基于“毒-效整合分析思路”探討有毒中藥附子的物質(zhì)基礎(chǔ)

熊 亮 彭 成 繆璐琳 何育霖 蒙春旺 蘇海國(guó)

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,成都,611137)

基于“毒-效整合分析思路”探討有毒中藥附子的物質(zhì)基礎(chǔ)

熊 亮 彭 成 繆璐琳 何育霖 蒙春旺 蘇海國(guó)

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,成都,611137)

中藥的毒與效是客觀存在的,尤其在藥效顯著的大毒中藥中,毒和效既是矛盾的,又是統(tǒng)一的。毒與效的物質(zhì)基礎(chǔ)往往不是孤立的,而是相互影響和相互轉(zhuǎn)化的。附子是著名的有毒中藥,不僅藥效顯著,而且毒性明顯,一直是研究熱點(diǎn)。雖然目前已從附子中獲得90余個(gè)化學(xué)成分,但附子起效和致毒的根本原因仍然有待進(jìn)一步揭示。其問(wèn)題的復(fù)雜性在于:附子的毒與效在不同條件下可以相互轉(zhuǎn)化,例如附子既可以強(qiáng)心,也可以導(dǎo)致心臟毒性;既有鎮(zhèn)痛效果,又會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性。而且同一組分、成分在不同條件下,可能發(fā)揮完全不同的生物學(xué)效應(yīng)。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因包括劑量因素、模型因素、炮制因素、配伍因素、使用方法因素、代謝因素等。本文將結(jié)合課題組近年來(lái)對(duì)附子的研究結(jié)果以及文獻(xiàn)報(bào)道,從附子化學(xué)成分、附子化學(xué)成分的藥效和毒理、附子毒-效作用的轉(zhuǎn)化方面進(jìn)行毒-效整合分析,探討附子的物質(zhì)基礎(chǔ)。

附子;物質(zhì)基礎(chǔ);毒效整合分析;化學(xué)成分;毒-效轉(zhuǎn)化

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)子根的加工品,辛、甘,大熱,有毒;具有回陽(yáng)救逆,補(bǔ)火助陽(yáng),散寒止痛功效;用于亡陽(yáng)虛脫,肢冷脈微,心、脾、腎陽(yáng)不足,胸痹心痛,寒濕痹痛。附子作為回陽(yáng)救逆第一要藥,一直都是大家研究的熱點(diǎn)。雖然毒性大,但療效卓著,是臨床常用的中藥,歷代本草和歷版《中華人民共和國(guó)藥典》都將其收錄。附子中既存在藥效成分,又存在毒性成分,但長(zhǎng)期以來(lái)大家一致認(rèn)可,附子的藥效成分也是其毒性成分,而且它們隨著成分轉(zhuǎn)化、炮制加工、劑量變化、配伍使用會(huì)發(fā)生多種“毒—效”轉(zhuǎn)化[1]。一般認(rèn)為,附子中的雙酯型二萜生物堿是附子毒性極強(qiáng)的特征性物質(zhì),可引起心臟急性毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性等[2-3],但現(xiàn)代研究也表明,它們?cè)诘蜐舛葪l件下又可以發(fā)揮藥效。附子的不同炮制方法和煎煮方式均可以達(dá)到減毒增效的作用,雙酯型生物堿迅速水解,單酯型和無(wú)酯型生物堿則逐漸增加。此外,劑量的變化、配伍使用均會(huì)使附子呈現(xiàn)出不同的生物學(xué)效應(yīng)。本文將結(jié)合本課題組近年來(lái)對(duì)附子的研究結(jié)果以及文獻(xiàn)報(bào)道,從附子化學(xué)成分、附子化學(xué)成分的藥效和毒理、附子毒-效作用的轉(zhuǎn)化方面進(jìn)行整合分析,探討附子的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 附子的化學(xué)成分研究

生物堿是目前附子中研究最多的化學(xué)成分,也是附子中較為特征的成分,主要包括C19型二萜生物堿類、C20型二萜生物堿類、酰胺類、季銨鹽類、阿樸啡類等[4]。目前,以C19型二萜生物堿數(shù)量最多,也一直被認(rèn)為是附子的有效成分和毒性成分。《中華人民共和國(guó)藥典》2015版規(guī)定了6種C19型二萜生物堿的檢查和含量測(cè)定,分別為烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭堿和苯甲酰新烏頭堿。本文將結(jié)合本課題組研究及文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)附子化學(xué)成分進(jìn)行介紹。

1.1 C19型二萜生物堿 附子中的C19型二萜生物堿多以烏頭堿(aconitine)骨架為主,在C1、C6、C8、C14、C16、C18位通常有含氧基團(tuán)取代,取代基以羥基和甲氧基為主,少數(shù)時(shí)候有羰基、亞甲二氧基、環(huán)氧醚基等。其中C-8和C-14的羥基多與乙酸或苯甲酸成酯,根據(jù)酯鍵的多少又可進(jìn)一步將烏頭堿型生物堿為無(wú)酯型、單酯型、雙酯型3種,現(xiàn)代藥理研究表明,其酯鍵的數(shù)量與化合物毒性密切相關(guān),雙酯型烏頭堿的毒性最強(qiáng),而無(wú)酯型烏頭堿的毒性較弱。目前共從附子中分離得到C19型二萜生物堿50個(gè)(見(jiàn)表1)。

目前從附子中分離得到了16個(gè)無(wú)酯型C19二萜生物堿(圖1,1-16),所有化合物的C-1均被含氧基團(tuán)取代,且均為α型;C-16均被β型的甲氧基或羥基取代;C-6通常被α型含氧基團(tuán)取代?；衔?3-16為我國(guó)學(xué)者石建功從附子中首次發(fā)現(xiàn)的二萜生物堿阿拉伯糖苷類,在此之前,尚未報(bào)道附子中含有二萜生物堿苷[21]。

相對(duì)于無(wú)酯型和雙酯型,附子中單酯型生物堿的報(bào)道較多。目前,已報(bào)道的附子單酯型C19二萜生物堿約20個(gè)(圖2,17-36),此類生物堿14α-OH均被酯化,多數(shù)情況下為苯甲?；?Bz),少數(shù)為乙?；?Ac)(17,21,36)或桂皮?；?Cn)(20)。相反,8β-OH均未被酯化,部分化合物以8β-O-醚的形式存在,如8β-OMe(23,26,27,31,32,34,35)和8β-OEt(24)。此外,在C-1、C-3、C-6、C-10、C-13、C-15、C-16和C-18通常取代含氧基團(tuán)(OH或OMe),且空間構(gòu)型分別為1α,3α,6α,10β,13β,15α和16β。其中以C-1、C-16和C-18的含氧取代最常見(jiàn),所有化合物均含有1α-OH(OMe)和16β-OMe。除化合物17和36以外,其他化合物均在C-18位取代OMe。

圖1 從附子中獲得的無(wú)酯型C19二萜生物堿成分

圖2 從附子中獲得的單酯型C19二萜生物堿成分

雙酯型二萜生物堿為常見(jiàn)有機(jī)酸與8β-OH和14α-OH同時(shí)酯化形成,毒性比非酯型和單酯型大很多。表1和圖3歸納了近些年來(lái)從附子中發(fā)現(xiàn)的雙酯型C19二萜生物堿。C-14位的酯鍵絕大多數(shù)為苯甲酸酯(OBz),少數(shù)為茴香酸酯(OAs),如37。

圖3 從附子中獲得的雙酯型C19二萜生物堿成分

母核中其他位置的取代與單酯型相似,也是在C-1、C-3、C-6、C-10、C-13、C-15、C-16和C-18位取代含氧基。但目前獲得的雙酯型C19二萜生物堿中,C-1和C-6均被α-OMe取代,無(wú)OH取代類型;C-16均被β-OMe取代;C-18均被OMe取代。其中,烏頭堿(aconitine,39)、次烏頭堿(hypaconitine,46)和新烏頭堿(中烏頭堿,mesaconitine,48)是附子中含量較大的代表性二萜生物堿。

表1 附子中的C19型二萜生物堿

1.2 C20型二萜生物堿 C20二萜生物堿的骨架類型復(fù)雜多樣,屬于較原始的二萜生物堿類型,主要分為八類:阿替生型(Atisines)、光翠雀堿型(Denudatines),海替定型(Hetidines)、海替生型(Hetisines)、維特欽型(Veatchines)、納哌啉型(Napellines)、阿諾特啉型(Anopterines)和Arcutine型。近年來(lái)從附子中發(fā)現(xiàn)的C20型二萜生物堿見(jiàn)表2和圖4,其中化合物51和52為阿替生型,N原子上均有乙基取代,C-15和C-17均被含氧基團(tuán)取代。化合物53為罕見(jiàn)的Arcutine型生物堿,由于分離純化過(guò)程中使用了氨水和三氟乙酸,故分離得到化合物53的氫氧化物和三氟乙酸鹽[18]?；衔?4-58為海替生型,在54和55結(jié)構(gòu)中,N原子上無(wú)甲基或乙基取代,而在56-58結(jié)構(gòu)中,N原子上取代甲基,以季銨鹽的形式存在。此外,C-2上連接丙酰氧基或異丁酰氧基,C-13上取代2-甲基丁酰氧基,這些含氧取代基在以往的烏頭屬植物中還未見(jiàn)報(bào)道。除以上阿替生型和海替生型以外,從附子中還發(fā)現(xiàn)了Napelline型、Lycoctine型和Arcutine型,其中宋果靈(59,songorine)在很多烏頭屬植物中均有報(bào)道?；衔?0-62以季銨鹽的形式存在,其陰離子的引入也與實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用鹽酸和三氟乙酸有關(guān)。

表2 附子中的C20型二萜生物堿

圖4 從附子中獲得的C20二萜生物堿成分

序號(hào)名稱化學(xué)式參考文獻(xiàn)64uracilC4H4N2O2[17]656-hydroxymethyl-3-pyridinolC7H9NO2[21]66adenosineC10H13N5O4[22]675-hydroxymethyl-pyrrole-2-carbaldehydeC6H7NO2[11]68aconicaramideC11H14N2O3[11]69oleraceinEC12H13NO3[11]70N-(2'-β-D-glucopyranosyl-5'-hydroxysali-cyl)-4-hydroxy-3-methoxyanthranilicacidmethylesterC22H25NO12[22]71N-(2'-β-D-glucopyranosyl-5'-hydroxysali-cyl)-4-hydroxyanthranilicacidmethylesterC21H23NO11[22]72aconicarmiquinamideAC21H25N3O6[23]73aconicarmiquinamideBC19H21N3O6[23]74(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R)-2'-hydroxy-lignoceroylamino]-8(E)-octadecene-1,3,4-triolC42H83NO5[24]

1.3 非二萜生物堿 相對(duì)于二萜生物堿而言,其他類生物堿的研究較少,目前僅從附子中報(bào)道了11個(gè)非二萜生物堿,主要包括嘧啶、吡啶、腺苷、吡咯和酰胺類(表3和圖5)。

圖5 從附子中獲得的非二萜生物堿成分

1.4 其他化合物 目前已報(bào)道的附子化學(xué)成分研究主要為生物堿類,非生物堿較少。迄今為止,從附子中獲得22個(gè)非生物堿成分(表4和圖6),主要類型為黃酮類(76-79)和芳香酸類(80-93)。

表4 附子中的非生物堿成分

圖6 從附子中獲得的其他成分

2 附子化學(xué)成分的藥效學(xué)研究

目前對(duì)于附子化學(xué)成分的藥效研究,主要集中于心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng),所研究的對(duì)象多為生物堿類化合物。其中強(qiáng)心和鎮(zhèn)痛研究最多,這與附子的傳統(tǒng)功效密切相關(guān),在一定程度上反映出附子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),表5列出了近年來(lái)附子化學(xué)成分藥效學(xué)研究的主要結(jié)果。

2.1 對(duì)心血管的作用 附子為“回陽(yáng)救逆第一品”,有顯著強(qiáng)心作用,已在不同的動(dòng)物模型上得到證實(shí),如鼠、兔、蟾蜍、貓以及狗等。目前發(fā)現(xiàn)的附子強(qiáng)心成分既包括水溶性成分,也包括脂溶性成分。日本學(xué)者首次從附子中分離得到去甲烏藥堿[27],此后多位學(xué)者均發(fā)現(xiàn)其具有顯著的強(qiáng)心作用,認(rèn)為去甲烏藥堿為附子中的強(qiáng)心成分,可濃度依賴性增強(qiáng)心肌收縮力(±dp/dt)和最大收縮舒張速率(ph/bl),起效濃度為0.1 μM,EC50約為0.205 μM[28]。此外,有學(xué)者研究表明:從附子水提液中分離得到的尿嘧啶同樣具有強(qiáng)心作用,可加強(qiáng)蟾蜍離體心臟的心肌收縮,且不影響心率[17,31]。水溶性成分附子苷也可使豚鼠離體心臟的LVSP、±dp/dtmax明顯增加,且不影響心率,表明附子苷可導(dǎo)致心肌收縮能力增加,產(chǎn)生正性肌力效應(yīng)[31]。氯化棍掌堿可通過(guò)增加豚鼠右心房收縮振幅與速率產(chǎn)生強(qiáng)心作用[32]。去甲豬毛菜堿除強(qiáng)心作用以外,因其為弱β-腎上腺素興奮劑還具有一定的升壓作用[33]。除了部分水溶性成分具有強(qiáng)心作用以外,一些脂溶性烏頭堿類也表現(xiàn)出明顯的強(qiáng)心作用,其中研究最多的當(dāng)屬烏頭堿:烏頭堿對(duì)H2O2構(gòu)建的心力衰竭模型有明顯強(qiáng)心作用,其最佳量-時(shí)-效組合為50 μM的烏頭堿作用于心力衰竭模型0.5 h[34];烏頭堿還可增加離體蛙心平均振幅增長(zhǎng)率表現(xiàn)出一定的強(qiáng)心作用[35]。Liu XX等[9]從附子中分離得到5個(gè)生物堿,其中新烏頭原堿、次烏頭原堿、北烏寧對(duì)離體蛙心均有明顯的強(qiáng)心作用。此外,異塔拉定、烏頭原堿、3-去氧烏頭原堿對(duì)離體蛙心也表現(xiàn)出一定的強(qiáng)心作用[9,35]。

除了強(qiáng)心作用以外,一些附子生物堿還具有保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。本課題組從附子中分離得到的附子靈、尼奧靈對(duì)戊巴比妥造成的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,提高細(xì)胞生存能力[11]。具強(qiáng)心作用的去甲烏藥堿還可選擇性激活β2腎上腺素受體激動(dòng)劑抑制心肌細(xì)胞凋亡,防止缺血再灌注損傷。其抗凋亡作用是通過(guò)PI3K介導(dǎo),激活p-AKT,下調(diào)caspase3、9凋亡蛋白表達(dá)產(chǎn)生效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明去甲烏藥堿抗凋亡作用和心肌保護(hù)作用是通過(guò)β2-AR/PI3K/AKT通路介導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)[29]。此外,去甲烏藥堿還具有抗血小板聚集的作用[30]。

2.2 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用 附子化學(xué)成分對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用主要表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)和鎮(zhèn)痛。從附子水提取物分離得到的3個(gè)新C19烏頭堿型二萜生物堿(-)-(A-b)-14α-benzoyloxy-N-ethyl-3α,8β,13β,15α-tetrahydroxy-1α,6α,16β,18-tetramethoxyaconitane、(-)-(A-b)-8β,14α-dibenzoyloxy-N-ethyl-3α,13β,15α-trihydroxy-1α,6α,16β,18-tetramethoxyaconitane、(-)-(A-b)-14α-benzoyloxy-N-ethyl-6α,15α-dihydroxy-1α,8β,16β,18-tetramethoxyaconitane對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的PC12損傷均具有保護(hù)作用,10 μM藥物作用于細(xì)胞時(shí)可將細(xì)胞活力分別從(55.1±4.2)%提升至(79.8±5.7)%、(74.7±4.6)%和(75.8±7.6)%[12]。Dimethyl(-)-(R)-eucomate對(duì)氧糖剝奪復(fù)糖誘導(dǎo)SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,與空白組比較,可使細(xì)胞活力提升(39.96±4.63)%。阿魏酸甲酯對(duì)左旋谷氨酸誘導(dǎo)SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,與空白組比較,可使細(xì)胞活力提升(14.03±4.50)%。linocinnamarin對(duì)左旋谷氨酸誘導(dǎo)SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,與空白組比較,可使細(xì)胞活力提升(11.17±3.48)%[25]。

在鎮(zhèn)痛方面,附子中多個(gè)烏頭堿型生物堿具有明顯的作用,這可能與附子治療風(fēng)濕痹痛有關(guān)。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、去氧烏頭堿、guiwuline等均具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性,但因其毒性大、安全性小,臨床應(yīng)用受到限制。其中,烏頭堿經(jīng)皮給藥時(shí),單次給藥出現(xiàn)一定的皮膚急性毒性,但隨著用藥次數(shù)增加,毒性反應(yīng)出現(xiàn)“反轉(zhuǎn)現(xiàn)象”,作用強(qiáng)度隨著用藥量的增加而加強(qiáng),累計(jì)外用出現(xiàn)良好的鎮(zhèn)痛作用[36]。次烏頭堿和新烏頭堿可減少老鼠抽搐次數(shù),增加疼痛反應(yīng)潛伏時(shí)間[37]。去氧烏頭堿可介導(dǎo)κ阿片受體增強(qiáng)利多卡因?qū)彝糜材ね獾逆?zhèn)痛效果[39]。Guiwuline在小鼠模型上具有明顯鎮(zhèn)痛作用,其ED50值為15 mg/kg[40]。

表5 附子化學(xué)成分的藥效作用

表6 附子化學(xué)成分的毒性

2.3 對(duì)免疫系統(tǒng)和新陳代謝的影響 附子對(duì)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的藥效是目前附子研究的主要方向,但除此之外,也有大量報(bào)道表明附子還具有其他多種作用,如對(duì)免疫系統(tǒng)的影響、調(diào)節(jié)新陳代謝等作用。

1997年,馬建等[41]研究烏頭堿對(duì)正常小鼠和皮質(zhì)酮所致的陽(yáng)虛模型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在干擾素誘導(dǎo)情況下表面Ia抗原表達(dá)的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn):烏頭堿能提高正常小鼠和皮質(zhì)酮免疫抑制陽(yáng)虛模型小鼠M Ia抗原的表達(dá),從而增強(qiáng)M遞呈抗原能力,促進(jìn)免疫應(yīng)答反應(yīng)。此外,從附子中分離得到的水溶性附子多糖FPS-1,可明顯刺激伴刀豆球蛋白A和脂多糖造模后小鼠的淋巴細(xì)胞增殖,并促進(jìn)脾細(xì)胞產(chǎn)生抗體,具有免疫促進(jìn)作用[42]。

早期日本學(xué)者Hikino H[43]等發(fā)現(xiàn)生附子和炮附子的甲醇提取物可刺激小鼠肺對(duì)氨基酸的攝入,活性追蹤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):從中分離得到的新烏頭堿具有最強(qiáng)的活性,這種作用可被放線菌素D拮抗,并且新烏頭堿可以增加肺部蛋白質(zhì)合成同時(shí)降低腎部蛋白質(zhì)合成。Konno C[44]等從附子中分離出的附子多糖aconitans A、B、C、D能明顯降低正常小鼠和高血糖模型小鼠的血糖水平,其中aconitan A不影響血液和細(xì)胞胰島素水平以及己糖激酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性,而是刺激磷酸果糖激酶的活性[11]。

2.4 其他作用 從附子乙醇提取物中分離得到的oleracein E表現(xiàn)出一定的抗菌作用[11]。附子多糖FPS-1可增加小鼠齒狀回區(qū)的新生細(xì)胞、提高海馬區(qū)的BDNF水平,具抗抑郁作用,且這種抗抑郁和細(xì)胞增生作用可被K252a阻斷[46]。去甲烏藥堿和氯化棍掌堿還可影響乙酰膽堿的釋放[47]。

3 附子化學(xué)成分的毒性研究

附子中的雙酯型生物堿一直被認(rèn)為是附子中的毒性物質(zhì),而單酯型和無(wú)酯型生物堿的毒性較弱,因此,附子的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究多集中于雙酯型生物堿成分,主要包括烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿(見(jiàn)表6)。

目前毒性報(bào)道最多的為烏頭堿,其毒性主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和肌肉組織[61]。其中研究較為深入的為心臟毒性,3%烏頭堿作用于心肌細(xì)胞30 s至30 min,隨著時(shí)間增長(zhǎng),細(xì)胞收縮,胞體變小,細(xì)胞質(zhì)間隙增大,細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+含量顯著升高,而K+和Mg2+含量顯著降低,Na+-K+-ATP酶活力有明顯的抑制,同時(shí)興奮心肌α1受體,使其發(fā)生自發(fā)性收縮導(dǎo)致心律失常。因此,烏頭堿引起心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制為:烏頭堿抑制心肌細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶活性,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+濃度增高和K+濃度降低,細(xì)胞Na+-Ca2+交換增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+增高,Ca2+增高可導(dǎo)致呼吸鏈中斷、能量消耗增加,導(dǎo)致無(wú)氧代謝的增加,氧自由基增加,使生物膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化,膜脂質(zhì)過(guò)氧化MDA的增加和生物膜穩(wěn)定性遭到破壞,導(dǎo)致細(xì)胞器的變性,細(xì)胞核的損傷,細(xì)胞形態(tài)和功能損傷[49-50]。與其類似地,次烏頭堿、新烏頭堿、去甲烏藥堿均報(bào)道有心臟毒性。李志勇等[59]發(fā)現(xiàn)30～120 mmol/L次烏頭堿溶液能引起顯著的心臟毒性,表現(xiàn)為L(zhǎng)DH(乳酸脫氫酶)漏出率上升、心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率驟降及細(xì)胞膜受損甚至死亡等。韓旭等[50]對(duì)新烏頭堿研究發(fā)現(xiàn),其在3×10-8mol/L濃度下即可使離體豚鼠乳頭肌的動(dòng)作電位的形狀發(fā)生“三角形”畸變兼伴有自發(fā)性動(dòng)作電位,縮短動(dòng)作電位時(shí)程,使其發(fā)生自發(fā)性收縮,出現(xiàn)心律失常。去甲烏藥堿高于1 μmol/L時(shí),對(duì)心肌細(xì)胞即產(chǎn)生毒性,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞不節(jié)律收縮[28]。

除心臟毒性外,烏頭堿還對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等產(chǎn)生毒性。大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞在2%烏頭堿濃度下,作用30 s細(xì)胞活力即明顯降低,20 min細(xì)胞基本死亡,神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空洞和溶酶體,染色質(zhì)被破壞,線粒體腫脹擴(kuò)張,細(xì)胞內(nèi)糖原含量下降,乙酰膽堿、兒茶酚胺、阿片肽、P物質(zhì)顯著增加。烏頭堿對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成毒性的機(jī)制可能與心臟毒性機(jī)制相似,通過(guò)抑制Na+-K+-ATP酶活性,引起細(xì)胞的離子通道門(mén)控系統(tǒng)、生物電位的改變和細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,最終導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和功能的損傷以及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的改變,從而在動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)為各種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[51]。

小鼠結(jié)腸Cajal細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),0.1%烏頭堿作用細(xì)胞30 min,細(xì)胞間連接完全斷裂,180 min時(shí)已觀察不到完整細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著升高,Na+、K+、Ca2+、糖原含量降低,Na+-K+-ATP酶活性受到抑制,顯示出明顯毒性作用[51]。另有研究表明,高濃度烏頭堿還具有明顯的生殖毒性,可抑制大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖,降低其對(duì)乳酸分泌的刺激作用[52],濃度5×102ng/mL以上的烏頭堿溶液可抑制黃體細(xì)胞的增殖及激素的分泌[54]。劉強(qiáng)強(qiáng)[53]等在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)烏頭堿對(duì)雌性大鼠卵巢顆粒細(xì)胞也有抑制增殖及氧化損傷的毒性作用,其生殖毒性可能與大鼠體內(nèi)孕酮、黃體生成素、卵泡刺激素、雌二醇等性激素含量降低有關(guān)。

此外,烏頭堿對(duì)胚胎也有一定毒性。大鼠全胚胎培養(yǎng)技術(shù)研究表明,烏頭堿對(duì)器官發(fā)生期胚胎有直接的胚胎毒性,延緩胚胎分化和導(dǎo)致神經(jīng)、心臟等發(fā)育畸形,最低毒性濃度為11 μg/mL[55]。烏頭堿在1.46 mg/kg濃度下還表現(xiàn)出肝臟及腎臟毒性[56-57]。Sun Bo運(yùn)用代謝組學(xué)的方法,給予大鼠單劑量烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿后,分析體內(nèi)代謝變化,結(jié)果顯示腎小管功能在給藥24 h內(nèi)收到較大干擾,體內(nèi)激素水平明顯變化。烏頭堿的影響比新烏頭堿和次烏頭堿組影響大,GC/TOF-MS分析顯示前兩者的毒性機(jī)制可能不同[58]。

4 附子毒-效成分的轉(zhuǎn)化和整合分析

從以上總結(jié)和分析可知,目前對(duì)附子研究最多的為生物堿類,其中雙酯型生物堿多報(bào)道為毒性,單酯型和無(wú)酯型生物堿、水溶性成分多報(bào)道為生物活性。但不難發(fā)現(xiàn),即使是以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿為代表的毒性成分,在一定條件下也表現(xiàn)出良好的活性,且這些成分之間,還會(huì)隨著藥材炮制、煎煮方式、配伍使用而發(fā)生轉(zhuǎn)化。

4.1 劑量引起的毒-效轉(zhuǎn)化 以往大量研究表明附子水提物具有明顯的強(qiáng)心作用,可增強(qiáng)大鼠離體心臟的心輸出量和心肌收縮力且表現(xiàn)出量-效關(guān)系,但加大用量便會(huì)出現(xiàn)心肌收縮力量不足,心輸出量減少的不良反應(yīng),表現(xiàn)出量-毒關(guān)系[62]。比較分析附子單體化合物的作用,可以發(fā)現(xiàn)烏頭堿既有明顯的強(qiáng)心活性,又可產(chǎn)生顯著的心臟毒性。溫善姍等[34]發(fā)現(xiàn)烏頭堿對(duì)心力衰竭細(xì)胞起強(qiáng)心作用的最佳量-效組合為50 μmol/L,而3%的烏頭堿溶液對(duì)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體、膜、溶酶體、肌纖維膜等均有毒性[51]。此外,烏頭堿經(jīng)皮給藥時(shí),單次給藥出現(xiàn)一定的皮膚急性毒性,但隨著用藥次數(shù)增加,毒性反應(yīng)出現(xiàn)“反轉(zhuǎn)現(xiàn)象”,作用強(qiáng)度隨著用藥量的增加而加強(qiáng),累計(jì)外用出現(xiàn)良好的鎮(zhèn)痛作用[36]。

同樣,次烏頭堿及新烏頭堿在小鼠口服給藥5.8、1.8 mg/kg時(shí)出現(xiàn)半數(shù)死亡[48],但劑量降低至0.0063 mg/kg可減少老鼠抽搐次數(shù),增加疼痛反應(yīng)潛伏時(shí)間,表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛作用[37],新烏頭堿在0.16 mg/kg劑量下還可抑制角叉菜誘導(dǎo)的大鼠足腫模型腫脹,表現(xiàn)出明顯抗炎作用[38]。以上說(shuō)明,用藥劑量是附子毒與效轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵點(diǎn)之一。

4.2 炮制引起的毒-效轉(zhuǎn)化 附子是傳統(tǒng)大毒中藥,歷代均很重視其炮制方法。在傳統(tǒng)炮制的基礎(chǔ)上,有關(guān)附子的炮制方法得到了很大發(fā)展,使得其炮制品達(dá)十種以上。附子在現(xiàn)代臨床多用其炮制品而不用生品,亦是從用藥安全性考慮。本課題組研究發(fā)現(xiàn):相對(duì)于生附子而言,各種炮制品(黑順片、白附片、鹽附子、卦附片、熟附片、淡附片、黃附子、刨附片)的酯型生物堿和雙酯型生物堿(新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿)含量均有不同程度的降低(見(jiàn)表7),提示炮制可以促進(jìn)附子毒性物質(zhì)烏頭堿等酯型生物堿的轉(zhuǎn)化[63]。

4.3 配伍引起的毒-效轉(zhuǎn)化 本課題組從飲片配伍、組分配伍、成分配伍3個(gè)層次,以化學(xué)物質(zhì)和生物學(xué)評(píng)價(jià)共同探討附子配伍減毒增效的科學(xué)內(nèi)涵,并篩選出附子配伍干姜治療陽(yáng)虛心力衰竭[64]、附子大黃配伍治療陽(yáng)虛便秘[65]、附子甘草配伍治療抗心律失常[66]的最佳配伍和組分,揭示其配伍增效和減毒的作用機(jī)制。附子配伍干姜[67]、附子配伍大黃[65]、附子配伍甘草[68]、附子配伍人參[69]、附子配伍白芍[70]后,均能使其毒性成分雙酯型生物堿的含量降低,促進(jìn)毒性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,生物活性增強(qiáng),起到增效解毒的作用。具體情況表現(xiàn)如下:

表7 不同炮制品中總生物堿、酯型生物堿以及雙酯型生物堿的含量

附子配伍干姜后,總生物堿和酯型生物堿的溶出度增加,而雙酯型生物堿即有毒組分的溶出度降低,對(duì)于心力衰竭動(dòng)物模型,附子干姜配伍后能明顯增強(qiáng)其治療作用而降低毒性。大黃配伍附子后,酯型生物堿含量呈現(xiàn)不同的變化,其中有毒成分3種雙酯型生物堿溶出度2～6 h較配伍前明顯減少。生附子、白附片、黑順片配伍甘草共煎后,總生物堿含量明顯升高,而酯型生物堿、雙酯型生物堿含量下降明顯。人參附子藥對(duì)配伍應(yīng)用時(shí)雙酯型二萜生物堿的含量明顯降低,而單酯型二萜生物堿的含量明顯升高。因此,可以看出,通過(guò)配伍可以使毒性成分降低,而其他有效成分增加,起到毒-效轉(zhuǎn)化的作用。

4.4 使用方法引起的毒-效轉(zhuǎn)化 附子在傳統(tǒng)應(yīng)用中,要求“久煎”以控制毒性。本項(xiàng)目組研究發(fā)現(xiàn),生附子、黑順片和白附子的總生物堿、酯型生物堿和雙酯型生物堿含量均在煎煮0～6 h內(nèi)呈先升高后降低的趨勢(shì):生附子總生物堿在煎煮2 h時(shí)溶出量最大,黑順片和白附片總生物堿在1 h達(dá)到最高峰;且3種飲片的酯型生物堿含量均在煎煮2 h時(shí)達(dá)到最大,而烏頭堿、次烏頭堿溶出率均在煎煮2 h、1 h時(shí)達(dá)到最高,隨后呈下降趨勢(shì)[71]。因此,煎煮時(shí)間對(duì)附子毒-效轉(zhuǎn)化有重要的影響。

項(xiàng)目組進(jìn)一步研究表明:附子在煎煮時(shí)間、給藥劑量和毒效變化的三因素之間存在密切的關(guān)系,是聯(lián)合控毒的重要手段,并首次將均勻設(shè)計(jì)理論用于中藥安全性評(píng)價(jià)研究中。項(xiàng)目組觀察了不同附子煎煮時(shí)間水煎液(15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h)對(duì)疼痛、炎性反應(yīng)、脾陽(yáng)虛證和腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型的急性毒性和藥理作用。結(jié)果顯示附子15 min～4 h水煎液對(duì)各種模型均有明顯的急性毒性作用。在煎煮6 h時(shí),毒性較低的情況下,仍保留了較好的藥理作用,能延長(zhǎng)熱板法小鼠痛閾值,延長(zhǎng)冰醋酸致痛小鼠扭體反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間和減少扭體次數(shù),降低二甲苯所致小鼠耳郭腫脹程度,降低巴豆油致肉芽腫,增加脾陽(yáng)虛證和腎陽(yáng)虛證小鼠的體重和升高體溫,延長(zhǎng)腎陽(yáng)虛小鼠游泳時(shí)間等。在抗炎鎮(zhèn)痛作用中,發(fā)現(xiàn)15 min和30 min水煎液作用最強(qiáng),但同時(shí)毒性也太大[72-73]。此外,秦永剛等[74]采用離體蛙心實(shí)驗(yàn),對(duì)不同蒸煮時(shí)間的附子進(jìn)行了強(qiáng)心作用及心臟毒性的觀察,發(fā)現(xiàn)附子蒸煮8 h、10 h、12 h具有強(qiáng)的正性肌力作用,且心臟毒性顯著減低。以上表明:不同的煎煮方法是促進(jìn)附子毒-效轉(zhuǎn)化的重要手段。

4.5 代謝引起的毒-效轉(zhuǎn)化 藥物代謝可影響藥物作用的強(qiáng)弱和持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短,還會(huì)影響藥物治療的安全性。研究發(fā)現(xiàn),大鼠尾靜脈給藥0.6 μg/kg烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿后,大鼠體內(nèi)不僅檢測(cè)到了烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿,在水解酶的作用下,還檢測(cè)到了苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、新烏頭原堿,表明毒性很大的雙酯型生物堿在體內(nèi)可被代謝為毒性較低的單酯型生物堿和無(wú)酯型生物堿,并且雙酯型生物堿在體內(nèi)的消除比其代謝產(chǎn)物苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、新烏頭原堿快2.6-7.5倍,即毒性越大的烏頭堿類生物堿被機(jī)體消除的速率越快[75]。另有研究表明,在大鼠肝微粒體的作用下,烏頭堿比苯甲酰烏頭原堿、烏頭原堿更易代謝。通過(guò)組織分布實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這3種生物堿在所有器官中均有分布,但烏頭堿的分布區(qū)域最小[76]。此外,與其他藥物配伍使用也可影響附子生物堿的代謝過(guò)程。例如,在中國(guó)以及其他亞洲國(guó)家,綠豆是一種傳統(tǒng)的解毒藥,烏頭堿與500 μg/kg的綠豆提取物合用后,可將烏頭堿Cmax、AUC0→t和AUC0→∞減少1.5倍。通過(guò)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),綠豆降低烏頭堿急性毒性的機(jī)制是阻止烏頭堿在腸的吸收[77]。

5 結(jié)語(yǔ)

附子作為療效顯著的大毒中藥,歷來(lái)是人們關(guān)注和研究的熱點(diǎn),在過(guò)去的100年間,人們對(duì)附子開(kāi)展了大量的研究,以期揭開(kāi)其神秘的面紗,明晰其治病和致毒的根本原因,但現(xiàn)在看來(lái),仍然任重而道遠(yuǎn)。在化學(xué)成分研究方面,近年來(lái)取得了很大的進(jìn)展,共從附子(the lateral roots ofAconitumcarmichaelii)中獲得90余個(gè)化合物(不含川烏),但大部分化學(xué)成分研究集中于附子脂溶性成分,對(duì)傳統(tǒng)應(yīng)用的附子水煎液研究較少;大部分研究集中于生物堿類,對(duì)其他成分的深入研究較少;大部分針對(duì)附子生物堿的研究多集中于二萜生物堿類,對(duì)其他生物堿的研究較少;后續(xù)的活性篩選、藥效研究和毒理研究不足。因此,附子毒-效作用的本質(zhì)仍然迷霧重重,這可能需要我們換一種方式去理解有毒中藥的整體情況,在現(xiàn)有條件和背景下,采用整合分析的方式去探討毒-效相互轉(zhuǎn)化和辨證統(tǒng)一的關(guān)系。

中藥的毒與效是客觀存在的,尤其在療效顯著的大毒中藥中,毒和效既是矛盾的,又是統(tǒng)一的。同一組分、成分在不同條件下,可能發(fā)揮完全不同的生物學(xué)效應(yīng),也可能向不同的成分轉(zhuǎn)變,實(shí)現(xiàn)毒與效的轉(zhuǎn)化。這種不同條件可以是最常見(jiàn)的化學(xué)因素、也可以是劑量因素、模型因素、炮制因素、配伍因素、使用方法因素、代謝因素等,這與中醫(yī)藥的傳統(tǒng)思想是完全吻合的。附子既可以強(qiáng)心,也可以導(dǎo)致心臟毒性;既有鎮(zhèn)痛效果,又會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性。因此,毒效整合分析思路打開(kāi)了了解附子物質(zhì)基礎(chǔ)的另一扇窗戶,也為認(rèn)識(shí)其他有毒中藥提供了一種方式,但是仍然有大量的基礎(chǔ)工作亟待開(kāi)展,以形成一個(gè)相對(duì)完整的毒-效轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)。

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DiscussiononMaterialBasisofToxicHerbRadixAconitiLateralisPraeparataBasedonthe“IntegratedAnalyticalMethodofToxicityandEfficacy”

Xiong Liang, Peng Cheng, Miao Lulin, He Yulin, Meng Chunwang, Su Haiguo

(CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine;KeyLaboratoryofChineseHerbsStandardizationofMinistryofEducation;Co-constructKeyLaboratoryofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicinalResources,Chengdu611137,China)

Chinese medicinal has both toxicity and efficacy, especially in extremely toxic drugs with potent efficacy. The toxicity and efficacy of Chinese medicinal are both contradictory and unified. The toxic and effective material basis often affect and transform to each other. Radix Aconiti Lateralis Praeparata, a famous Chinese medicinal, not only has significant efficacy, but also extremely toxic. Thus, it has been a hotspot for research. Although more than 90 compounds have been isolated from Radix Aconiti Lateralis Praeparata, the basic reason for its efficacy and toxicity still remains to be revealed. The complexity of the problem is that the toxicity and efficacy of Radix Aconiti Lateralis Praeparata can transform to each other under different conditions. For example, it has significant cardiotonic effect, while it can also cause cardiotoxicity. Similarly, it can release pain, but has neurotoxicity. Moreover, the same component may exert completely different biological effect due to the different dosage, model, processing method, compatibility of Chinese medicinals, and drug metabolism. Based on our research results and literatures of Radix Aconiti Lateralis Praeparata, this paper will discuss on the material basis of Radix Aconiti Lateralis Praeparata by “integrated analytical method of toxicity and efficacy”.

Radix Aconiti Lateralis Praeparata; Material basis; Integrated analysis of toxicity and efficacy; Chemical components; Transformation between toxicity and efficacy

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(81630101);國(guó)家發(fā)改委標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目(ZYBZH-C-SC-51);國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金(J1310034);四川省中醫(yī)藥管理局“川產(chǎn)道地藥材綜合開(kāi)發(fā)與區(qū)域發(fā)展”項(xiàng)目(2016ZY008)

熊亮(1983.06—),男,博士,教授,研究方向：中藥藥效物質(zhì)及天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),E-mail:xiling0505@126.com

彭成(1964.03—),男,博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,研究方向：中藥毒效的系統(tǒng)評(píng)價(jià)與整合研究,E-mail:pengchengchengdu@126.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.005

(2017-10-09收稿 責(zé)任編輯：王明)