兔關節(jié)軟骨細胞的體外培養(yǎng)及凋亡相關基因在傳代細胞中的表達

周葉 高越 王曉楠 朱立 厲蓓

兔關節(jié)軟骨細胞的體外培養(yǎng)及凋亡相關基因在傳代細胞中的表達

周葉 高越 王曉楠 朱立 厲蓓

目的驗證體外Ⅱ型膠原酶消化法培養(yǎng)兔軟骨細胞的可行性，探討凋亡及抗凋亡基因在軟骨細胞傳代中的變化，尋找關節(jié)軟骨退變老化研究的最適宜靶細胞。方法在無菌條件下取6周齡新西蘭大白兔雙側膝關節(jié)軟骨，采用Ⅱ型膠原酶消化并機械吹打的方法分離關節(jié)軟骨細胞并進行原代、傳代培養(yǎng)；形態(tài)學觀察時采用甲苯胺藍染色法對關節(jié)軟骨細胞進行鑒定；RT-PCR法檢測P0～P4代軟骨細胞煙酰胺磷酸核糖轉移酶（NAMPT）、信息沉默因子1（Sirt1）、p53、Bax基因的mRNA相對表達量，四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測各代關節(jié)軟骨細胞增殖情況。結果顯微鏡下觀察兔原代軟骨細胞大多呈透亮橢圓形、短梭形、多角形特征，72h全部貼壁生長。甲苯胺藍染色顯示培養(yǎng)的軟骨細胞細胞質(zhì)染成淺藍色，細胞核染成深藍色；前3代軟骨細胞表型穩(wěn)定，增殖力良好；連續(xù)培養(yǎng)至P4代后，絕大部分細胞變?yōu)殚L梭形和不規(guī)則形狀。隨著軟骨細胞的傳代，NAMPT的表達量逐漸下調(diào)。與P0代軟骨細胞相比，Sirt1的表達量在P1代細胞中明顯上調(diào)，在P2代細胞急劇下降至P0代以下，在P3～P4代細胞中Sirt1的表達量逐漸下調(diào)。凋亡基因p53和Bax的表達量隨著軟骨細胞的傳代而上調(diào)。前3代軟骨細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；在培養(yǎng)到第4～7天時，P1～P3代與P4代軟骨細胞增殖差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論采用體外Ⅱ型膠原酶消化法培養(yǎng)兔關節(jié)軟骨細胞是切實可行的。隨著軟骨細胞的傳代，抗凋亡基因NAMPT、Sirt1的表達逐漸下調(diào)，凋亡基因p53、Bax的表達逐漸上調(diào)。P1～P3代關節(jié)軟骨細胞作為研究關節(jié)軟骨凋亡的細胞體系是合適的。

軟骨細胞體外培養(yǎng)煙酰胺磷酸核糖轉移酶信息沉默因子1傳代

骨關節(jié)炎是一種常見的慢性關節(jié)疾病，其主要病變是骨關節(jié)軟骨的退行性變和繼發(fā)骨質(zhì)增生。軟骨細胞不僅可以合成、分泌基質(zhì)，而且能控制細胞外基質(zhì)的分布，是一種多功能細胞，其凋亡是骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨退變的關鍵因素。因此，骨關節(jié)炎發(fā)病機制相關研究應從軟骨細胞本身入手。目前關于該病的發(fā)病機制、藥物預防及治療的研究多在動物模型中進行，因此從動物關節(jié)中成功獲取關節(jié)軟骨細胞并進行體外培養(yǎng)十分重要。本實驗通過驗證Ⅱ型膠原酶消化法培養(yǎng)兔軟骨細胞的可行性，進一步研究軟骨細胞傳代中凋亡相關基因的變化，以探究其生物學特性，為從軟骨細胞層面開展骨關節(jié)炎研究奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑6周齡新西蘭大白兔1只，體重0.6kg，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。改良杜氏伊格爾（DMEM）完全培養(yǎng)基、FBS（美國GibcoBRL公司），四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Invitrogen公司），甲苯胺藍、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（美國Sigma公司），RT-PCR試劑（日本TAKARA公司），cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix(2X)（立陶宛MBI Fermentas公司），Trizol抽提試劑盒（美國Invitrogen公司），SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TAKARA公司）。RT-PCR引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 原代軟骨細胞提取及培養(yǎng)將新西蘭白兔于耳緣靜脈注射空氣處死。在無菌操作下沿膝關節(jié)內(nèi)側切開關節(jié)囊，暴露關節(jié)面；用手術刀片取關節(jié)表面軟骨，用含青霉素鈉/慶大霉素雙抗液的PBS沖洗數(shù)次；移入超凈臺，將軟骨組織剪碎至1mm3的大小。加入0.25%胰蛋白酶5ml，磁力棒搖蕩消化30min，輕輕吹打棄去上清液，PBS液清洗3次；加入2g/L的Ⅱ型膠原酶5ml并移入消化瓶中，將消化瓶放置恒溫搖箱中，消化3～4h。待大部分細胞游離時，經(jīng)200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾；15ml離心管收集細胞，低溫離心1 000r/min，10min；棄上清液，加入體積分數(shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，使細胞懸液均勻分布。

1.2.2 軟骨細胞的觀察與鑒定取軟骨細胞于倒置顯微鏡下觀察生長情況及形態(tài)變化特點，并進行攝片記錄。取對數(shù)生長期細胞進行細胞爬片，PBS清洗后多聚甲醛固定10min，甲苯胺藍染色30min；最后在顯微鏡下觀察軟骨細胞形態(tài)。

1.2.3 軟骨細胞傳代培養(yǎng)軟骨細胞置于5%CO2混和氣體環(huán)境中，37℃恒溫箱內(nèi)單層培養(yǎng)，隔3d首次換液，傳代培養(yǎng)期間，每2～3d根據(jù)細胞生長情況更換1次完全培養(yǎng)基，待鏡下可觀察到細胞增殖匯集成片，并鋪滿培養(yǎng)瓶底。占底面積70%～80%可進行傳代培養(yǎng)，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞后，按1∶3的比例接種至75cm2培養(yǎng)瓶中，標記為P1代細胞。傳代培養(yǎng)期間，每隔2～3d根據(jù)細胞生長情況更換1次DMEM完全培養(yǎng)基，待鏡下觀察細胞增殖匯集成片，并鋪滿培養(yǎng)瓶底占底面積70%～80%可再次進行傳代培養(yǎng)，標記為P2代細胞。對P0、P1、P2、P3、P4代對數(shù)生長期細胞的增殖情況進行檢測。

1.2.4 軟骨細胞凋亡相關基因檢測采用RT-PCR法。Trizol法提取P0～P4代軟骨細胞RNA并獲得cDNA，冰上混合脫氧核糖核酸嵌合熒光染料（DNA Master SYBR Green I Mix）10μl、上下游引物各0.4μl、雙蒸水5.2μl及cDNA 4μl，輕輕混勻，離心5s后進行RT-PCR檢測。反應條件：50°C預變性2min，95°C變性10min；95°C退火30s，60°C延伸30s，40個循環(huán)。反應完畢后分析產(chǎn)物溶解曲線判斷反應的特異性并通過2-ΔΔCt得到目的基因的mRNA相對表達量。

1.2.5 各代細胞增殖情況檢測采用MTT比色法。將傳代細胞消化且作細胞計數(shù)后，調(diào)整細胞數(shù)量，并接種于96孔培養(yǎng)板中?？瞻渍{(diào)零孔加入0.1ml DMEM，其余各孔加入0.1ml體積分數(shù)10%FBS的DMEM；每孔接種細胞2×103個，每代接種一板，每板接種8列，共接種5板。各培養(yǎng)板置于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。分別于培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168h時取出進行檢測，檢測前4h每孔加入20μl MTT溶液，然后繼續(xù)置于37℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。4h后用移液槍吸掉上清液，加入150μl DMSO，振搖10min，置酶標儀570nm波長測定吸光度值；待吸光度值≥1時，停止檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理應用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件。計量資料用示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 軟骨細胞形態(tài)觀察制備的兔原代軟骨細胞體外培養(yǎng)狀態(tài)下大多呈透亮橢圓形、短梭形、多角形，72h全部貼壁生長，見圖1。

圖1 原代兔膝關節(jié)軟骨細胞形態(tài)（×200）

2.2 軟骨細胞鑒定培養(yǎng)的P0～P4代軟骨細胞均可被甲苯胺藍染色，細胞呈藍紫色，細胞核染色較深，細胞周圍有少量藍紫色異染顆粒出現(xiàn)。軟骨細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，生長速度明顯加快，細胞排列緊密，染色加深，部分細胞形態(tài)變得細長，同時可見較多分裂細胞。連續(xù)培養(yǎng)至P4代后，細胞增殖速度略有減慢，細胞形態(tài)由大多呈細長形、三角形和多邊形，逐漸轉變?yōu)樗笮?、多邊形或不?guī)則形，見圖2。

圖2 P0～P4代兔膝關節(jié)軟骨細胞鑒定（甲苯胺藍染色，×200）

2.3 軟骨細胞傳代過程中凋亡相關基因表達的變化隨著體外培養(yǎng)代數(shù)的增加，抗凋亡基因NAMPT表達逐漸下調(diào)，細胞傳至P4代時，NAMPT的表達量僅為P0代軟骨細胞的3.67%。與P0代軟骨細胞相比，另一抗凋亡基因Sirt1的表達在P1代軟骨細胞中明顯上調(diào)；細胞傳至P2代時，該基因的表達量又急劇下降至P0代以下，P3、P4代軟骨細胞中的基因表達量則逐漸下調(diào)。與上述抗凋亡基因相反，凋亡基因p53和Bax的表達量則隨著軟骨細胞代數(shù)的增加而上調(diào)，見表1和圖3。

2.4 軟骨細胞傳代過程中的增殖情況經(jīng)MTT法檢測，前3代軟骨細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；在培養(yǎng)第4～7天時，P1～P3代與P4代軟骨細胞增殖差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4（插頁）。

表1 P0～P4代軟骨細胞凋亡相關基因的mRNA相對表達量比較

3 討論

圖3 P0～P4代軟骨細胞中相關基因表達變化（注：與P0比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

骨關節(jié)炎是一種慢性進行性關節(jié)疾病，主要表現(xiàn)為軟骨退變、骨贅形成、軟骨下骨重塑及關節(jié)內(nèi)炎癥反應[1]。孫鵬等[2]發(fā)現(xiàn)軟骨細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志蛋白CRP78、CCAAT/CHOP表達升高，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所引發(fā)的軟骨細胞凋亡可能是骨關節(jié)炎發(fā)展的原因之一。在實際臨床工作中，患者關節(jié)軟骨的獲得還是相對困難的，因此我們借助動物細胞來建立實驗細胞模型。本實驗成功地采用體外Ⅱ型膠原酶消化法培養(yǎng)兔關節(jié)軟骨細胞進行研究，證明該實驗方法是切實可行的，且細胞較為純化、增殖能力強、細胞表型不易改變。這與閆虎等[3]、劉振峰等[4]的實驗研究一致。

在細胞的生命活動過程中，細胞增殖與凋亡都離不開信號的傳導，即細胞增殖或凋亡的刺激信號通過細胞外、細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核，最后產(chǎn)生應答的途徑傳導。近年來的研究一致認為p38信號通路是關節(jié)軟骨細胞凋亡的一條重要上游信號通路[5]。p38通過2條途徑使p53蛋白表達增加，從而引起軟骨細胞凋亡：一是磷酸化IKK（IκB的一個上游激酶），從而使NF-κB活化，進而增加p53的轉錄表達；二是直接磷酸化p53的絲氨酸15殘基，穩(wěn)定p53蛋白，使其含量增加。p53通過誘導促凋亡因子Bax的表達，從而引起細胞凋亡[6]。與促凋亡因子相反的是抗凋亡因子。Sirt1是Sir2在哺乳動物的同源基因，是一種依賴NAD＋的組蛋白去乙?；?，能與多種轉錄因子如p53、Ku70、PGC-1等相互作用，調(diào)節(jié)其轉錄活性，與細胞衰老、凋亡、代謝和增殖分化密切相關，Takayama等[7]研究證實Sirt1與人體軟骨細胞凋亡相關。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)SRT1720能夠激活Sirt1，從而抑制軟骨細胞凋亡。劉軍等[9]發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元能激活Sirt1通路，減輕骨關節(jié)炎病理過程中軟骨細胞的線粒體氧化應激損傷，從而發(fā)揮抗骨關節(jié)炎中的軟骨細胞保護作用?？梢?，Sirt1對軟骨細胞的凋亡具有保護作用。NAMPT廣泛表達于人體內(nèi)臟脂肪組織、肌肉、骨骼、肝臟等器官和組織，并表達于神經(jīng)細胞、成纖維細胞、心肌細胞、免疫細胞等多種細胞，可見該蛋白在生理及病理狀態(tài)下均有重要作用[10]。有研究發(fā)現(xiàn)NAMPT通過調(diào)節(jié)Sirt1活性控制相應基因轉錄和眾多代謝過程，具有抗凋亡作用[11]。根據(jù)以上文獻報道，p53、Bax是凋亡基因，而Sirt1、NAMPT是抗凋亡基因。在本實驗中，筆者成功地建立了體外兔關節(jié)軟骨細胞體系，RT-PCR檢測結果表明抗凋亡基因NAMPT及Sirt1的表達量隨著軟骨細胞代數(shù)的增加而下調(diào)，凋亡基因p53及Bax的表達量隨著軟骨細胞代數(shù)的增加而上調(diào)。從基因?qū)W角度證實以上結果，在細胞的傳代過程中，抗凋亡基因和凋亡基因表達的變化是相反的。此外，顯微鏡下觀察及MTT法也發(fā)現(xiàn)關節(jié)軟骨細胞增殖速度隨著傳代逐漸減慢，細胞形態(tài)也變得不規(guī)則。結合顯微鏡下結果和軟骨細胞的增殖曲線證實P1～P3代關節(jié)軟骨細胞作為研究關節(jié)軟骨凋亡的細胞體系是合適的，與相關文獻報道一致[3]。但是本次實驗最終采用的是兔關節(jié)軟骨細胞，若能利用骨科髖關節(jié)及膝關節(jié)蛻變后期行關節(jié)置換術取到的人體細胞進行試驗，結果將更有說服力。

筆者前期臨床實驗已證實，取自《千金方》的獨活寄生湯和《醫(yī)林改錯》的身痛逐瘀湯的諸藥加以化裁而成的“骨痹活絡湯”能明顯改善膝骨關節(jié)炎患者的臨床癥狀，并且對其體內(nèi)炎癥因子NF-κB、基質(zhì)金屬蛋白酶-3

等具有明顯下調(diào)作用[12]。上述方劑內(nèi)含有多種中藥及中藥有效成分。本次實驗檢測結果僅為細胞生物學表現(xiàn)，后期可針對軟骨細胞退變老化信號通路影響進行深入研究，并可在此研究的基礎上進一步使用上述方劑中不同的中藥或中藥有效成分干預關節(jié)軟骨細胞，研究不同藥物對細胞凋亡及信號傳導通路的影響，從分子學角度明確“骨痹活絡湯”中的有效成分及作用，必將有更多的臨床獲益。

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In vitro culture of rabbit articular chondrocytes and expression of apoptosis related genes in passage cells

ZHOU Ye,GAO Yue,WANG Xiaonan,et al.
Department of Comprehensive Health Care,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China

ObjectiveTo verify the feasibility of in vitro culture of rabbit chondrocytes with collagenaseⅡdigestion method and to investigate the changes of apoptosis and anti apoptotic genes in chondrocyte passages.MethodsThe knee joint cartilage was obtained under aseptic condition from 6 week-New Zealand white rabbits.The chondrocytes were isolated and digested with type collagenaseⅡand primary culture and subculture were carried out.The articular chondrocytes were identified by morphological observation with toluidine blue staining.RT-PCR method was used to detect the relative expression of NAMPT,Sirt1,P53 and Bax genes in chondrocytes of various generations,and the proliferation of chondrocytes in articular cartilage was detected by MTT method.ResultsUnder the microscope observation of rabbit articular chondrocytes were mostly in oval translucent,short spindle,polygonal appearance,and the adherent growth was almost completely in 72h.Toluidine blue staining showed light blue cytoplasm and deep blue nuclei in cultured chondrocytes.The first 3 generations of chondrocytes showed stable phenotype and good proliferation.In the fourth generation,most of the cells changed to long spindle and irregular-shaped.With the passage of chondrocytes,the expression of NAMPT decreased gradually.Compared with the P0 generation of cartilage cells,the expression of Sirt1 in P1 cells was significantly up-regulate,then decreased rapidly in P2 cells,and down-regulated in P3-P4 cells.The expression levels of apoptotic genes p53 and Bax were up-regulated with the passage of chondrocytes.MTT showed that there was no significant difference in the proliferation of chondrocytes among the first 3 generations(all P＞0.05).When cultured on day 4-7,the proliferation of chondrocytes was significantly different between P1-P3and P4 generations(P＜0.05).ConclusionIt is feasible to culture rabbit articular chondrocytes by collagenase digestion method in vitro.With the passage of chondrocytes,the expression of anti apoptotic genes NAMPT and Sirt1 decreased gradually,and the expression of apoptotic genes P53 and Bax increased gradually.P1-P3 joint chondrocytes are suitable for the study of chondrocyte apoptosis.

Chondrocyte Cultured in vitro NAMPT Sirt1Passage

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-2027

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2014ZB079）

310006杭州市第一人民醫(yī)院綜合保健科

高越，E-mail：gy9821@sina.com

2017-08-24）

（本文編輯：陳丹）