• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬肺炎支原體與豬鼻支原體分離鑒定及鑒別檢測

    2017-12-20 00:47:53李海利鄧祖麗穎徐引弟王治方張青嫻朱文豪方劍玉侯自花郎利敏王克領(lǐng)
    河南農(nóng)業(yè)科學 2017年11期
    關(guān)鍵詞:豬鼻病料病原

    李海利,鄧祖麗穎,徐引弟,王治方,張青嫻,朱文豪,方劍玉,游 一,侯自花,郎利敏,王克領(lǐng)

    (1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州 450002;2.鄭州幼兒師范高等??茖W校,河南 鄭州 450000)

    豬肺炎支原體與豬鼻支原體分離鑒定及鑒別檢測

    李海利1,鄧祖麗穎2,徐引弟1,王治方1,張青嫻1,朱文豪1,方劍玉1,游 一1,侯自花1,郎利敏1,王克領(lǐng)1

    (1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州 450002;2.鄭州幼兒師范高等??茖W校,河南 鄭州 450000)

    為建立豬肺炎支原體與豬鼻支原體的鑒別診斷方法,對從河南省及周邊地區(qū)豬場采集的患呼吸道疾病的豬只樣品進行支原體的分離培養(yǎng),針對豬肺炎支原體與豬鼻支原體設計了2對引物,擴增片段大小分別為480 bp和360 bp,對所分離純化的病原微生物進行了菌落形態(tài)觀察及分子鑒定。結(jié)果顯示,分離的病原微生物為支原體,菌落呈典型的“煎蛋樣”特征;通過單一PCR擴增反應,分別得到了豬肺炎支原體與豬鼻支原體相應的目的擴增片段。表明分離到了豬肺炎支原體與豬鼻支原體。在單一擴增的基礎(chǔ)上,建立了豬肺炎支原體與豬鼻支原體二重PCR反應方法,可同時得到2條目的條帶,與單一PCR擴增結(jié)果一致。表明建立的二重PCR方法可用于豬肺炎支原體與豬鼻支原體的同時檢測和鑒別診斷。

    豬肺炎支原體; 豬鼻支原體; 鑒別診斷; 二重PCR

    豬支原體肺炎(MPS)又稱豬地方流行性肺炎,俗稱豬氣喘病,是由豬肺炎支原體引起的豬的一種慢性呼吸道傳染病[1-3]。其主要臨床癥狀為咳嗽和氣喘,病理變化特征是肺的尖葉、心葉、中間葉和隔葉前緣呈肉樣或蝦肉樣實變[4-5]。該病廣泛分布于世界各地,主要特點是高接觸性、高傳染性、高發(fā)病率和低死亡率[6],可導致日增質(zhì)量減少、長期生長不良、飼料報酬率大幅下降[7-8]。該病常與其他呼吸道病原如多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌或胸膜肺炎放線桿菌等協(xié)同感染引起豬地方性肺炎,常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒和豬圓環(huán)病毒協(xié)同感染引起豬呼吸道綜合征[9]。豬鼻支原體(Mhn)通常存在于豬鼻腔和扁桃體中,一般條件下并不致病。但豬鼻支原體感染肺臟時可引起肺炎,還可導致多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎[10-11]。

    豬肺炎支原體和豬鼻支原體發(fā)病率較高,一般在50%~80%,個別新建豬場或感染豬場發(fā)病率可達100%,死亡率高達14%~37%[12-13]。流行后期或老疫區(qū)則以哺乳仔豬和斷奶仔豬多發(fā),死亡率較高[14-15],母豬和成年豬多呈慢性和隱性感染[16-18]。病豬與健康豬群混合飼養(yǎng),常引起豬支原體肺炎的暴發(fā)。消除患病動物和徹底消毒,切斷傳播途徑,加強檢疫和監(jiān)測,對防治豬支原體肺炎和豬鼻支原體具有重要意義[19]。

    支原體可持續(xù)存在,并且可導致其他疫苗免疫失敗[20-23]。豬支原體病流行于世界各地,在畜牧業(yè)發(fā)達的美國、澳大利亞等國也普遍存在,造成了巨大的經(jīng)濟損失[24-27]。防控豬支原體肺炎需掌握支原體的流行特征,豬肺炎支原體與豬鼻支原體的臨床癥狀相似,且在形態(tài)上難以區(qū)分,因而對豬肺炎支原體抗體的檢測與豬鼻支原體的鑒別診斷顯得尤為重要。鑒于此,建立豬肺炎支原體與豬鼻支原體的鑒別檢測方法,旨在為控制豬支原體肺炎奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試病料 從河南省及周邊地區(qū)豬場采集的患呼吸道疾病樣品由河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保存。

    1.1.2 主要試劑 葡萄糖、PPLO肉湯粉、酵母粉、瓊脂粉、馬血清、精氨酸、青霉素等購自北京路橋生物技術(shù)有限公司;EDTA、聚乙二醇辛基苯基醚、異硫氰酸酯、氯化鈉購自Sigma公司。dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、DNA Marker、ExTaq(5 U/μL)、MgCl2(25 mmol/L)、10×PCR Buffer (Mg2+free)、RNase Free dH2O等均購自TaKaRa公司;瓊脂糖購于Biowest公司;EB染料替代染液購自上海萊楓生物科技有限公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 病原微生物分離 取具有典型癥狀的支原體病例肺臟組織,表面無菌消毒,取肺臟組織樣本5 g涂于固體培養(yǎng)基表面,放置于37 ℃、含5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),同時將小塊無菌肺臟組織樣本投入到50 mL PPLO液體培養(yǎng)基中。3~5 d后,用光學顯微鏡低倍觀察菌落形態(tài)。取待檢病原微生物純培養(yǎng)物進行姬姆薩氏染色,于顯微鏡油鏡下觀察病原微生物形態(tài)。

    將采集的鼻咽拭子浸入裝有滅菌生理鹽水的管中,于24 h內(nèi)送入實驗室,用0.50 μm濾膜過濾生理鹽水除雜菌,涂于PPLO固體培養(yǎng)基表面或PPLO液體培養(yǎng)基中,放置于37 ℃、含5%的CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3~5 d后,用光學顯微鏡低倍觀察菌落形態(tài)。取待檢病原微生物純培養(yǎng)物進行姬姆薩氏染色,于顯微鏡油鏡下觀察病原微生物形態(tài)。

    1.2.2 引物設計 引物用Array Designer 2.0 軟件根據(jù)豬肺炎支原體(GenBank No.AF004388)和豬鼻支原體(GenBank No.NC014448.1)序列設計,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為MphF:5′-GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA-3′,MphR:5′-GTGGACTACCAGGGTATCT-3′;MhnF:5′-TGAAG-CTGTGAAGCTCCTTTC-3′,MhnR:5′-TGTTGAACG-GGATGTAGCAA-3′。預期擴增片段大小分別為480 bp和360 bp。

    1.2.3 分離病原微生物基因組模板的提取 采用柱式DNA提取方法提取基因組。具體操作如下:(1)取適量菌體加入500 μL裂解液(40 mmol/L EDTA,2%聚乙二醇辛基苯基醚,2 mol/L異硫氰酸酯,0.7 mol/L氯化鈉),70 ℃水浴2 min,12 000 r/min離心30 s;(2)上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中,加500 μL無水乙醇,轉(zhuǎn)到DNA純化柱上,12 000 r/min離心30 s,倒掉收集管中的廢液;(3)用500 μL沖洗液1(10 mmol/L EDTA,70%乙醇,pH值7.0)沖洗,12 000 r/min離心30 s,倒掉收集管中的廢液;(4)用600 μL沖洗液2(75 mmol/L Tris-HCl,80%乙醇,pH值7.0)沖洗,12 000 r/min離心30 s,倒掉收集管中的廢液,重復1次;(5)將柱子轉(zhuǎn)到新的離心管上,加50 μL焦碳酸二乙酯水,12 000 r/min離心30 s,即可得到高純度的DNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 分離病原微生物PCR擴增 擴增體系為25.0 μL:10×PCR Buffer(Mg2+free) 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L) 2 μL,Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2 μL,DNA模板2 μL,正、反引物(10 μmol/L)各1 μL,RNase Free dH2O補充至25 μL。PCR擴增程序為:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,57 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,進行35個循環(huán);72 ℃再延伸5 min。反應結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。取PCR產(chǎn)物5 μL進行點樣,120 V電壓下電泳30 min。

    1.2.5 分離病原微生物二重PCR反應 擴增體系為25.0 μL:10×PCR Buffer(Mg2+free) 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L) 2 μL,Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2 μL,DNA 2 μL,豬肺炎支原體和豬鼻支原體正、反引物(10 μmol/L)各1 μL,RNase Free dH2O補充至25 μL。PCR擴增程序為:95 ℃預變性2 min;94 ℃變性1 min,59 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,進行32個循環(huán)后,72 ℃再延伸2 min。反應結(jié)束后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

    1.2.6 檢測方法的應用 用建立的二重PCR檢測方法對從河南省及周邊地區(qū)豬場采集的患呼吸道疾病的16份病料進行檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 分離病原微生物形態(tài)學觀察及鏡檢

    分離病原微生物在含0.4%酚紅PPLO的液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基由紅變黃,呈輕微渾濁,在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5~7 d,觀察可見圓形隆起、邊緣整齊、表面粗糙、中央有顆粒的針尖大小或露珠狀小菌落。菌落呈支原體的“煎蛋樣”典型特征(圖1)。取待檢病原微生物純培養(yǎng)物進行姬姆薩氏染色25 min,于顯微鏡下觀察分離病原微生物形態(tài),形態(tài)不一,大多呈絲狀(圖2)。

    圖1 分離病原微生物菌落形態(tài)

    圖2 分離病原微生物在顯微鏡下的形態(tài)

    2.2 分離病原微生物PCR擴增結(jié)果

    從圖3可以看出,擴增產(chǎn)物電泳后,在480 bp和360 bp處均可見特異性擴增條帶(圖3),與預期結(jié)果一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化和測序,所得序列與數(shù)據(jù)庫中豬肺炎支原體和豬鼻支原體同源性達99%。

    M.Marker 2000;1.空白對照;2.豬鼻支原體;3.豬肺炎支原體

    2.3 豬肺炎支原體與豬鼻支原體二重PCR擴增結(jié)果

    按照上述單重PCR擴增進行二重PCR,結(jié)果顯示,擴增產(chǎn)物在480 bp和360 bp處均可見特異性擴增條帶(圖4),與豬肺炎支原體和豬鼻支原體預期結(jié)果一致。

    M.Marker 2000;1.豬肺炎支原體;2.豬鼻支原體;3.豬肺炎支原體與豬鼻支原體二重擴增

    2.4 建立檢測方法的應用結(jié)果

    應用上述研究所建立的方法對臨床16份病料進行檢測,有5份病料檢測為豬肺炎支原體,5份病料檢測為豬鼻支原體,6份病料檢測為陰性(圖5),陽性檢出率為62.5%。

    M.Marker 2000;3、9、10、11、12為豬肺炎支原體;2、5、6、7、8為豬鼻支原體;1、4、13、14、15、16為陰性

    3 結(jié)論

    本研究對河南省及周邊地區(qū)的豬場患呼吸道疾病的樣品進行支原體的分離,通過菌落觀察、形態(tài)學觀察及分子診斷鑒定,表明分離純化的病原微生物為豬肺炎支原體與豬鼻支原體。在光學顯微鏡下低倍觀察支原體菌落形態(tài),菌落呈“煎蛋樣”典型特征。針對豬肺炎支原體與豬鼻支原體設計了2對引物,擴增片段大小分別為480 bp和360 bp,通過單一PCR擴增反應,分別得到了豬肺炎支原體與豬鼻支原體相應的目的擴增片段。在單一擴增的基礎(chǔ)上,建立了豬肺炎支原體與豬鼻支原體二重PCR反應方法,可同時得到2條目的條帶,與單一PCR擴增結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明,建立的二重PCR方法可用于豬肺炎支原體與豬鼻支原體的同時檢測和鑒別診斷,且簡便快捷,靈敏度高,特異性強。

    [1] Lauritsen K T,Hagedorn-Olsen T,Jungersen G,etal.Transfer of maternal immunity to piglets is involved in early protection againstMycoplasmahyosynoviaeinfection[J].Vet Immunol Immunop,2017,183:22-30.

    [2] Ishag H Z A,Xiong Q Y,Liu M J,etal.E.colirecAgene improves gene targeted homologous recombination inMycoplasmahyorhinis[J].J Microbiol Meth,2017,136:49-56.

    [3] Lee J A,Oh Y R,Hwang M A,etal.Mycoplasmahyorhinisis a potential pathogen of porcine respiratory disease complex that aggravates pneumonia caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Vet Immunol Immunop,2016,177:48-51.

    [4] Ishag H Z A,Liu M J,Yang R S,etal.GFP as a marker for transient gene transfer and expression inMycoplasmahyorhinis[J].Springerplus,2016,5:1-4.

    [5] Gomes-Neto J C,Raymond M,Bower L,etal.Two clinical isolates ofMycoplasmahyosynoviaeshowed differing pattern of lameness and pathogen detection in experimentally challenged pigs[J].J Vet Sci,2016,17(4):489-496.

    [6] Chen D,Wei Y,Huang L,etal.Synergistic pathogenicity in sequential coinfection withMycoplasmahyorhinisand porcine circovirus type 2[J].Vet Microbiol,2016,182:123-130.

    [7] Chen D J,Wei Y W,Huang L P,etal.Characterization and application of monoclonal antibodies againstMycoplasmahyorhinispyruvate dehydrogenase E1 complex subunit alpha[J].Appl Microbiol Biot,2016,100(8):3587-3597.

    [8] Dahlia H,Tan L J,Zarrahimah Z,etal.Isolation ofMycoplasmahyosynoviaefrom pneumonic lung of swine[J].Trop Biomed,2009,26(3):341-345.

    [9] Lauritsen K T,Hagedorn-Olsen T,Friis N F,etal.Absence of strictly age-related resistance toMycoplasmahyosynoviaeinfection in 6-week-old pigs[J].Vet Microbiol,2008,130(3/4):385-390.

    [10] Nielsen E O,Lauritsen K T,Friis N F,etal.Use of a novel serum ELISA method and the tonsil-carrier state for evaluation ofMycoplasmahyosynoviaedistributions in pig herds with or without clinical arthritis[J].Veterinary Microbiology,2005,111(1/2):41-50.

    [11] Kokotovic B,Friis N F,Nielsen E O,etal.Genomic diversity among Danish field strains ofMycoplasmahyosynoviaeassessed by amplified fragment length polymorphism analysis[J].Veterinary Microbiology,2002,85(3):221-231.

    [12] Xiong Q Y,Zhang B X,Wang J,etal.Characterization of the role in adherence ofMycoplasmahyorhinisvariable lipoproteins containing different repeat unit copy numbers[J].Veterinary Microbiology,2016,197:39-46.

    [13] Xiong Q Y,Wang J,Ji Y,etal.The functions of the variable lipoprotein family ofMycoplasmahyorhinisin adherence to host cells[J].Veterinary Microbiology,2016,186:82-89.

    [14] Unterweger C,Wochtl B,Spergser J,etal.Influenza outbreak in weaners with involvement ofMycoplasmahyorhinisandHaemophilusparasuis[J].Tieraerztl Prax G N,2016,44(4):259-265.

    [15] Voorde J V,Vervaeke P,Liekens S,etal.Mycoplasmahyorhinis-encoded cytidine deaminase efficiently inactivates cytosine-based anticancer drugs[J].Febs Open Bio,2015,5:634-639.

    [16] Palzer A,Kolb K,Strutzberg-Minder K,etal.Serological course investigations ofHaemophilusparasuisandMycoplasmahyorhinisin three pig farms[J].Schweiz Arch Tierheilkd,2015,157(2):97-103.

    [17] Palzer A,Haedke K,Heinritzi K,etal.Associations amongHaemophilusparasuis,Mycoplasmahyorhinis,and porcine reproductive and respiratory syndrome virus infections in pigs with polyserositis[J].Can Vet J,2015,56(3):285-287.

    [18] Kornspan J D,Tsur M,Tarshis M,etal.Mycoplasmahyorhinisinduces proinflammatory responses in mice lymphocytes[J].J Basic Microb,2015,55(5):679-684.

    [19] Neto J C G,Bower L,Erickson B Z,etal.Quantitative real-time polymerase chain reaction for detectingMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinisin pen-based oral,tonsillar,and nasal fluids[J].Journal of Veterinary Science,2015,16(2):195-201.

    [20] Kokotovic B,Friis N F,Ahrens P.Characterization ofMycoplasmahyosynoviaestrains by amplified fragment length polymorphism analysis,pulsed-field gel electrophoresis and 16S ribosomal DNA sequencing[J].J Vet Med B,2002,49(5):245-252.

    [21] Nielsen E O,Nielsen N C,Friis N F.Mycoplasmahyosynoviaearthritis in grower-finisher pigs[J].J Vet Med A,2001,48(8):475-486.

    [22] Boye M,Jensen T K,Ahrens P,etal.In situ hybridisation for identification and differentiation ofMycoplasmahyopneumoniae,MycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinisin formalin-fixed porcine tissue sections[J].Apmis,2001,109(10):656-664.

    [23] Neto J C G,Strait E L,Raymond M,etal.Antibody responses of swine following infection withMycoplasmahyopneumoniae,M.hyorhinis,M.hyosynoviaeandM.flocculare[J].Veterinary Microbiology,2014,174(1/2):163-171.

    [24] Schultz K K,Strait E L,Erickson B Z,etal.Optimization of an antibiotic sensitivity assay forMycoplasmahyosynoviaeand susceptibility profiles of field isolates from 1997 to 2011[J].Veterinary Microbiology,2012,158(1/2):104-108.

    [25] Makhanon M,Tummaruk P,Thongkamkoon P,etal.Comparison of detection procedures ofMycoplasmahyopneumoniae,Mycoplasmahyosynoviae,andMycoplasmahyorhinisin lungs,tonsils,and synovial fluid of slaughtered pigs and their distributions in Thailand[J].Trop Anim Health Pro,2012,44(2):313-318.

    [26] 彭凌,劉博婷,楊旭夫.豬鼻支原體套式PCR診斷方法的建立及應用[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2017,46(4):121-123.

    [27] 李穎平.間接免疫熒光抗體技術(shù)檢測豬肺炎支原體[J].山西農(nóng)業(yè)科學,2016,44(11):1702-1703,1707.

    Identification and Differential Diagnosis of Mycoplasma hyosynoviae and Mycoplasma hyorhinis

    LI Haili1,DENGZU Liying2,XU Yindi1,WANG Zhifang1,ZHANG Qingxian1,ZHU Wenhao1,FANG Jianyu1,YOU Yi1,HOU Zihua1,LANG Limin1,WANG Keling1

    (1.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China;2.Zhengzhou Infant Normal School,Zhengzhou 450000,China)

    In order to develop differential diagnosis method ofMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinis,Mycoplasmawas isolated and identified from Henan province and surrounding areas.Two pairs of primers were designed to amplifyMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinisDNA and the fragment sizes were 480 bp and 360 bp respectively.The results showed that the colony was a typical “fried egg” characteristic.The single amplified PCR showed that the isolated microbes wereMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinis.On the basis of single amplification,the double PCR reaction was established for detectingMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinis.The double PCR method could be used for detection and differential diagnosis ofMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinis.

    Mycoplasmahyosynoviae;Mycoplasmahyorhinis; differential diagnosis; double PCR

    S855

    A

    1004-3268(2017)11-0148-04

    2017-06-16

    河南省農(nóng)業(yè)科學院自主創(chuàng)新基金項目(2016ZC49)

    李海利(1982-),男,河南開封人,助理研究員,博士,主要從事動物傳染病臨床診斷及防控研究工作。

    E-mail:haili8693@sina.com

    猜你喜歡
    豬鼻病料病原
    基層獸醫(yī)采集送檢病羊、病料的要點
    長絲鱸潰爛癥病原分離鑒定和耐藥性分析
    基層獸醫(yī)豬病料常用采集操作技術(shù)
    西部論叢(2019年31期)2019-10-14 21:30:01
    動物圈爆款“豬鼻”
    豬繁殖與呼吸綜合征病原流行病學調(diào)查
    裝死的豬鼻蛇
    可愛的豬鼻龜
    基層獸醫(yī)實驗室樣品采集、工作中必須注意的問題與建議
    鵝病毒性傳染病病原的采集和分離
    食源性病原微生物的危害
    国产精品一二三区在线看| 老司机午夜福利在线观看视频| 内地一区二区视频在线| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 不卡视频在线观看欧美| 毛片女人毛片| a级毛片免费高清观看在线播放| 日本精品一区二区三区蜜桃| eeuss影院久久| 色哟哟哟哟哟哟| av福利片在线观看| 一级黄片播放器| 最近在线观看免费完整版| 精品欧美国产一区二区三| 日本a在线网址| 亚洲精品国产av成人精品 | 国产成人aa在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美日韩乱码在线| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲av二区三区四区| av.在线天堂| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品福利在线免费观看| 国产精品久久视频播放| 久久欧美精品欧美久久欧美| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久久久久久久成人| 欧美高清性xxxxhd video| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 超碰av人人做人人爽久久| 九色成人免费人妻av| 欧美性猛交黑人性爽| 国产精品久久久久久精品电影| 国产av在哪里看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 日韩一区二区视频免费看| 日韩一区二区视频免费看| 免费人成在线观看视频色| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产成人影院久久av| 色综合站精品国产| 日韩制服骚丝袜av| 在线a可以看的网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 白带黄色成豆腐渣| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 一级毛片久久久久久久久女| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 成人无遮挡网站| 99热6这里只有精品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产黄a三级三级三级人| 中文字幕久久专区| 最近2019中文字幕mv第一页| 观看美女的网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲性夜色夜夜综合| 搡老妇女老女人老熟妇| or卡值多少钱| 成人漫画全彩无遮挡| 深爱激情五月婷婷| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 一本一本综合久久| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美日本视频| 身体一侧抽搐| 小说图片视频综合网站| 日韩欧美 国产精品| 三级经典国产精品| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩成人伦理影院| 成人永久免费在线观看视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 黄色配什么色好看| 日韩一本色道免费dvd| 一区福利在线观看| 黄片wwwwww| 亚洲无线在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 校园春色视频在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 国产探花极品一区二区| 九九在线视频观看精品| 成人av一区二区三区在线看| 久久人人精品亚洲av| 日韩精品有码人妻一区| 天堂动漫精品| 综合色丁香网| av女优亚洲男人天堂| 色av中文字幕| 真人做人爱边吃奶动态| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一夜夜www| 秋霞在线观看毛片| 联通29元200g的流量卡| 中国美白少妇内射xxxbb| 1000部很黄的大片| 99热网站在线观看| 日本免费a在线| 午夜精品在线福利| 亚洲第一电影网av| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 激情 狠狠 欧美| 少妇的逼好多水| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 狠狠狠狠99中文字幕| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久久久久久久久久丰满| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久久午夜欧美精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| av.在线天堂| 此物有八面人人有两片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 精品一区二区三区视频在线| 国产探花极品一区二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品电影一区二区三区| 美女免费视频网站| 一区二区三区免费毛片| 97超碰精品成人国产| 亚洲美女黄片视频| 日本免费a在线| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美三级亚洲精品| 少妇的逼好多水| 日韩欧美精品免费久久| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日本三级黄在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 欧美日本视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 不卡一级毛片| 日日撸夜夜添| 最新在线观看一区二区三区| 精品熟女少妇av免费看| 午夜亚洲福利在线播放| 成人美女网站在线观看视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产麻豆成人av免费视频| 国产成人一区二区在线| 香蕉av资源在线| 成人av在线播放网站| 亚洲性久久影院| 久久亚洲精品不卡| 午夜精品在线福利| 真人做人爱边吃奶动态| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久国产乱子免费精品| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲综合色惰| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 日本色播在线视频| 欧美性猛交黑人性爽| 夜夜爽天天搞| 成年免费大片在线观看| 国产精品永久免费网站| 伊人久久精品亚洲午夜| 色哟哟哟哟哟哟| av国产免费在线观看| 成人国产麻豆网| 亚洲av第一区精品v没综合| 91精品国产九色| 国产成人freesex在线 | 18+在线观看网站| 亚洲自拍偷在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 美女被艹到高潮喷水动态| 精华霜和精华液先用哪个| 禁无遮挡网站| 欧美+日韩+精品| 久久中文看片网| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品人妻久久久影院| 成年免费大片在线观看| 不卡一级毛片| 六月丁香七月| 在线播放无遮挡| 日韩制服骚丝袜av| 国产美女午夜福利| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产成人福利小说| 特大巨黑吊av在线直播| 日韩精品青青久久久久久| 毛片一级片免费看久久久久| 国产午夜精品论理片| 香蕉av资源在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 婷婷亚洲欧美| 日韩强制内射视频| 在线播放国产精品三级| 亚洲精品一区av在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩成人伦理影院| 麻豆国产97在线/欧美| 国产精品久久久久久久久免| 1000部很黄的大片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久精品国产亚洲网站| 99视频精品全部免费 在线| 露出奶头的视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产一区二区三区av在线 | 日韩欧美国产在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲av免费在线观看| 69av精品久久久久久| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 麻豆一二三区av精品| 日韩av不卡免费在线播放| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 性欧美人与动物交配| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 91久久精品国产一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美最新免费一区二区三区| 热99在线观看视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久久久久久久久久丰满| 国产精品乱码一区二三区的特点| 成人三级黄色视频| 深爱激情五月婷婷| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲在线观看片| 精品熟女少妇av免费看| 久久中文看片网| 午夜福利在线观看吧| 在线免费观看不下载黄p国产| 啦啦啦韩国在线观看视频| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲自拍偷在线| 日韩精品有码人妻一区| 69av精品久久久久久| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产亚洲精品av在线| 午夜影院日韩av| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 亚洲电影在线观看av| 国产精品av视频在线免费观看| 波多野结衣高清作品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产久久久一区二区三区| 久久鲁丝午夜福利片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 午夜亚洲福利在线播放| 99精品在免费线老司机午夜| 久久精品国产自在天天线| 最近手机中文字幕大全| 国产成人a区在线观看| 国产色婷婷99| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲美女黄片视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜久久久久精精品| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 天堂动漫精品| 国产淫片久久久久久久久| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美日韩在线观看h| 最近在线观看免费完整版| 一个人看视频在线观看www免费| 国产一区二区激情短视频| 一本精品99久久精品77| 日韩精品有码人妻一区| 晚上一个人看的免费电影| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 99视频精品全部免费 在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 又爽又黄无遮挡网站| 婷婷精品国产亚洲av| 天堂√8在线中文| 亚洲国产色片| 国产高清三级在线| 青春草视频在线免费观看| 嫩草影视91久久| 激情 狠狠 欧美| 极品教师在线视频| 五月伊人婷婷丁香| 老司机福利观看| 日韩av不卡免费在线播放| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲色图av天堂| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 青春草视频在线免费观看| 免费电影在线观看免费观看| 国产在视频线在精品| 午夜a级毛片| 99久国产av精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 人妻少妇偷人精品九色| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 99久久精品国产国产毛片| 成人亚洲欧美一区二区av| 欧美在线一区亚洲| 大香蕉久久网| 男女视频在线观看网站免费| 免费av不卡在线播放| 69av精品久久久久久| 免费看光身美女| 在线观看美女被高潮喷水网站| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲国产欧美人成| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久久久久久久久黄片| 亚洲第一电影网av| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 精品久久久久久成人av| 午夜a级毛片| 老司机福利观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 99热这里只有是精品在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲国产色片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产人妻一区二区三区在| 日本黄大片高清| 禁无遮挡网站| 免费在线观看影片大全网站| 精品欧美国产一区二区三| 国产午夜福利久久久久久| 男人的好看免费观看在线视频| 99视频精品全部免费 在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲av二区三区四区| 毛片一级片免费看久久久久| 在线观看66精品国产| 六月丁香七月| 亚洲中文字幕日韩| 国产欧美日韩一区二区精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 国内精品宾馆在线| 国产高清视频在线播放一区| 热99re8久久精品国产| 男女啪啪激烈高潮av片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜福利在线在线| 一级av片app| 国产 一区精品| 夜夜夜夜夜久久久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久久久性生活片| 国产av在哪里看| 久久99热6这里只有精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产中年淑女户外野战色| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 少妇人妻精品综合一区二区 | 男女下面进入的视频免费午夜| 精品日产1卡2卡| 少妇人妻一区二区三区视频| 特大巨黑吊av在线直播| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产精品永久免费网站| 亚州av有码| 亚洲在线观看片| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久久精品欧美日韩精品| 尾随美女入室| 狠狠狠狠99中文字幕| 大香蕉久久网| 日韩欧美精品免费久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品一区www在线观看| 日韩欧美 国产精品| 欧美成人a在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 丰满乱子伦码专区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 色综合亚洲欧美另类图片| 成年av动漫网址| www.色视频.com| 真实男女啪啪啪动态图| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 中文资源天堂在线| 亚洲av熟女| 亚洲最大成人中文| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产高清不卡午夜福利| 在现免费观看毛片| 午夜福利在线在线| 色av中文字幕| 在线免费观看的www视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 淫秽高清视频在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲高清免费不卡视频| 日本黄大片高清| 成人av在线播放网站| 波多野结衣高清无吗| 免费在线观看成人毛片| 欧美bdsm另类| 国产av一区在线观看免费| 久久中文看片网| 国产精品一区二区免费欧美| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲18禁久久av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产极品精品免费视频能看的| av天堂中文字幕网| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 久久99热6这里只有精品| 欧美区成人在线视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 香蕉av资源在线| 精品国内亚洲2022精品成人| a级毛片a级免费在线| 国产伦在线观看视频一区| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲成人av在线免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 悠悠久久av| a级毛色黄片| 久久精品国产自在天天线| av黄色大香蕉| 成年女人永久免费观看视频| 国产成人freesex在线 | h日本视频在线播放| 春色校园在线视频观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 91精品国产九色| 成人国产麻豆网| 国产综合懂色| 老司机午夜福利在线观看视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久久久久久久久久丰满| 波多野结衣高清作品| 亚洲成av人片在线播放无| av在线播放精品| 国产视频一区二区在线看| 欧美色视频一区免费| 日日啪夜夜撸| 免费黄网站久久成人精品| 久久中文看片网| 成人精品一区二区免费| 亚洲国产欧美人成| 联通29元200g的流量卡| 在线观看av片永久免费下载| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 内射极品少妇av片p| or卡值多少钱| 波多野结衣巨乳人妻| 国产av不卡久久| 成人综合一区亚洲| 亚洲av美国av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美日韩精品成人综合77777| 性欧美人与动物交配| 国产男靠女视频免费网站| 一级黄片播放器| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 午夜精品在线福利| av.在线天堂| 禁无遮挡网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 俺也久久电影网| 在线天堂最新版资源| 亚洲va在线va天堂va国产| 一级黄色大片毛片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 色av中文字幕| 少妇的逼好多水| 亚洲欧美日韩东京热| 国产亚洲av嫩草精品影院| 一区二区三区高清视频在线| 性欧美人与动物交配| 我的女老师完整版在线观看| 免费av观看视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 91久久精品国产一区二区三区| 黄色一级大片看看| 国产真实乱freesex| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲在线观看片| 综合色丁香网| 永久网站在线| 国产精品久久久久久久久免| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品久久视频播放| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精品乱码一区二三区的特点| 精品欧美国产一区二区三| 2021天堂中文幕一二区在线观| 极品教师在线视频| 哪里可以看免费的av片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 深爱激情五月婷婷| 成年女人看的毛片在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲在线自拍视频| 久久精品综合一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| 少妇熟女欧美另类| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲,欧美,日韩| 毛片女人毛片| 婷婷色综合大香蕉| av专区在线播放| 欧美zozozo另类| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 高清毛片免费看| 露出奶头的视频| 女同久久另类99精品国产91| 美女高潮的动态| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品一区二区三区视频在线| 一区福利在线观看| 18+在线观看网站| 插阴视频在线观看视频| 精品人妻视频免费看| 国产精品一区二区免费欧美| а√天堂www在线а√下载| 1000部很黄的大片| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| or卡值多少钱| 精品熟女少妇av免费看| 欧美成人精品欧美一级黄| 床上黄色一级片| 婷婷精品国产亚洲av| 在线看三级毛片| 久久久久久久久久黄片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产美女午夜福利| 久久精品国产清高在天天线| 搞女人的毛片| 成人性生交大片免费视频hd| 国产伦精品一区二区三区视频9| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 97热精品久久久久久| 午夜福利18| 亚洲人成网站高清观看| 久久6这里有精品| 久久热精品热| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品免费久久久久久久清纯| 精品人妻偷拍中文字幕| 日韩欧美国产在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 91久久精品电影网| 欧美另类亚洲清纯唯美| 中文字幕熟女人妻在线| 国产成人精品久久久久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 淫秽高清视频在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 成熟少妇高潮喷水视频| a级毛片a级免费在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产老妇女一区| 国产麻豆成人av免费视频| 精品久久久久久久久亚洲| 国产高清三级在线| 91久久精品国产一区二区成人| 久久精品人妻少妇| 99久国产av精品| 深夜精品福利| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产淫片久久久久久久久| 一进一出好大好爽视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 尾随美女入室| av女优亚洲男人天堂| 久久精品国产清高在天天线| 欧美激情久久久久久爽电影|