短時受精失敗或低受精率周期不同受精來源卵母細(xì)胞發(fā)育潛能比較

王 娜，李澎濤，邢 鵬，殷晨星

(河北省保定市婦幼保健院生殖中心，河北 保定 071000)

·論著·

短時受精失敗或低受精率周期不同受精來源卵母細(xì)胞發(fā)育潛能比較

王 娜，李澎濤，邢 鵬，殷晨星

(河北省保定市婦幼保健院生殖中心，河北 保定 071000)

目的評估常規(guī)體外受精(in vitro fertilization，IVF)受精失敗或低受精率周期中自然受精卵母細(xì)胞與補救受精卵母細(xì)胞受精后發(fā)育潛能及預(yù)后。方法對短時受精失敗或低受精率的117個周期不孕癥患者資料進(jìn)行回顧分析，比較自然受精卵母細(xì)胞(A組)與補救受精卵母細(xì)胞(B組)受精后的異常受精率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、胚胎利用率、著床率、妊娠率及多胎妊娠率。結(jié)果A組優(yōu)質(zhì)胚胎率高于B組(P<0.05)；2組異常受精率、2PN卵裂率、囊胚形成率、胚胎利用率、著床率、妊娠率、多胎妊娠率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論對常規(guī)IVF短時受精失敗或低受精率卵母細(xì)胞進(jìn)行早補救卵胞漿內(nèi)單精子注射可獲得與自然受精卵母細(xì)胞相似的發(fā)育潛能及臨床結(jié)局。

體外受精；胚胎移植；卵母細(xì)胞

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.026

體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET) 技術(shù)為眾多不孕不育夫婦提供了一個新的、有效的治療方法，與IVF相比短時受精可以明顯提高臨床妊娠率及胚胎種植率[1]，目前國外報道有10%～20%IVF周期受精完全失敗或受精率<20%[2]，國內(nèi)報道為3%～5%[3]。多種原因可以造成受精失敗，男性生育能力下降，精卵結(jié)合能力降低或完全障礙是造成受精失敗的首要原因；精卵結(jié)合障礙導(dǎo)致受精失敗的另一重要原因是卵母細(xì)胞透明帶表面缺乏精子受體[4]。在短時受精聯(lián)合早補救卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術(shù)之前，晚補救即D1補救ICSI的受精率、妊娠率均很低，尤其抱嬰回家率低。將補救ICSI的時間提前至加精后6 h，通過觀察第二極體(2PB)是否釋放判斷受精，可明顯提高卵子受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及患者妊娠率。為比較短時受精失敗或低受精率周期不同受精來源卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，本研究回顧分析行短時受精失敗或受精率低于30%的低受精率周期，比較不同受精途徑的胚胎繼續(xù)發(fā)育的卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、胚胎著床率及胚胎移植后的臨床結(jié)局。報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2013年3月—2016年5月我院生殖中心短時受精完全失敗或低受精率117個周期所獲卵1 438枚，1 103枚成熟卵母細(xì)胞，252枚卵子自然受精(自然受精卵母細(xì)胞組，A組)，972枚卵子進(jìn)行早補救ICSI受精738枚(補救受精卵母細(xì)胞組，B組)。A組女方年齡(31.38±3.94)歲，B組女方年齡(29.67±4.00)歲。男方精液處理后前向運動精子總數(shù)≥1×106條，女方基礎(chǔ)促卵泡激素<12 U/L。

1.2方法 卵子來源：女方采用常規(guī)長方案、短方案或超長方案降調(diào), 重組人促卵泡生成素促卵泡生長。依據(jù)陰道B超和血激素值監(jiān)測卵泡生長。當(dāng)有4個以上>18 mm 卵泡時給予絨毛膜促性腺激素10 000 U，36 h 在超聲引導(dǎo)下取卵。精子來源：男方禁欲3～7 d手淫取精，采用密度梯度-上游法收集精子。精卵共培養(yǎng)：獲卵3.5 h后采用群受精法授精，受精濃度為10～30萬/mL。精卵共孵育4 h，觀察2PB釋放。當(dāng)2PB卵母細(xì)胞數(shù)為0判斷為受精失??；當(dāng)2PB卵母細(xì)胞數(shù)小于成熟卵母細(xì)胞總數(shù)的30%，需延長受精觀察時間至加精后6 h，如仍未達(dá)到30%，判斷為低受精率，即刻行補救性ICSI。補救受精后18 h觀察原核。

胚胎評級：IVF第3天卵裂期胚胎評級，胚胎評級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 胚胎評級標(biāo)準(zhǔn)

胚胎選擇：選擇可移植及可冷凍胚胎，優(yōu)先選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植，剩余優(yōu)質(zhì)胚胎冷凍保存，非優(yōu)質(zhì)胚胎繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，選擇可冷凍的囊胚玻璃化冷凍保存。判斷妊娠：胚胎移植后14 d檢測血絨毛膜促性腺激素，移植后30 d陰道B超見宮內(nèi)孕囊診斷為臨床妊娠。

1.3觀察指標(biāo) 異常受精率=(1PN數(shù)+3PN數(shù))/獲MⅡ卵總數(shù)(1PN：一原核；3PN：三原核；MⅡ卵：無核，一個極體的卵母細(xì)胞)。2PN卵裂率=2PN卵裂總數(shù)/2PN數(shù)(2PN：二原核)。優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)。囊胚形成率=囊胚數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)。胚胎利用率=冷凍胚胎數(shù)+移植胚胎數(shù)/卵裂胚胎總數(shù)。著床率=胎囊數(shù)(胚胎著床數(shù))/移植胚胎總數(shù)。妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)。多胎妊娠率=多胎妊娠周期數(shù)/妊娠周期數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

A組優(yōu)質(zhì)胚胎率高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2組異常受精率、2PN卵裂率、囊胚形成率、胚胎利用率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1，2。

表1 2組觀察指標(biāo)結(jié)果比較 (%，胚胎數(shù))

表2 2組胚胎移植后結(jié)局比較 (%，周期數(shù))

3 討 論

IVF-ET是指將同一不孕不育夫婦的卵子和精子取出體外在實驗室的體外培養(yǎng)體系中使其自然結(jié)合、受精形成胚胎，并將胚胎移植到女性子宮內(nèi)以實現(xiàn)妊娠的技術(shù)[5]。1978 年世界首例試管嬰兒誕生，自此IVF技術(shù)經(jīng)歷了30多年的發(fā)展，仍不可避免受精失敗這一難題[6]。IVF技術(shù)中，受精率直接影響后續(xù)臨床妊娠結(jié)局，而影響受精率的因素很多[7]，因為受精是個紛繁復(fù)雜的過程，不僅包括精子的獲能、精子穿過卵丘細(xì)胞和放射冠，而且還包括精子與卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合進(jìn)而引發(fā)頂體反應(yīng)、精子與卵母細(xì)胞融合、卵母細(xì)胞激活、雌雄原核形成等過程[8]，受精過程中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生障礙均可能導(dǎo)致受精失敗。

目前在常規(guī)IVF-ET周期中受精失敗是無法完全避免的，常規(guī)IVF發(fā)生受精失敗的概率為5%～10%[9]，造成常規(guī)IVF低受精和完全不受精的原因尚不明確[10]。

受精失敗的主要原因包括兩類。①各種原因?qū)е碌木訜o法進(jìn)入卵母細(xì)胞：精子功能異常，未能成功穿過透明帶進(jìn)入卵母細(xì)胞；卵母細(xì)胞質(zhì)量差，透明帶增厚、變硬及精子結(jié)合位點的改變導(dǎo)致精子穿透障礙；不孕原因及技術(shù)因素。②卵母細(xì)胞激活失敗即卵母細(xì)胞不能對精子誘導(dǎo)的激活產(chǎn)生反應(yīng)和不能將精子核去濃縮形成雄原核，這類卵母細(xì)胞即使行ICSI操作，仍有2%～3%受精失敗的可能[11]。

趙芳等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞的成熟與否影響IVF受精率，對胚胎的質(zhì)量也有重要影響，進(jìn)而導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)胚胎率降低，可利用胚胎數(shù)減少。Miyara等[14]發(fā)現(xiàn)常規(guī)IVF失敗的卵母細(xì)胞中85.5%卵母細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)精子，顯然精子未進(jìn)入卵母細(xì)胞內(nèi)。鄧華麗等[15]報道不明原因不育夫婦原發(fā)不育者更容易出現(xiàn)IVF受精失敗。本研究亦發(fā)現(xiàn)多年原發(fā)不育癥患者容易出現(xiàn)受精失敗，故對于這部分患者應(yīng)多加關(guān)注，及時補救受精。Swain[16]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)體系的 pH值及其緩沖能力對配子及胚胎的質(zhì)量有嚴(yán)重影響。 因此，認(rèn)為IVF周期中合適的培養(yǎng)基pH值能夠保證得到更好的臨床妊娠結(jié)局[17]。

對受精失敗的補救方法目前有2種，一是受精后20 h 補救ICSI(晚補救); 二是受精后6 h補救ICSI(早補救)。在短時受精結(jié)合早補救ICSI技術(shù)之前，大多采用晚補救ICSI,但其臨床妊娠率極低，可能與卵子的老化有關(guān)。卵子的老化可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞mRNA和蛋白質(zhì)的減少,影響胚胎的發(fā)育,優(yōu)胚率下降。正常情況下微絲主要存在于卵母細(xì)胞質(zhì)的皮質(zhì)區(qū),微絲對減數(shù)分裂時紡錘體的遷移、旋轉(zhuǎn)和原核的靠近起著重要作用,即使受精后有絲分裂紡錘體的行為也受微絲控制[18-19]，而老化的卵母細(xì)胞微絲排列被破壞[20]，故限制了其在臨床中的應(yīng)用。

自2003年短時受精結(jié)合早補救ICSI技術(shù)應(yīng)用于臨床，得到國內(nèi)眾多中心的認(rèn)可及應(yīng)用，在臨床治療效果上取得了與常規(guī)IVF受精相近的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及著床率[21，11]。短時受精結(jié)合早期補救性 ICSI 技術(shù)可較早地發(fā)現(xiàn)受精失敗，早期進(jìn)行ICSI補救，在很大程度上避免了完全受精失敗的發(fā)生，故此項技術(shù)已被越來越多的生殖中心所采用[22]。趙芳等[12]的研究結(jié)果顯示，短時受精聯(lián)合早期ICSI可有效克服常規(guī)IVF受精障礙，顯著提高受精率，獲得良好的妊娠結(jié)局，因此可以作為臨床挽救受精失敗的最佳選擇。

短時受精結(jié)合早補救雖然提高了受精率、妊娠率，但由于短時受精去除顆粒細(xì)胞時的機械刺激對透明帶的損傷導(dǎo)致異常受精率亦明顯增加[23]。同時因為2PB釋放平均時間在受精后2 h 39 min,加精后6 h 90%受精卵釋放極體，但讓10%的卵母細(xì)胞未釋放2PB導(dǎo)致判斷失誤[24]。本研究中受精失敗補救ICSI部分的異常受精率雖然略高于自然受精部分，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。異常受精主要原因是個別卵母細(xì)胞雖然受精但2PB排除延遲，或者是對3級碎極體的判斷失誤而進(jìn)行了補救ICSI，導(dǎo)致多精受精。但受精失敗的自然受精僅10.21%，如果放棄對其補救受精將明顯降低卵母細(xì)胞的利用率，對患者造成巨大的經(jīng)濟損失及精神壓力。對于胚胎的利用上，對第3天的胚胎選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植和冷凍，剩余所有胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)，而對于沒有優(yōu)質(zhì)胚胎的患者除移植胚胎外剩余胚胎皆囊胚培養(yǎng)。冼英杰等[25]的研究中繼續(xù)培養(yǎng)非優(yōu)質(zhì)胚胎至囊胚期，從而有效挑選出哪些非優(yōu)質(zhì)胚胎具有發(fā)育潛能，盡管在此過程中一些可冷凍的非優(yōu)質(zhì)胚胎未發(fā)育成可冷凍囊胚而廢棄，降低了胚胎利用率，造成胚胎浪費，但減少了患者不必要的解凍移植次數(shù)，提高了胚胎的移植效率，降低了患者經(jīng)濟壓力。

本研究2組僅優(yōu)質(zhì)胚胎率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而移植自然受精組胚胎的臨床妊娠率、著床率與移植補救ICSI組胚胎的數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。分析原因可能是由于移植自然受精組數(shù)據(jù)太少，結(jié)果的真實性有待更多的數(shù)據(jù)支持。

本研究也證實了早期補救的時間優(yōu)勢避免了卵子的過度老化，保證了胚胎發(fā)育與內(nèi)膜種植的同步性，理論上有利于臨床結(jié)局的改善。

綜上所述，短時受精結(jié)合早補救ICSI是預(yù)防受精失敗的有效方法，增加了胚胎利用率，減少了無胚胎移植的風(fēng)險，挽救了部分受精失敗，使這類患者的臨床結(jié)局得到了很大改善。雖然早補救ICSI技術(shù)取得了良好的臨床結(jié)局，沒有明顯增加安全性風(fēng)險，但臨床仍需大樣本隨訪。

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2017-03-13；

2017-04-06

王娜(1977-),女,河北保定人，河北省保定市婦幼保健院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事生殖醫(yī)學(xué)研究。

R321.33

B

1007-3205(2017)12-1464-04

趙麗潔)