化學(xué)物質(zhì)、化療藥物等，均可以誘發(fā)雙鏈斷裂的發(fā)生[8]。真核細(xì)胞DNA是與組蛋白以核小體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，組蛋白主要包括H1、H2A、H2B、H3和H4五種。組蛋白H2AX是組蛋白H2A的一個亞型，其羧基末端有一段高度保守的絲氨酸-谷胺酰胺-谷氨酸結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中的139位絲氨酸可以被磷脂酰肌醇-3-激酶家族的成員如毛細(xì)血管共濟(jì)失調(diào)突變基因、DNA依賴性蛋白激酶等磷酸化。雙鏈斷裂發(fā)生后，被DNA損傷感應(yīng)因子識別，感應(yīng)因子磷酸化毛細(xì)血管共濟(jì)失調(diào)突變基因，磷酸化的毛細(xì)血管共濟(jì)突變基因又磷酸化雙鏈斷裂處的組蛋白H2AX上述結(jié)構(gòu)域中的139位絲氨酸，從而形成磷酸化組蛋白H2AX，即γH2AX[9-10]。γH2AX可以從雙鏈斷裂處向兩端擴(kuò)散，形成可以通過免疫標(biāo)記并在熒光顯微鏡下觀察到的γH2AX焦點。γH2AX焦點與雙鏈斷裂在數(shù)量上存在一一對應(yīng)關(guān)系，在真核細(xì)胞的整個周期中均可檢測到，γH2AX分析技術(shù)已成為檢測雙鏈斷裂的金標(biāo)準(zhǔn)[11-13]。

消炎痛，又名吲哚美辛，是非甾體類抗炎藥的代表性藥物，流行病學(xué)、動物模型和臨床研究均發(fā)現(xiàn)，長期使用非甾體類抗炎藥對消化道腫瘤有抑制作用[14-15]。本研究以γH2AX為檢測指標(biāo)，觀察消炎痛與胃癌SGC-7901細(xì)胞雙鏈斷裂的關(guān)系，結(jié)果顯示隨培養(yǎng)液中消炎痛濃度增加，SGC-7901細(xì)胞平均γH2AX焦點數(shù)和γH2AX焦點細(xì)胞率均呈升高趨勢，至400 μmol/L時，平均γH2AX焦點數(shù)和γH2AX焦點細(xì)胞率達(dá)到最高值，顯著高于200 μmol/L組(P<0.05)和600 μmol/L組(P<0.05)；同時，隨消炎痛溶液孵育時間延長，SGC-7901細(xì)胞平均γH2AX焦點數(shù)和γH2AX焦點細(xì)胞率亦均呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢，以孵育24 h組為最高，顯著高于12 h組(P<0.05)和48 h組(P<0.05)。表明消炎痛作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞，致其細(xì)胞核中γH2AX焦點變化的效應(yīng)具有濃度依賴性和時間依賴性。此外，析因方差分析結(jié)果還表明，消炎痛致SGC-7901細(xì)胞γH2AX焦點變化的作用濃度和作用時間具有顯著的協(xié)同效應(yīng)(P<0.05)。

免疫熒光結(jié)果確定了消炎痛作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞的最佳濃度是400 μmol/L，最佳時間是24 h。在此條件下，本研究進(jìn)行了Western-Blotting實驗，觀察了經(jīng)含消炎痛培養(yǎng)液孵育后，胃癌SGC-7901細(xì)胞γH2AX蛋白的表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示 隨作用時間延長，γH2AX蛋白相對表達(dá)水平呈先升后降趨勢，24 h組的蛋白水平明顯高于其他各組(P<0.05)。表明了消炎痛對胃癌SGC-7901細(xì)胞γH2AX變化的影響。

γH2AX是DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志，與雙鏈斷裂數(shù)量呈1∶1關(guān)系，能夠快速而敏感地反映DNA的受損情況[16]。本研究以γH2AX為檢測指標(biāo)，間接評估了非甾體類抗炎藥物消炎痛對胃癌SGC-7901細(xì)胞DNA損傷的影響，結(jié)果顯示以γH2AX作為標(biāo)志物，評估化學(xué)藥物對腫瘤細(xì)胞損傷的研究思路具有可行性和可操作性。

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2017-06-16；

2017-07-24

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目(Z2012079)

賈金海(1976-)，男，河北曲周人，河北醫(yī)科大學(xué)門診部副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事消化系統(tǒng)疾病診治研究。

*通訊作者

R735.2

B

1007-3205(2017)12-1448-03

劉斯靜)