HIF-1α基因多態(tài)性與CO中毒患者急性期中樞神經(jīng)損傷的相關(guān)性研究

李晟 劉偉 池學(xué)鋒 謝雪蓓 陳潛妙 屠巍 吳賽華 張媛媛

HIF-1α基因多態(tài)性與CO中毒患者急性期中樞神經(jīng)損傷的相關(guān)性研究

李晟 劉偉 池學(xué)鋒 謝雪蓓 陳潛妙 屠巍 吳賽華 張媛媛

目的探討低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）基因多態(tài)性與一氧化碳（CO）中毒患者急性期中樞神經(jīng)損傷的相關(guān)性。方法選擇191例CO中毒患者，根據(jù)急性期頭顱MRI結(jié)果（是否發(fā)生中樞神經(jīng)脫髓鞘損傷）分為正常組105例與異常組86例。采用DNA直接測序HIF-1α基因中rs3783752、rs4899056、rs1957757、rs10873142等4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。結(jié)果MRI異常組與正常組rs4899056基因型分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中異常組TT基因型分布頻率較正常組低；兩組患者rs10873142基因型分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中異常組CC基因型分布頻率較正常組低。經(jīng)連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)正常組單倍體基因型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度連鎖（D'＞0.9，r2＞0.8），而異常組未發(fā)現(xiàn)連鎖不平衡。MRI異常組與正常組患者定義為單倍體基因型塊（rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142）的分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中CTTG單倍體基因型差異明顯（P＜0.05），TCCA存在差異趨勢（P=0.057）。結(jié)論HIF-1α基因多態(tài)性與CO中毒患者急性期中樞神經(jīng)損傷具有相關(guān)性。

一氧化碳中毒低氧誘導(dǎo)因子-1α基因多態(tài)性中樞神經(jīng)損傷

一氧化碳（CO）中毒會(huì)造成以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損害為主的多臟器病變，尤其是下丘腦、海馬、大腦皮質(zhì)神經(jīng)元對(duì)缺血、缺氧十分敏感。MRI對(duì)早期腦組織細(xì)胞水腫、脫髓鞘改變較為靈敏，可以早期判斷是否出現(xiàn)腦組織損傷。中樞神經(jīng)損傷機(jī)制與許多因素有關(guān)，如中毒環(huán)境、治療方案及遺傳因素。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是一種重要的氧調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)低氧相關(guān)因子表達(dá)。在缺血、缺氧過程中，HIF-1α的羥基化作用被擾亂，穩(wěn)定性增強(qiáng)，發(fā)揮缺氧、缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用。故本文就HIF-1α基因多態(tài)性與CO中毒患者急性期中樞神經(jīng)損傷的相關(guān)性作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象選擇2013年1月至2016年4月本院收治的191例CO中毒患者為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國家頒布的《職業(yè)性急性CO中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》；（2）既往無腦腫瘤及其他腦部合并癥；（3）既往無其他昏迷病史及其他臟器功能衰竭。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并各種病因的腦卒中、嚴(yán)重心肺腦疾病及惡性腫瘤的患者；（2）治療過程中發(fā)生CO中毒后遲發(fā)性腦病。根據(jù)急性期頭顱MRI結(jié)果（是否發(fā)生中樞神經(jīng)脫髓鞘損傷）分成正常組105例與異常組86例，兩組患者年齡、性別以及碳氧血紅蛋白、血常規(guī)、血清C反應(yīng)蛋白、各項(xiàng)血生化指標(biāo)等比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法記錄所有患者一般特征（性別、年齡等）、中毒時(shí)間、家族情況。入院當(dāng)天急診查碳氧血紅蛋白；第2天常規(guī)檢測肝腎功能、心功能、血常規(guī)，采集清晨空腹靜脈血以提取DNA；第2～7天行頭顱MRI檢查。

1.2.1 MRI檢查所有患者行頭顱MRI檢查，并由2位高級(jí)職稱的影像科醫(yī)師記錄并分析影像學(xué)資料。結(jié)果異常者在入院第8～10周復(fù)查MRI，2個(gè)月內(nèi)若癥狀加重則立即復(fù)查。

1.2.2 HIF-1α基因SNP的選擇基因多態(tài)性的檢測5ml靜脈血EDTA抗凝，使用上海祥音生物科技有限公司提供試劑盒提取DNA。從Hap Map數(shù)據(jù)庫漢族人群群體中選擇SNPs（http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/；public datarelease 24/phaseⅡ；Ⅱ），基于Tagger程序選擇標(biāo)簽SNPs，定義參數(shù)為r2≥0.80和少見等位基因頻率（MAF）≥5%。最終選取代表性的SNPs位點(diǎn)共4個(gè)（rs3783752、rs4899056、rs1957757、rs10873142）。使用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，見表1；采用直接測序方法讀取個(gè)體的基因型。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)比較兩組患者HIF-1α基因4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（rs3783752、rs4899056、rs1957757、rs10873142）基因型分布頻率的差異。HIF-1α基因各位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性連鎖不平衡分析和單倍體基因型分析采用SHEsis在線自動(dòng)分析系統(tǒng)，取D′值和r2值作為連鎖不平衡指標(biāo)。block根據(jù)D′＞0.9、r2＞0.8進(jìn)行定義，再根據(jù)可信區(qū)間算法定義單倍體基因型塊，使用期望最大算法估算各單倍體基因型頻率，基因型頻率＜3%的被排除，不再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 HIF基因SNPs位點(diǎn)分型所用引物及測序引物

2 結(jié)果

2.1 頭顱MRI表現(xiàn)191例CO中毒患者急性期頭顱MRI檢查結(jié)果異常86例，主要表現(xiàn)為：（1）雙側(cè)皮質(zhì)下白質(zhì)和（或）側(cè)腦室周同白質(zhì)損害；（2）雙側(cè)基底節(jié)（主要為雙側(cè)蒼白球）損害；（3）皮質(zhì)下白質(zhì)和（或）側(cè)腦室周圍白質(zhì)與基底節(jié)同時(shí)受損害。MRI改變多為雙側(cè)對(duì)稱性，點(diǎn)狀、斑片狀或融合病灶，T1WI呈低信號(hào)，T2WI、T2WFLAIR、DWI呈高信號(hào)。入院第8～10周復(fù)查MRI，白質(zhì)病灶范圍明顯縮小，異常信號(hào)強(qiáng)度減弱，未發(fā)現(xiàn)其他病灶。

2.2 HIF-1α基因4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布頻率HIF-1α基因多態(tài)性見圖1-4。MRI異常組與正常組rs4899056基因型分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中異常組TT基因型分布頻率較正常組低。兩組患者rs10873142基因型分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中異常組CC基因型分布頻率較正常組低，見表2。

2.3 連鎖不平衡分析經(jīng)連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)正常組單倍體基因型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度連鎖（D′＞0.9，r2＞0.8），見圖5a；異常組未發(fā)現(xiàn)連鎖不平衡，見圖5b。

2.4 單倍體分析根據(jù)SHEsis在線分析系統(tǒng)得出基因單倍體總數(shù)（患者例數(shù)×2-單倍體基因型頻率＜3%的患者例數(shù)），即MRI異常組、正常組分別為172、210例。MRI異常組與正常組患者定義為單倍體基因型塊（rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142）的分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中CTTG單倍體基因型差異明顯（P＜0.05），TCCA存在差異趨勢，見表3。

3 討論

圖1 HIF-1α（rs3783752）C/T基因多態(tài)性

圖2 HIF-1α（rs4899056）C/T基因多態(tài)性

圖3 HIF-1α（rs10873142）A/G基因多態(tài)性

圖4 HIF-1α（rs1957757）C/T基因多態(tài)性

圖5 連鎖不平衡分析結(jié)果（a：正常組；b：異常組）

表2 MRI異常組與正常組HIF-1α基因4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布頻率比較[例（%）]

表3 MRI異常組與正常組HIF-1α基因多態(tài)性單倍體分析結(jié)果[例（%）]

CO中毒性腦病通常有明確的CO中毒史，臨床表現(xiàn)主要有意識(shí)不清或意識(shí)模糊、頭暈頭痛、胡言亂語、行走困難、反應(yīng)遲鈍及四肢抽搐等。急性中毒遲發(fā)性腦病是其常見的并發(fā)癥[1-2]，而高壓氧是其首選治療方法。CO中毒性腦病患者中樞脫髓鞘損傷的病理過程較為復(fù)雜，常規(guī)MRI、DWI能夠從病變范圍對(duì)腦損傷程度進(jìn)行評(píng)估[3]。目前認(rèn)為CO中毒性腦病是由于缺血、缺氧導(dǎo)致腦組織壞死和血－腦脊液屏障開放，從而激發(fā)嚴(yán)重免疫反應(yīng)性髓鞘受損。本文對(duì)溫州地區(qū)191例患者的發(fā)病情況進(jìn)行分析，CO中毒后急性期中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘改變情況與性別、年齡、碳氧血紅蛋白、CO中毒嚴(yán)重程度等因素均無關(guān)；這提示不同個(gè)體在CO中毒后的解毒、免疫損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡及損傷后保護(hù)能力、細(xì)胞缺氧耐受能力均存在個(gè)體差異，推測個(gè)體遺傳因素可能起到關(guān)鍵作用。HIF-1α是一類介導(dǎo)低氧適應(yīng)性反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，能激活許多低氧反應(yīng)基因表達(dá)，是低氧條件下維持體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵性物質(zhì)。研究表明在常氧條件下，HIF-1α通過降解結(jié)構(gòu)域脯氨酸殘基羥基化，激活細(xì)胞內(nèi)氧依賴的泛素，并通過蛋白水解酶降解通路使低氧反應(yīng)相關(guān)性蛋白迅速降解[1，4]。在缺血、缺氧過程中，HIF-1α的羥基化作用被擾亂，穩(wěn)定性增強(qiáng)，通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素、促凋亡蛋白半胱天冬酰胺酶3等靶基因表達(dá)，促進(jìn)腦血流動(dòng)力學(xué)的恢復(fù)、改善細(xì)胞能量代謝、抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮缺氧、缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用。

HIF-1α亞基編碼基因位于人類染色體14q21-24，含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)海拔高度不同引起的低氧環(huán)境差異可能對(duì)HIF1-α基因有選擇作用，且與多種疾病如糖尿病合并視網(wǎng)膜病變、腦梗死等相關(guān)[4-6]。根據(jù)中國漢族人群HIF-1α基因多態(tài)性特點(diǎn)，本研究最終選取4個(gè)有代表性的SNP位點(diǎn)（rs3783752、rs4899056、rs1957757、rs10873142），結(jié)果顯示在rs4899056位點(diǎn)，頭顱MRI異常組TT基因型分布頻率明顯低于正常組；在rs10873142位點(diǎn)，頭顱MRI異常組GG基因型分布頻率低于正常組。提示HIF-1α基因rs4899056、rs10873142兩個(gè)位點(diǎn)的變異與CO中毒后中樞神經(jīng)脫髓鞘損傷有關(guān)，基因變異引起相關(guān)編碼蛋白的氨基酸序列改變，從而影響相關(guān)HIF蛋白功能表達(dá)的穩(wěn)定性和功能。此外，本研究作連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，正常組單倍體基因型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度連鎖，異常組未發(fā)現(xiàn)連鎖不平衡；作單倍體分析發(fā)現(xiàn)，單倍體基因型塊（rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142）CTTG單倍體基因型兩組差異明顯，即正常組高于異常組，而TCCA單倍體基因型存在差異趨勢。故筆者初步考慮溫州地區(qū)人群CTTG單倍體基因型對(duì)CO中毒后中樞神經(jīng)脫髓鞘損傷有一系列保護(hù)機(jī)制。

綜上所述，HIF-1α基因多態(tài)性與CO中毒患者中樞神經(jīng)損傷具有相關(guān)性。但本文尚存在一些不足：（1）難以獲得準(zhǔn)確的昏迷時(shí)間、中毒時(shí)間等，僅以碳氧血紅蛋白含量為客觀依據(jù)；（2）缺少可能影響HIF-1基因下游相關(guān)因子的研究，系統(tǒng)闡述CO中毒后中樞神經(jīng)脫髓鞘機(jī)制；（3）研究樣本量相對(duì)較小。建議今后作更大樣本的研究，以進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] Brill C,Scheuer T,Bhrer C,et al.Oxygen impairs oligodendroglial development via oxidative stress and reduced expression of HIF-1α[J].Sci Rep,2017,7:43000.

[2] Guan L,Wen T,Zhang Y,et al.Induction heme oxygennase-1 with hemin attenuates hippocampal injury in rats after acute carbon monoxide poisoning[J].Toxicology,2010,262(2):144-146.

[3] 郭軍,孟郊,韓彤.一氧化碳中毒與中毒后遲發(fā)性腦病的大腦磁共振成像比較[J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志,2014,32(7):533-536.

[4] 趙靜,莊彥.運(yùn)用隨機(jī)森林分析糖尿病視網(wǎng)膜病變的影響因素與HIF-1α基因多態(tài)性的關(guān)系[J].2016,38(23):1871-1875.

[5] 陳捷,林蕾.HIF-1α基因多態(tài)性與大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死的相關(guān)性研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2014,36(23):1917-1920.

[6] Eskandani M,Vandghanooni S,Barar J,et al.Cell physiology regulation by hypoxia inducible factor-1:targeting oxygenrelated nanomachineries of hypoxic cells[J].Int J Biol Macromol,2017(16):31255-31257.

Association of HIF-1α gene polymorphism with central nervous injury in patients with acute carbon monoxide poisoning

LI Sheng,LIU Wei,CHI Xuefeng,et al.
Department of Neurology,the 118th Chinese People's Liberation Army Hospital,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the association between HIF-1α gene polymorphism and central nervous injury in patients with acute carbon monoxide poisoning.MethodsOne hundred and ninety one patients with carbon monoxide poisoning in acute stage were enrolled in the study,including 86 cases with central nervous injury according to MRI examination.The single nucleotide polymorphisms of HIF-1α gene rs3783752,rs4899056,rs1957757 and rs10873142 loci were detected with DNA direct sequencing.Results The frequencies of TT genotype in rs4899056 and GG genotype of rs10873142 in MRI abnormal group were significantly lower than those in MRI normal group(both P＜0.05).The linkage disequilibrium analysis found that haploid type(rs3783752-rs4899056-rs1957757)in normal group had high linkage(D'＞0.9,r2＞0.8),while not in abnormal group.There were significant differences in haploid type(rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142)between patients with abnormal MRI and normal MRI(P＜0.05),the significant difference was found in CTTG haploid type(P＜0.05),while the difference trend was found in TCCA haploid type(P=0.057).Conclusion HIF-1α gene polymorphism is related to central nerve damage in patients with carbon monoxide poisoning.

Carbon monoxide poisoning Hypoxia inducible factor-1aGene polymorphism Central nerve injury

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-533

溫州市公益性科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20150168）

325000溫州，中國人民解放軍第一一八醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（李晟、劉偉、池學(xué)鋒），檢驗(yàn)科（謝雪蓓），影像科（陳潛妙、張媛媛），神經(jīng)康復(fù)科（屠?。?，急診科（吳賽華）

李晟，E-mail：lisheng_216@163.com

2017-03-13）

（本文編輯：陳丹）