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    江西某鈾礦堆浸尾渣微生物群落演替研究

    2017-12-22 23:03:48苗瑾超張宏舉
    湖南有色金屬 2017年6期
    關(guān)鍵詞:瓊脂糖鈾礦礦石

    郭 勤,苗瑾超,張宏舉,王 慧,高 蕾

    (新疆大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院阿克蘇校區(qū),新疆阿克蘇 843000)

    江西某鈾礦堆浸尾渣微生物群落演替研究

    郭 勤,苗瑾超,張宏舉,王 慧,高 蕾

    (新疆大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院阿克蘇校區(qū),新疆阿克蘇 843000)

    應(yīng)用16SrDNA基因文庫技術(shù)研究了江西某鈾礦堆浸尾渣冬季到次年夏季微生物群落演替情況。結(jié)果表面:冬季Acidimicrobium ferrooxidans占48.5%,Leptospirillum ferriphilum占17.5%,Xanthomonas albilineans占11.3%,Mycobacterium sp占7.2%,其它異養(yǎng)菌占15.5%。夏季Leptospirillum ferriphilum占87.40%,Nitrobacter winogradskyi占1%,其它異養(yǎng)菌占11.6%,Acidimicrobium ferrooxidans未檢出。

    生物冶金;16SrDNA基因文庫;微生物群落結(jié)構(gòu);鈾礦

    微生物應(yīng)用于冶金工藝能顯著降低能耗,減少投資,縮短工藝流程,降低環(huán)境污染。近年來,國內(nèi)外微生物冶金技術(shù)應(yīng)用于低品位和難處理鈾礦石的浸出取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益,這使得微生物浸鈾技術(shù)[1]成為世界許多國家鈾礦資源提取和鈾生產(chǎn)的支撐性術(shù)。用于鈾礦生物浸出的微生物主要包含氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌、鐵氧化鉤端螺旋菌以及嗜酸性硫桿菌等化能自養(yǎng)菌,還包括一些異養(yǎng)菌,真菌、酵母菌甚至藻類,多種微生物協(xié)同作用促進(jìn)浸礦反應(yīng)的進(jìn)行,構(gòu)成一個(gè)完整的微生態(tài)系統(tǒng)[2]。分析浸鈾過程中礦石表面附著微生物的群落結(jié)構(gòu),可以了解不同微生物在浸鈾過程中發(fā)揮的作用,能夠推測浸鈾過程中不同微生物之間的種間關(guān)系。浸鈾不同階段和不同的調(diào)控工藝會(huì)影響微生物群落結(jié)構(gòu)。通過分析浸鈾過程中各階段的微生物群落結(jié)構(gòu),可以找出最有利于浸鈾的群落分布,確定最佳的調(diào)控工藝。

    自然界中99%的微生物都不能在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)[3],傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)不能反映礦石樣品中微生物的豐度。微生物冶金工藝中大量1環(huán)境微生物的不可培養(yǎng)導(dǎo)致傳統(tǒng)微生物生態(tài)學(xué)在揭示生物冶金工藝中微生物群落結(jié)構(gòu)、生態(tài)功能及其相互關(guān)系的研究存在巨大障礙[4]。近年來由于分子生物學(xué)的理論和技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)中的研究逐步深入,環(huán)境微生物和冶金微生物多樣性的研究有了突破性進(jìn)展,微生物實(shí)時(shí)監(jiān)測和高通量測序技術(shù)的應(yīng)用使得其檢測結(jié)果更加真實(shí),大量以前未知的微生物新物種及其新基因得到鑒定和應(yīng)用。隨著16SrDNA序列分析技術(shù)作為微生物分類系統(tǒng)的主要方法和依據(jù)也得到了業(yè)內(nèi)的認(rèn)同[5]。近年來微生物核糖體DNA數(shù)據(jù)庫的日益完善,16SrDNA基因測序技術(shù)成為細(xì)菌分類和物種分析鑒定的一個(gè)有效工具。16SrDNA基因序列分析、核酸指紋圖譜分析以及建立16SrDNA基因克隆文庫等分子生物學(xué)技術(shù)也為微生物物種多樣性和物種功能基因組的研究提供了嶄新思路。經(jīng)過近幾年的發(fā)展,16SrDNA技術(shù)已經(jīng)日趨成熟,其研究方法更加完善,結(jié)果更加精確[6]。

    江西某鈾礦5 000 t級(jí)微生物堆浸工業(yè)化生產(chǎn)中經(jīng)過酸化、浸出、洗堆三個(gè)步驟后,鈾礦品位從1.76‰降低至0.1‰左右,浸出率達(dá)到90%以上。浸出尾期礦堆采用表面覆蓋薄膜的辦法繼續(xù)放置,讓微生物進(jìn)一步作用于礦堆,達(dá)到提高浸出率、減少環(huán)境污染的目的。采用16SrDNA技術(shù),通過構(gòu)建重組基因文庫,分析礦石表面吸附的細(xì)菌群落和組成,研究該堆浸尾渣從冬春季節(jié)放置6個(gè)月到次年夏季微生物種群的演替和變化規(guī)律,為研究浸鈾微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響因素提供參考。

    1 試驗(yàn)方法

    1.1 樣品來源

    江西某鈾礦微生物堆浸浸出工業(yè)化試驗(yàn)尾期,尾渣礦堆中心,距表面40~50 cm深度的礦石樣品,礦石表面濕潤,呈現(xiàn)顆粒狀,灰白色。第一次取樣時(shí)間為2015年12月23日,第二次取樣為2016年7月11日。

    1.2 礦石表面吸附菌體收集及預(yù)處理

    將25 g礦石樣品放入50 mL無菌離心管中,加入25 mL pH為1.8的無菌水,通過漩渦振蕩器(AVS-100)1 500 r/min反復(fù)多次震蕩,將菌體從礦石表面洗脫。采用GL-21M高速冷凍離心機(jī)2 000 r/min離心 5 min,沉淀細(xì)沙和稀泥;采用 13 000 r/min離心20min沉淀菌體,用pH為8.0的TE緩沖溶液洗滌3次,獲得白色透明的菌體。

    1.3 細(xì)菌全基因組的提取及16SrDNA基因擴(kuò)增

    采用TaKaRa Fast DNA spin kit for soil試劑盒提取總DNA(具體操作見試劑盒說明書)。采用1%瓊脂糖凝膠電泳,90 V電壓,電泳30 min檢測全基因組的提取質(zhì)量。

    16SrDNA是細(xì)菌的系統(tǒng)分類研究中最有用的和最常用的分子鐘,其種類少,含量大(約占細(xì)菌RNA含量的80%),分子大小適中,存在于所有的生物中,其進(jìn)化具有良好的時(shí)鐘性質(zhì),在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性,素有“細(xì)菌化石”之稱。16SrDNA由于大小適中,約1.5 Kb左右,既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異,又能利用測序技術(shù)較容易地得到其序列,故被細(xì)菌學(xué)家和分類學(xué)家接受。采用1387R和27F引物對(duì)和EXtap DNA聚合酶對(duì)細(xì)菌全基因組16S核糖體RNA基因進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增反應(yīng)體系見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳,電壓90 V,電泳30 min左右檢測。

    表1 樣品基因組16SrDNA擴(kuò)增反應(yīng)體系

    反應(yīng)程序:(1)94℃預(yù)熱處理 5 min;(2)94℃變性40 s;(3)47℃退火30 s;(4)72℃延伸90 s;從(2~4),進(jìn)行30個(gè)循環(huán);(5)72℃充分延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳,TAE緩沖體系,電壓90 V,電泳30 min左右。

    1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化回收

    擴(kuò)增產(chǎn)物中除了含有目的基因以外,還含有大量的酶、蛋白質(zhì)等雜質(zhì),需進(jìn)一步純化后才能進(jìn)行克隆文庫的構(gòu)建。通過電泳切膠回收工藝能對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行有效回收:采用2%的瓊脂糖凝膠電泳20~30 min分離DNA片段;在360 nm的紫外波長下,盡可能快地把所需的DNA片段切下來,之后采用TaKaraDNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化?;厥债a(chǎn)物采用在1.5%的瓊脂糖凝膠,90 V電壓電泳20 min,檢測回收效果。

    1.5 重組克隆文庫的構(gòu)建

    取1μL P-easy-T3連接體系,加入4μL回收PCR產(chǎn)物,在25℃溫浴15min。采用translation1感受態(tài)細(xì)胞,42℃,熱激65 s,獲得重組克隆子。重組細(xì)胞均勻涂布于終濃度為100μg/mL AMP(氨芐青霉素)、40μL 2%X-gal和7μL 20%IPTG的新配LB固體培養(yǎng)基中,在37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h,觀察菌落數(shù)目,進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

    1.6 重組克隆文庫16SrDNA基因組的ALU1酶切數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    隨機(jī)挑取陽性克隆120個(gè),采用T7和SP6引物和LATap聚合酶做16SrDNA基因菌落PCR。菌落PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見表2。

    表2 陽性菌落PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

    反應(yīng)程序:LID=105℃,95℃ 4 min,60℃ 1 min[94℃ 40 min,55℃ 40 s,72℃ 1min 30 s]29個(gè)循環(huán),72℃10 min hold 10℃。獲得重組克隆文庫16SrDNA以后采用限制性內(nèi)切酶ALU1于37℃反應(yīng)125 min進(jìn)行酶切分析,酶切反應(yīng)緩沖體系見表3。

    表3 酶切反應(yīng)體系

    酶切反應(yīng)產(chǎn)物在2%濃度的瓊脂糖凝膠,60 V電壓電泳40~50 min,才凝膠成像系統(tǒng)拍照分析統(tǒng)計(jì)。對(duì)酶切圖譜進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì),從實(shí)驗(yàn)室酶切圖譜數(shù)據(jù)庫中對(duì)照,對(duì)未知的圖譜挑取單克隆進(jìn)行測序分析(上海生物工程有限公司)。根據(jù)測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)將統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析對(duì)比。

    2 試驗(yàn)結(jié)果及其分析

    試驗(yàn)稀有度曲線如圖1所示。

    圖1 試驗(yàn)克隆數(shù)目稀有度曲線

    通過圖1可以看出本試驗(yàn)選取的克隆文庫選擇的樣本容量能夠代表整體。

    將酶切結(jié)果以及測序后查詢NCBI數(shù)據(jù)庫后的結(jié)果做統(tǒng)計(jì),統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4、表5。

    通過表4可看出:堆浸結(jié)束初期(冬季)Acidimicrobium ferrooxidans占48%,Leptospirillum ferriphilum占18%,其它異養(yǎng)菌占34%,礦石表面檢測出14種不同的微生物。自養(yǎng)菌比例為66%,異養(yǎng)菌比例為34%。

    通過表5可看出:堆浸尾渣放置6個(gè)月以后(夏季)Leptospirillum ferriphilum占87.4%,存在1%的Sulfobacillus acidophilus,Acidimicrobium ferrooxidans在群落中逐漸消失,其它異養(yǎng)菌的比例為11.6%,礦石表面有9種不同的微生物。自養(yǎng)菌比例為88.4%,異養(yǎng)菌比例為11.6%。

    整個(gè)過程Acidimicrobium ferrooxidans菌的比例逐漸降低,由48%縮減至小于1%,Leptospirillum ferriphilum逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕海?月份的18%上升為87.4%,Sulfobacillus acidophilus等硫氧化細(xì)菌也有一定的繁殖,異養(yǎng)菌的比例由34%降低至11.6%。

    表4 冬季群落結(jié)構(gòu)

    表5 次年夏季群落結(jié)構(gòu)

    3 討 論

    一些研究表明:鈾礦浸出微生物菌群種類和銅礦類似,菌群結(jié)構(gòu)有所不同。影響浸礦微生物群落結(jié)構(gòu)有很多因素,Schrenk等的研究表明Leptospirillum ferriphilum的分布與低pH值緊密相關(guān)。Edwards等利用熒光原位雜交的方法對(duì)位于美國鐵礦的Leptospirillum ferriphilum菌進(jìn)行定量分析,發(fā)現(xiàn)在溫度較高、pH較低的環(huán)境下Leptospirillum ferriphilum比Acidimicrobium ferrooxidans生存得更好[7]。周洪波等的研究表明對(duì)同一pH條件不同的浸出時(shí)間進(jìn)行比較;發(fā)現(xiàn)不控制pH時(shí),開始階段Acidimicrobium ferrooxidans是優(yōu)勢種群,但后期Leptospirillum ferriphilum代替Acidimicrobium ferrooxidans成為優(yōu)勢種群;控制pH時(shí),Leptospirillum ferriphilum始終是優(yōu)勢種。Cecilia S等對(duì)低品位黃銅礦堆浸工藝過程中的生物特性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)演替分三個(gè)過程:從第l到第225 d,Acidithiobacillus ferrooxidans占優(yōu)勢;在第 255 d到598 d,Leptospirillum ferriphilum開始取代 Acidithiobacillus ferrooxidans,成為浸出液中主要優(yōu)勢群體。此后,在第598 d到749 d,類Sulfobacillus屬的菌種成為優(yōu)勢種群[8]。刁夢雪等研究了低品位銅礦柱浸及酸性礦坑廢水微生物群落在高Fe3+濃度下的演替規(guī)律,發(fā)現(xiàn)Acidimicrobium ferrooxidans和Leptospirillum都可利用亞鐵,而且在無三價(jià)鐵離子或低濃度三價(jià)鐵離子條件下Acidithiobacillus ferrooxidans為優(yōu)勢菌群。但在三價(jià)鐵離子濃度較高的情況下,由于Leptospirillum ferriphilum與Acidimicrobium ferrooxidans相比,對(duì)于三價(jià)鐵離子的抑制作用更不敏感,且氧化亞鐵的能力受到抑制更少,因此Leptospirillum ferriphilum比例增加[9]。

    本文研究的體系,冬季采樣之前,礦堆依然在噴淋,環(huán)境中一些異養(yǎng)菌會(huì)通過噴淋液進(jìn)入礦堆內(nèi)部,導(dǎo)致異養(yǎng)菌的比例比較高。礦堆浸出結(jié)束噴淋時(shí)刻浸出液中存在1 g/L左右的Fe2+,前人研究表明:在Fe2+條件情況下有利于Acidithiobacillus ferrooxidans的生長,而Leptospirillum ferriphilum的生長受到抑制。初期由于 Fe2+的存在使得 Acidithiobacillus ferrooxidans菌群比例較高。隨著礦堆放置的過程,礦堆內(nèi)部Fe2+逐漸消耗,在高 Fe3+體系下 Acidithiobacillus ferrooxidans活性受到抑制[10],Leptospirillumferriphilum對(duì)于三價(jià)鐵離子的抑制作用更不敏感,比例會(huì)逐漸增加。在堆浸末期,耗酸物質(zhì)基本消耗完全,堆內(nèi)pH維持在1.5~2.0左右;前人研究認(rèn)為:溫度較高、pH較低的環(huán)境下 Leptospirillum ferriphilum比Acidithiobacillus ferrooxidans生存得更好。從1月份到7月份,環(huán)境溫度逐步升高,堆內(nèi)溫度也相應(yīng)提高,Leptospirillum ferriphilum菌群的比例增加。

    [1] 苑俊廷,孫占學(xué).細(xì)菌堆浸浸鈾技術(shù)的發(fā)展及展望[J].中國礦業(yè),2008,15(6):45-48.

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    The Research of M icrobial Community Succession in Tailings of a Uranium M ine in Jiangxi

    GUO Qin,MIAO Jin-chao,ZHANG Hong-ju,WANG Hui,GAO Lei
    (Xingjiang University Institute of Science and Thechnology Akesu Campus,Akesu 843000,China)

    Using 16SrDNA gene library technology,we studied the succession ofmicrobial communities in a uranium mine tailings during winter to the following summer in Jiangxi.The results surface:Acidimicrobium,ferrooxidans accounted for 48.5%,Leptospirillum ferriphilum accounted for 17.5%,Xanthomonas albilineans accounted for 11.3%,Mycobacterium SP accounted for 7.2%,and other heterotrophic bacteria accounted for 15.5%.In summer,Leptospirillum ferriphilum accounted for 87.40%,Nitrobacter winogradskyi accounted for 1%,other heterotrophic bacteria accounted for 11.6%,and Acidimicrobium ferrooxidans was not detected.

    biologicalmetallurgy;16SrDNA gene library technology;microbial community structure;uranium mine

    TF18

    A

    1003-5540(2017)06-0028-04

    新疆大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院教學(xué)改革項(xiàng)目(2017020101008)新疆大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院2017版本科專業(yè)培養(yǎng)方案項(xiàng)目(2017020101004A5)新疆大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(2017020101009B6)

    郭 勤(1989-),男,講師,主要從事濕法冶金、化學(xué)分析專業(yè)教學(xué)與科研工作。

    2017-09-28

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