胃癌組織中TS和β-Tubulin的表達研究

江雨璐 張敏 王亮 何杰

（安徽省腫瘤醫(yī)院病理科，合肥 230032）

胃癌組織中TS和β-Tubulin的表達研究

江雨璐 張敏 王亮 何杰

（安徽省腫瘤醫(yī)院病理科，合肥 230032）

目的：檢測胃癌組織中胸苷酸合成酶（TS）和β微管蛋白（β-Tubulin）mRNA的表達情況，探討其臨床意義。方法：應用實時逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)對胃癌組織和相應癌旁正常胃組織的TS和β-Tubulin的mRNA進行檢測，分析TS和β-Tubulin mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系及兩者之間的相關(guān)性。結(jié)果：胃癌組織TS、β-Tubulin的mRNA高表達率與正常胃組織比較，差異有統(tǒng)計學意義；不同分化程度、不同浸潤深度的胃癌組織標本β-Tubulin高表達率差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TS和β-Tubulin mRNA表達之間呈弱正相關(guān)。結(jié)論：胃癌組織中TS、β-Tubulin表達高于正常胃組織，且低分化程度和浸潤深度高的胃癌組織中β-Tubulin表達高于高分化程度和浸潤程度低的胃癌組織。

胃癌；胸苷酸合成酶；β微管蛋白

胸苷酸合成酶（TS）是核酸及氟尿嘧啶體內(nèi)代謝通路的關(guān)鍵酶[1]，β微管蛋白（β-Tubulin）可參與細胞的物質(zhì)運輸、有絲分裂及形狀改變等多個環(huán)節(jié)[2]，兩種分子標志物在乳腺癌、食管癌、肺癌等多種惡性腫瘤診斷及療效預測中的價值已得到廣泛認可[3-4]。此次研究使用實時逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（quantitative Real-time RT-PCR）檢測胃癌組織中TS和β-Tubulin的mRNA表達，探討其臨床參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

此次研究采用回顧性對照分析方法。選取我院2014年5月至2016年12月收治的95例胃癌患者，均行手術(shù)切除，臨床資料完整，術(shù)前均未接受放、化療。95例患者中，男77例，女18例，年齡20～81歲，平均（59.87±11.63）歲，臨床分期：IA期6例，IB期8例，IIA期7例，ⅡB期13例，ⅢA期12例，ⅢB期26例，IIIC期15例，Ⅳ期8例；分化程度：高分化14例，中分化48例，低分化33例；浸潤深度：T1期9例，T2期12例，T3期17例，T4期57例。

1.2 標本檢測

1.2.1 檢測方法 術(shù)中取癌、癌旁正常胃組織，石蠟包埋切片，使用實時逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測95例胃癌組織和相對應正常胃組織標本TS、β-Tubulin的mRNA表達情況。石蠟組織RNA提取試劑盒由OMEGA公司提供，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SybrGreen熒光染料，均由ABI公司提供。主要操作步驟：1）使用TS、β-Tubulin特異性引物，從總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA：10×RTmix、TS或β-Tubulin特異性引物、dNTPs、H2O各1.6 μL，RNase抑制劑、RNase各0.8 uL，加上稀釋后個總RNA 8 uL，反應體積共16 μL。反應程序 ：25℃ 10 min，42℃ 6 min，94℃ 5 min，4℃冷卻 8 min。2）于毛細玻璃管內(nèi)以特異性雙標熒光探針及特異基因引物在定量PCR儀上行PCR擴增反應，總反應體積為20 μL，其中FastStart反應混合液2 μL，TS、β-Tubulin檢測混合液 6 μL，MgCL225 mmol/L，H2O 6.4 μL，cDNA 4 μL。擴增程序：95℃預孵5 min，95℃變性、62℃退火、72℃延伸各10 s，循環(huán)40次；40℃冷卻30 s。引物如下：

β-Actin-F: AGCCATGTACGTTGCTATCCA

β-Actin-R: GTCACCGGAGTCCATCACGAT

TS-F: ACCAACCCTGACGACAGAAG

TS-R: CATGTCTCCCGATCTCTGGT

β-Tubulin-F:GCTGCA ACTTCACAAGGTCAAG

β-Tubulin-R: CTCGCCTCACCTCTGTTTTC

1.2.2 結(jié)果判讀 以與TS、β-Tubulin基因擴增動力學相似的β-actin作為內(nèi)參照，每樣本重復3次，2-△△CT法進行比較，當2-△△CT≥2時，判定為高表達，＜2判定為低表達。

1.3 分析方法

數(shù)據(jù)運用SPSS19.0軟件統(tǒng)計分析，不同臨床病理特征組織標本TS和β-Tubulin的mRNA表達采用χ2檢驗，TS和β-Tubulin的mRNA表達之間的關(guān)系用Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

胃 癌 組 織 TSmRNA 高 表 達 率 27.36%（26/95），β-Tubulin mRNA高表達率33.68%（32/95）。癌旁正常胃組織TS mRNA高表達率2.1%（2/95）、β-Tubulin mRNA高表達率1.05%（1/95）。胃癌組織TS、β-Tubulin mRNA高表達率與正常胃組織比較，差異有統(tǒng)計學意義。

不同分化程度、不同浸潤深度患者的胃癌組織標本的β-Tubulin高表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 胃癌組織標本TS和β-Tubulin高表達率與臨床病理特征的關(guān)系

如表2所示，TS和β-Tubulin的mRNA表達之間弱正相關(guān)，r=0.491，P＜ 0.05。

表2 TS和β-Tubulin的mRNA表達相關(guān)性分析

3 討論

我國每年新發(fā)胃癌患者約40萬，約占世界胃癌新發(fā)患者的40%以上，即便給予規(guī)范、系統(tǒng)、有效的治療，患者仍有較高的死亡率和復發(fā)、轉(zhuǎn)移風險[10-11]。因此，對胃癌早期篩查診斷及療效預測分子標志物的探索一直在進行。

TS是胸苷酸合成的起始酶，與腫瘤DNA的合成速度具有密切關(guān)聯(lián)性，也被認為是氟尿嘧啶類藥物的主要作用靶點，且其表達情況與非小細胞肺癌患者化療藥物的敏感性密切相關(guān)[12]。此次研究胃癌組織中TS高表達率27.36%，而正常組織TS高表達率為2.10%。有研究報道印戒細胞癌病灶組織TS陽性率達到100%[13]，其可能是促進印戒細胞癌發(fā)生、進展的重要分子標志物，由于TS是DNA合成環(huán)節(jié)中的重要限速酶，TS過度表達的癌細胞往往具有較高的生長潛能[14]。過往有學者就TS對胃癌化療效果的臨床預測價值進行了分析，得到結(jié)論為TS陰性者較TS陽性者有著更高的化療有效率，其原因與TS調(diào)節(jié)P53表達從而影響細胞周期、腫瘤細胞增殖的機制有關(guān)[15]。但本研究未就癌癥病理分型進行分析，可能TS高表達的印絨細胞癌占比較少，未顯現(xiàn)出TS高表達與臨床分期及浸潤深度的相關(guān)性。

作為紫杉醇類藥物的作用靶點，β-Tubulin與細胞增殖、分化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。Ma等[17]報道惡性腫瘤組織β-Tubulin III高表達提示預后不良。本研究中胃癌組織標本β-Tubulin高表達與腫瘤分化程度、浸潤深度相關(guān)，其敏感性高于TS。在臨床療效觀察中，已有報道β-Tubulin表達改變可對使患者DFS、OS明顯縮短，其原因可能與細胞骨架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降、動力性上升有關(guān)[18]。

綜上所述，胃癌組織中TS和β-Tubulin均呈高表達狀態(tài)， TS、β-Tubulin表達情況的觀察，對于胃癌的深入診斷有著積極作用，后續(xù)可重新設計實驗觀察二者與臨床療效及預后的關(guān)系。

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R365

A

2095-5200(2017)06-068-03

10.11876/mimt201706027

江雨璐，本科，主管技師，研究方向：病理臨床，Email：1473252585@163.com。

何杰，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導師。