豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測試劑盒的研制

余 波，楊 莉，姜玲玲，徐景峨，周思旋，楊粵黔

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因SYBRGreenⅠ熒光定量PCR檢測試劑盒的研制

余 波，楊 莉，姜玲玲，徐景峨，周思旋，楊粵黔

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

根據(jù)GenBank中豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因floR的序列設(shè)計1對特異性引物，擴增出floR基因片段，克隆到pMD-18T載體上，構(gòu)建pMD-18T-floR陽性標準質(zhì)粒。通過SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化、熒光定量PCR標準曲線的建立、熔解曲線的分析及敏感性、特異性、重復性試驗，建立針對豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因floR的熒光定量PCR檢測方法，并研制出檢測試劑盒，同時對從養(yǎng)殖場分離的156株大腸桿菌進行耐藥表型和耐藥基因檢測。結(jié)果顯示，研制的試劑盒靈敏度可達1.0×101拷貝，重復性好，特異性強，對大腸桿菌磺胺類耐藥菌株、β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株檢測均為陰性，熔解曲線分析,擴增產(chǎn)物的熔解溫度為88.8～89.2 ℃，沒有引物二聚體和非特異性擴增峰出現(xiàn)，耐藥表型與耐藥基因檢測符合率為96.7%。表明研制的試劑盒適合于臨床樣品豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因的檢測。

豬源大腸桿菌； 氟苯尼考；floR基因； SYBR GreenⅠ熒光定量 PCR

致病性大腸桿菌是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原菌，廣泛存在于世界各地，不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，而且危害人類健康[1]。目前，治療大腸桿菌病主要使用抗生素，而抗生素的大量濫用，造成大腸桿菌的耐藥菌株逐漸增多[2-7]。近年來，氟苯尼考作為廣譜抗菌藥被大量濫用，大腸桿菌對其耐藥性日益嚴重[8-9]。目前，關(guān)于大腸桿菌對氟苯尼考耐藥機制的研究主要集中在floR基因上，該基因能夠在多種病原菌間水平轉(zhuǎn)移。因此，掌握floR基因在大腸桿菌中的散播情況以及大腸桿菌對氟苯尼考的耐藥現(xiàn)狀具有重要意義，這需要建立快速簡便的floR基因檢測方法。為此，通過對SYBR GreenⅠ熒光定量PCR條件的優(yōu)化，研制大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因PCR檢測試劑盒，以期快速準確檢測大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

菌株：大腸桿菌標準毒株、大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株、大腸桿菌磺胺類耐藥菌株、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大腸桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株以及2015—2017年從貴州省貴陽市、大方縣、安順市、甕安縣等規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場分離鑒定的156株大腸桿菌，均由貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所獸用中草藥研究室保存。

主要試劑：2×TaqPCR Mastermix、Goldview核酸染料、DL2000、感受態(tài)細胞DH5α、pMD-18T克隆載體、細菌DNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等均購自天根生化科技(北京)有限公司；SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR酶購自寶生物(大連)工程有限公司；氟苯尼考藥敏試紙購自杭州微生物試劑有限公司(批號為20161122)。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中floR基因設(shè)計1對特異性引物，上游引物：5′-GCTCAACGTGAGTTG-GATCATA-3′，下游引物：5′-CACTGCTGCTGATGGC-TCCTTTC-3′。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 DNA提取 應(yīng)用細菌DNA快速提取試劑盒提取大腸桿菌標準毒株、大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株、大腸桿菌磺胺類耐藥菌株、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大腸桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株的DNA，將提取的DNA于-20 ℃保存。

1.2.3 pMD-18T-floR陽性標準質(zhì)粒的構(gòu)建 利用1.2.1中的引物，以大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株DNA為模板進行 PCR 擴增，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。

將擴增的PCR產(chǎn)物與pMD-18T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，重組質(zhì)粒命名為pMD-18T-floR，同時送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒進行濃度和純度測定，作為陽性標準品。

1.2.4 大腸桿菌floR基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法的建立

1.2.4.1 反應(yīng)條件優(yōu)化 熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化包括引物濃度(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L)、退火溫度(50 ℃、55 ℃、60 ℃)、ROX Reference Dye的用量(0.5 μL、1.0 μL)。熒光定量PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 10 s；94 ℃ 5 s，退火溫度(50 ℃/55 ℃/60 ℃)退火10 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。

1.2.4.2 標準曲線建立 將重組質(zhì)粒的濃度和純度進行測定后，計算DNA拷貝數(shù)，作為陽性標準品進行10倍倍比稀釋。以優(yōu)化好的條件進行擴增，每個稀釋倍數(shù)3個重復，以拷貝數(shù)為橫坐標，以Ct值為縱坐標建立標準曲線。

1.2.4.3 熔解曲線分析 在大腸桿菌floR基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)程序完成后，對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析，分析是否存在引物二聚體或非特異性擴增。

1.2.4.4 敏感性試驗 計算重組質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)，10倍倍比稀釋后分別進行熒光定量PCR，每個稀釋倍數(shù)3個重復，以確定熒光定量PCR敏感性。

1.2.4.5 特異性試驗 分別將大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株、大腸桿菌磺胺類耐藥菌株、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大腸桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株DNA進行熒光定量PCR，每個樣品3個重復，以確定熒光定量PCR特異性。

1.2.4.6 重復性試驗 應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法重復檢測大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株樣品3次，以確定建立的熒光定量PCR檢測方法的穩(wěn)定性。

1.2.5 大腸桿菌floR基因檢測試劑盒的組裝與保存期檢測 以建立的熒光定量PCR方法所需試劑組裝試劑盒，每個試劑盒按檢測20次樣品組裝，包括引物、熒光定量PCR反應(yīng)混合液、ROX Reference Dye核酸染料、陽性對照(大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株DNA)、陰性對照(大腸桿菌標準毒株DNA)、超純水。

將試劑盒分別保存于4 ℃和-20 ℃，同時分別保存3個月、6個月、12個月，對陽性標準品進行檢測，觀察試劑盒的穩(wěn)定性。

1.2.6 臨床大腸桿菌氟苯尼考耐藥表型與耐藥基因檢測 對從生豬養(yǎng)殖場分離的156株致病性大腸桿菌進行液體培養(yǎng)，利用平板計數(shù)法進行計數(shù)，按傳統(tǒng)藥敏紙片法檢測分離菌株對氟苯尼考的敏感性，測定抑菌圈直徑大小，敏感度的判定根據(jù)杭州微生物試劑有限公司提供的標準進行。同時提取臨床大腸桿菌分離株的DNA，應(yīng)用研制的試劑盒對其floR基因進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMD-18T-floR陽性標準品的制備

對大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株 DNA進行PCR擴增，擴增出148 bp的目的片段，無非特異性擴增(圖1)。將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank中的floR基因序列比對，相似度為98.4%～100%。將擴增的floR基因片段與pMD-18T克隆載體連接，構(gòu)建重組陽性質(zhì)粒pMD-18T-floR。

M：DL2000；1：floR基因；2：陰性對照

2.2 大腸桿菌floR基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

熒光定量PCR條件的優(yōu)化結(jié)果為：在25 μL反應(yīng)體系中引物2 μL(引物濃度10 μmol/L)、Premix ExTaq12.5 μL、ROX Reference Dye 0.5 μL、模板 1 μL，退火溫度選擇55 ℃;在此條件下出現(xiàn)最高的熒光值、最小的Ct值，且熔解曲線分析中不出現(xiàn)非特異性擴增峰。

2.3 大腸桿菌floR基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)標準曲線的建立

分別以1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷貝4種不同含量重組質(zhì)粒作為模板進行熒光定量PCR擴增反應(yīng)，每個含量重復3次，制作熒光定量PCR反應(yīng)標準曲線，得到線性回歸方程為Ct=-3.670×lg拷貝數(shù)+22.59(R2=0.999)(圖2)。

圖2 大腸桿菌floR基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR標準曲線

2.4 大腸桿菌floR基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR熔解曲線分析

在大腸桿菌floR基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析，擴增產(chǎn)物的熔解溫度為88.8～89.2 ℃，沒有引物二聚體和非特異性擴增出現(xiàn)(圖3)。

2.5 大腸桿菌floR基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR敏感性試驗結(jié)果

分別以1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷貝等6種不同含量重組質(zhì)粒作為模板進行熒光定量PCR擴增，每個含量重復3次，結(jié)果顯示，其靈敏度為1.0×101拷貝(圖4)。

圖3 大腸桿菌floR基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR熔解曲線

2.6 大腸桿菌floR基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR特異性試驗結(jié)果

分別以大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株、大腸桿菌磺胺類耐藥菌株、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大腸桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株DNA為模板進行熒光定量PCR，以確定建立的熒光定量PCR檢測方法的特異性，結(jié)果顯示，大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株檢測結(jié)果為陽性，而大腸桿菌磺胺類耐藥菌株、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大腸桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株DNA為陰性(圖5)?？梢?，建立的熒光定量PCR檢測方法特異性強。

1～6：重組質(zhì)粒 DNA 分別為1.0×105～1.0×100拷貝

1：大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株；2～4：分別為大腸桿菌磺胺類耐藥菌株、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大腸桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株

2.7 大腸桿菌floR基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR重復性試驗結(jié)果

應(yīng)用建立的方法重復檢測大腸桿菌floR基因陽性菌株3次，結(jié)果顯示，擴增曲線重復性較好。

2.8 試劑盒的檢測結(jié)果

試劑盒組成：特異性引物 40 μL、熒光定量PCR反應(yīng)混合液250 μL、ROX Reference Dye 20 μL、陰性對照 20 μL、陽性對照 20 μL、超純水 500 μL。

試劑盒分別保存在4 ℃、-20 ℃，分別于3個月、6個月、12個月后對大腸桿菌floR基因標準陽性質(zhì)粒進行檢測，試劑盒于4 ℃保存6個月、12個月后敏感性分別降低10倍、1 000倍；試劑盒于-20 ℃保存3個月、6個月后敏感性未降低，保存12個月敏感性降低10倍。

2.9 臨床大腸桿菌氟苯尼考耐藥性與耐藥基因檢測結(jié)果

由表1可知，氟苯尼考藥敏試驗共檢測出88株耐藥表型菌株，試劑盒檢測出85株floR基因陽性，而藥敏試驗檢測出對氟苯尼考敏感的68株大腸桿菌中，試劑盒檢測有6株floR基因陽性，156株分離大腸桿菌耐藥表型和floR基因檢測符合率為96.7%(88/91)。

表1 大腸桿菌藥物敏感性與floR基因檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

氟苯尼考具有抗菌譜廣、吸收快等特點，可以廣泛用于治療畜禽養(yǎng)殖中的細菌性疾病，在生豬養(yǎng)殖場中廣泛用于治療仔豬腹瀉、豬喘氣病、傳染性胸膜肺炎等，尤其是作為仔豬腹瀉的預防保健藥[10-11]。本研究中，分離的156株致病性大腸桿菌有88株表型耐藥，耐藥率達到56.4%(88/156)?？梢姡i養(yǎng)殖場中大腸桿菌對氟苯尼考耐藥嚴重，可這能和養(yǎng)殖場使用氟苯尼考作為保健藥，以及治療中大量濫用有關(guān)[12]。

floR基因作為大腸桿菌的外排泵基因，通過編碼外排泵蛋白將體內(nèi)的氟苯尼考泵出體外，以降低細菌內(nèi)氟苯尼考的濃度，從而抑制氟苯尼考的抑菌作用，同時floR基因是質(zhì)粒介導的耐藥基因，可以在菌株間相互轉(zhuǎn)移，從而造成耐藥性廣泛傳播[13-15]。本研究根據(jù)GenBank中豬源大腸桿菌對氟苯尼考耐藥的floR基因序列，建立豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因熒光定量PCR檢測方法，靈敏度可達1.0×101拷貝，與傳統(tǒng)的藥敏試驗檢測結(jié)果符合率達96.7%(88/91)，表明研制的試劑盒可用于大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因的檢測。本研究中，應(yīng)用研制的試劑盒檢測88株表型耐藥菌株中，有85株floR基因陽性，這可能與大腸桿菌對氟苯尼考存在其他耐藥機制有關(guān)[16]。同時，藥敏試驗結(jié)果為陰性的68株大腸桿菌中，試劑盒檢測出6株floR基因陽性，其中有5株表型為中度敏感，1株表型為敏感，這可能與耐藥基因出現(xiàn)個別堿基變異或缺失引起外排泵功能減弱或喪失有關(guān)[17-18]。

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A SYBR GreenⅠReal-time Quantitative PCR Kit for Detection of Florfenicol Resistance Gene floR of Escherichia coli from Swine

YU Bo,YANG Li,JIANG Lingling,XU Jinge,ZHOU Sixuan,YANG Yueqian

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang 550005,China)

According to the florfenicol resistance genefloRofEscherichiacoliin GenBank,one pair of specific primers was designed for amplifying the specific fragments offloRgene.ThenfloRgene was amplified by PCR and cloned into pMD-18T vector,which was used as positive standard plasmid.Through optimization of the reaction conditions,establishment of standard curve,analysis of melting curve and test of sensitivity,specificity and repeatability,a SYBR Green Ⅰ real-time quantitative PCR was established and diagnostic kit was developed.156 strains ofEscherichiacoliwhich were isolated from swine farms were studied on drug resistance phenotype and drug resistance gene.The PCR kit was highly sensitive(1.0×101copies DNA),and had a good reproducibility,specificity.The kit test result was negative for sulfonamides resistant strains,beta lactam resistant strains and macrolide resistant strains ofEscherichiacoliisolated from swine.The melting curve analysis showed that the dissolution temperature of the amplified product was between 88.8 ℃and 89.2 ℃,and there were no primer dimers and non-specific amplification peaks.The coincidence rate of drug resistance phenotype and resistance gene was 96.7%.The results showed that the SYBR Green Ⅰ real-time quantitative PCR kit was suitable for the detection of florfenicol resistance genefloRofEscherichiacoliin clinical samples．

swineEscherichiacoli; florfenicol;floRgene; SYBR greenⅠreal-time quantitative PCR

S855 .1

A

1004-3268(2017)11-0152-05

2017-05-24

貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目(黔科合NY[2015]3009-2號)；貴州省重大科技專項(黔科合重大專項字[2013]6014號)；貴州省科學技術(shù)基金項目(黔科合LH字[2014]7694號)

余 波(1981-)，男，四川鄰水人，副研究員，碩士，主要從事獸醫(yī)微生物與中獸藥研究。E-mail:yubonky@163.com