• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬肺炎支原體與豬鼻支原體分離鑒定及鑒別檢測

    2017-12-20 00:47:53李海利鄧祖麗穎徐引弟王治方張青嫻朱文豪方劍玉侯自花郎利敏王克領(lǐng)
    河南農(nóng)業(yè)科學 2017年11期
    關(guān)鍵詞:豬鼻病料病原

    李海利,鄧祖麗穎,徐引弟,王治方,張青嫻,朱文豪,方劍玉,游 一,侯自花,郎利敏,王克領(lǐng)

    (1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州 450002;2.鄭州幼兒師范高等??茖W校,河南 鄭州 450000)

    豬肺炎支原體與豬鼻支原體分離鑒定及鑒別檢測

    李海利1,鄧祖麗穎2,徐引弟1,王治方1,張青嫻1,朱文豪1,方劍玉1,游 一1,侯自花1,郎利敏1,王克領(lǐng)1

    (1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州 450002;2.鄭州幼兒師范高等??茖W校,河南 鄭州 450000)

    為建立豬肺炎支原體與豬鼻支原體的鑒別診斷方法,對從河南省及周邊地區(qū)豬場采集的患呼吸道疾病的豬只樣品進行支原體的分離培養(yǎng),針對豬肺炎支原體與豬鼻支原體設計了2對引物,擴增片段大小分別為480 bp和360 bp,對所分離純化的病原微生物進行了菌落形態(tài)觀察及分子鑒定。結(jié)果顯示,分離的病原微生物為支原體,菌落呈典型的“煎蛋樣”特征;通過單一PCR擴增反應,分別得到了豬肺炎支原體與豬鼻支原體相應的目的擴增片段。表明分離到了豬肺炎支原體與豬鼻支原體。在單一擴增的基礎(chǔ)上,建立了豬肺炎支原體與豬鼻支原體二重PCR反應方法,可同時得到2條目的條帶,與單一PCR擴增結(jié)果一致。表明建立的二重PCR方法可用于豬肺炎支原體與豬鼻支原體的同時檢測和鑒別診斷。

    豬肺炎支原體; 豬鼻支原體; 鑒別診斷; 二重PCR

    豬支原體肺炎(MPS)又稱豬地方流行性肺炎,俗稱豬氣喘病,是由豬肺炎支原體引起的豬的一種慢性呼吸道傳染病[1-3]。其主要臨床癥狀為咳嗽和氣喘,病理變化特征是肺的尖葉、心葉、中間葉和隔葉前緣呈肉樣或蝦肉樣實變[4-5]。該病廣泛分布于世界各地,主要特點是高接觸性、高傳染性、高發(fā)病率和低死亡率[6],可導致日增質(zhì)量減少、長期生長不良、飼料報酬率大幅下降[7-8]。該病常與其他呼吸道病原如多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌或胸膜肺炎放線桿菌等協(xié)同感染引起豬地方性肺炎,常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒和豬圓環(huán)病毒協(xié)同感染引起豬呼吸道綜合征[9]。豬鼻支原體(Mhn)通常存在于豬鼻腔和扁桃體中,一般條件下并不致病。但豬鼻支原體感染肺臟時可引起肺炎,還可導致多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎[10-11]。

    豬肺炎支原體和豬鼻支原體發(fā)病率較高,一般在50%~80%,個別新建豬場或感染豬場發(fā)病率可達100%,死亡率高達14%~37%[12-13]。流行后期或老疫區(qū)則以哺乳仔豬和斷奶仔豬多發(fā),死亡率較高[14-15],母豬和成年豬多呈慢性和隱性感染[16-18]。病豬與健康豬群混合飼養(yǎng),常引起豬支原體肺炎的暴發(fā)。消除患病動物和徹底消毒,切斷傳播途徑,加強檢疫和監(jiān)測,對防治豬支原體肺炎和豬鼻支原體具有重要意義[19]。

    支原體可持續(xù)存在,并且可導致其他疫苗免疫失敗[20-23]。豬支原體病流行于世界各地,在畜牧業(yè)發(fā)達的美國、澳大利亞等國也普遍存在,造成了巨大的經(jīng)濟損失[24-27]。防控豬支原體肺炎需掌握支原體的流行特征,豬肺炎支原體與豬鼻支原體的臨床癥狀相似,且在形態(tài)上難以區(qū)分,因而對豬肺炎支原體抗體的檢測與豬鼻支原體的鑒別診斷顯得尤為重要。鑒于此,建立豬肺炎支原體與豬鼻支原體的鑒別檢測方法,旨在為控制豬支原體肺炎奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試病料 從河南省及周邊地區(qū)豬場采集的患呼吸道疾病樣品由河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保存。

    1.1.2 主要試劑 葡萄糖、PPLO肉湯粉、酵母粉、瓊脂粉、馬血清、精氨酸、青霉素等購自北京路橋生物技術(shù)有限公司;EDTA、聚乙二醇辛基苯基醚、異硫氰酸酯、氯化鈉購自Sigma公司。dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、DNA Marker、ExTaq(5 U/μL)、MgCl2(25 mmol/L)、10×PCR Buffer (Mg2+free)、RNase Free dH2O等均購自TaKaRa公司;瓊脂糖購于Biowest公司;EB染料替代染液購自上海萊楓生物科技有限公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 病原微生物分離 取具有典型癥狀的支原體病例肺臟組織,表面無菌消毒,取肺臟組織樣本5 g涂于固體培養(yǎng)基表面,放置于37 ℃、含5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),同時將小塊無菌肺臟組織樣本投入到50 mL PPLO液體培養(yǎng)基中。3~5 d后,用光學顯微鏡低倍觀察菌落形態(tài)。取待檢病原微生物純培養(yǎng)物進行姬姆薩氏染色,于顯微鏡油鏡下觀察病原微生物形態(tài)。

    將采集的鼻咽拭子浸入裝有滅菌生理鹽水的管中,于24 h內(nèi)送入實驗室,用0.50 μm濾膜過濾生理鹽水除雜菌,涂于PPLO固體培養(yǎng)基表面或PPLO液體培養(yǎng)基中,放置于37 ℃、含5%的CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3~5 d后,用光學顯微鏡低倍觀察菌落形態(tài)。取待檢病原微生物純培養(yǎng)物進行姬姆薩氏染色,于顯微鏡油鏡下觀察病原微生物形態(tài)。

    1.2.2 引物設計 引物用Array Designer 2.0 軟件根據(jù)豬肺炎支原體(GenBank No.AF004388)和豬鼻支原體(GenBank No.NC014448.1)序列設計,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為MphF:5′-GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA-3′,MphR:5′-GTGGACTACCAGGGTATCT-3′;MhnF:5′-TGAAG-CTGTGAAGCTCCTTTC-3′,MhnR:5′-TGTTGAACG-GGATGTAGCAA-3′。預期擴增片段大小分別為480 bp和360 bp。

    1.2.3 分離病原微生物基因組模板的提取 采用柱式DNA提取方法提取基因組。具體操作如下:(1)取適量菌體加入500 μL裂解液(40 mmol/L EDTA,2%聚乙二醇辛基苯基醚,2 mol/L異硫氰酸酯,0.7 mol/L氯化鈉),70 ℃水浴2 min,12 000 r/min離心30 s;(2)上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中,加500 μL無水乙醇,轉(zhuǎn)到DNA純化柱上,12 000 r/min離心30 s,倒掉收集管中的廢液;(3)用500 μL沖洗液1(10 mmol/L EDTA,70%乙醇,pH值7.0)沖洗,12 000 r/min離心30 s,倒掉收集管中的廢液;(4)用600 μL沖洗液2(75 mmol/L Tris-HCl,80%乙醇,pH值7.0)沖洗,12 000 r/min離心30 s,倒掉收集管中的廢液,重復1次;(5)將柱子轉(zhuǎn)到新的離心管上,加50 μL焦碳酸二乙酯水,12 000 r/min離心30 s,即可得到高純度的DNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 分離病原微生物PCR擴增 擴增體系為25.0 μL:10×PCR Buffer(Mg2+free) 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L) 2 μL,Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2 μL,DNA模板2 μL,正、反引物(10 μmol/L)各1 μL,RNase Free dH2O補充至25 μL。PCR擴增程序為:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,57 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,進行35個循環(huán);72 ℃再延伸5 min。反應結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。取PCR產(chǎn)物5 μL進行點樣,120 V電壓下電泳30 min。

    1.2.5 分離病原微生物二重PCR反應 擴增體系為25.0 μL:10×PCR Buffer(Mg2+free) 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L) 2 μL,Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2 μL,DNA 2 μL,豬肺炎支原體和豬鼻支原體正、反引物(10 μmol/L)各1 μL,RNase Free dH2O補充至25 μL。PCR擴增程序為:95 ℃預變性2 min;94 ℃變性1 min,59 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,進行32個循環(huán)后,72 ℃再延伸2 min。反應結(jié)束后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

    1.2.6 檢測方法的應用 用建立的二重PCR檢測方法對從河南省及周邊地區(qū)豬場采集的患呼吸道疾病的16份病料進行檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 分離病原微生物形態(tài)學觀察及鏡檢

    分離病原微生物在含0.4%酚紅PPLO的液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基由紅變黃,呈輕微渾濁,在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5~7 d,觀察可見圓形隆起、邊緣整齊、表面粗糙、中央有顆粒的針尖大小或露珠狀小菌落。菌落呈支原體的“煎蛋樣”典型特征(圖1)。取待檢病原微生物純培養(yǎng)物進行姬姆薩氏染色25 min,于顯微鏡下觀察分離病原微生物形態(tài),形態(tài)不一,大多呈絲狀(圖2)。

    圖1 分離病原微生物菌落形態(tài)

    圖2 分離病原微生物在顯微鏡下的形態(tài)

    2.2 分離病原微生物PCR擴增結(jié)果

    從圖3可以看出,擴增產(chǎn)物電泳后,在480 bp和360 bp處均可見特異性擴增條帶(圖3),與預期結(jié)果一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化和測序,所得序列與數(shù)據(jù)庫中豬肺炎支原體和豬鼻支原體同源性達99%。

    M.Marker 2000;1.空白對照;2.豬鼻支原體;3.豬肺炎支原體

    2.3 豬肺炎支原體與豬鼻支原體二重PCR擴增結(jié)果

    按照上述單重PCR擴增進行二重PCR,結(jié)果顯示,擴增產(chǎn)物在480 bp和360 bp處均可見特異性擴增條帶(圖4),與豬肺炎支原體和豬鼻支原體預期結(jié)果一致。

    M.Marker 2000;1.豬肺炎支原體;2.豬鼻支原體;3.豬肺炎支原體與豬鼻支原體二重擴增

    2.4 建立檢測方法的應用結(jié)果

    應用上述研究所建立的方法對臨床16份病料進行檢測,有5份病料檢測為豬肺炎支原體,5份病料檢測為豬鼻支原體,6份病料檢測為陰性(圖5),陽性檢出率為62.5%。

    M.Marker 2000;3、9、10、11、12為豬肺炎支原體;2、5、6、7、8為豬鼻支原體;1、4、13、14、15、16為陰性

    3 結(jié)論

    本研究對河南省及周邊地區(qū)的豬場患呼吸道疾病的樣品進行支原體的分離,通過菌落觀察、形態(tài)學觀察及分子診斷鑒定,表明分離純化的病原微生物為豬肺炎支原體與豬鼻支原體。在光學顯微鏡下低倍觀察支原體菌落形態(tài),菌落呈“煎蛋樣”典型特征。針對豬肺炎支原體與豬鼻支原體設計了2對引物,擴增片段大小分別為480 bp和360 bp,通過單一PCR擴增反應,分別得到了豬肺炎支原體與豬鼻支原體相應的目的擴增片段。在單一擴增的基礎(chǔ)上,建立了豬肺炎支原體與豬鼻支原體二重PCR反應方法,可同時得到2條目的條帶,與單一PCR擴增結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明,建立的二重PCR方法可用于豬肺炎支原體與豬鼻支原體的同時檢測和鑒別診斷,且簡便快捷,靈敏度高,特異性強。

    [1] Lauritsen K T,Hagedorn-Olsen T,Jungersen G,etal.Transfer of maternal immunity to piglets is involved in early protection againstMycoplasmahyosynoviaeinfection[J].Vet Immunol Immunop,2017,183:22-30.

    [2] Ishag H Z A,Xiong Q Y,Liu M J,etal.E.colirecAgene improves gene targeted homologous recombination inMycoplasmahyorhinis[J].J Microbiol Meth,2017,136:49-56.

    [3] Lee J A,Oh Y R,Hwang M A,etal.Mycoplasmahyorhinisis a potential pathogen of porcine respiratory disease complex that aggravates pneumonia caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Vet Immunol Immunop,2016,177:48-51.

    [4] Ishag H Z A,Liu M J,Yang R S,etal.GFP as a marker for transient gene transfer and expression inMycoplasmahyorhinis[J].Springerplus,2016,5:1-4.

    [5] Gomes-Neto J C,Raymond M,Bower L,etal.Two clinical isolates ofMycoplasmahyosynoviaeshowed differing pattern of lameness and pathogen detection in experimentally challenged pigs[J].J Vet Sci,2016,17(4):489-496.

    [6] Chen D,Wei Y,Huang L,etal.Synergistic pathogenicity in sequential coinfection withMycoplasmahyorhinisand porcine circovirus type 2[J].Vet Microbiol,2016,182:123-130.

    [7] Chen D J,Wei Y W,Huang L P,etal.Characterization and application of monoclonal antibodies againstMycoplasmahyorhinispyruvate dehydrogenase E1 complex subunit alpha[J].Appl Microbiol Biot,2016,100(8):3587-3597.

    [8] Dahlia H,Tan L J,Zarrahimah Z,etal.Isolation ofMycoplasmahyosynoviaefrom pneumonic lung of swine[J].Trop Biomed,2009,26(3):341-345.

    [9] Lauritsen K T,Hagedorn-Olsen T,Friis N F,etal.Absence of strictly age-related resistance toMycoplasmahyosynoviaeinfection in 6-week-old pigs[J].Vet Microbiol,2008,130(3/4):385-390.

    [10] Nielsen E O,Lauritsen K T,Friis N F,etal.Use of a novel serum ELISA method and the tonsil-carrier state for evaluation ofMycoplasmahyosynoviaedistributions in pig herds with or without clinical arthritis[J].Veterinary Microbiology,2005,111(1/2):41-50.

    [11] Kokotovic B,Friis N F,Nielsen E O,etal.Genomic diversity among Danish field strains ofMycoplasmahyosynoviaeassessed by amplified fragment length polymorphism analysis[J].Veterinary Microbiology,2002,85(3):221-231.

    [12] Xiong Q Y,Zhang B X,Wang J,etal.Characterization of the role in adherence ofMycoplasmahyorhinisvariable lipoproteins containing different repeat unit copy numbers[J].Veterinary Microbiology,2016,197:39-46.

    [13] Xiong Q Y,Wang J,Ji Y,etal.The functions of the variable lipoprotein family ofMycoplasmahyorhinisin adherence to host cells[J].Veterinary Microbiology,2016,186:82-89.

    [14] Unterweger C,Wochtl B,Spergser J,etal.Influenza outbreak in weaners with involvement ofMycoplasmahyorhinisandHaemophilusparasuis[J].Tieraerztl Prax G N,2016,44(4):259-265.

    [15] Voorde J V,Vervaeke P,Liekens S,etal.Mycoplasmahyorhinis-encoded cytidine deaminase efficiently inactivates cytosine-based anticancer drugs[J].Febs Open Bio,2015,5:634-639.

    [16] Palzer A,Kolb K,Strutzberg-Minder K,etal.Serological course investigations ofHaemophilusparasuisandMycoplasmahyorhinisin three pig farms[J].Schweiz Arch Tierheilkd,2015,157(2):97-103.

    [17] Palzer A,Haedke K,Heinritzi K,etal.Associations amongHaemophilusparasuis,Mycoplasmahyorhinis,and porcine reproductive and respiratory syndrome virus infections in pigs with polyserositis[J].Can Vet J,2015,56(3):285-287.

    [18] Kornspan J D,Tsur M,Tarshis M,etal.Mycoplasmahyorhinisinduces proinflammatory responses in mice lymphocytes[J].J Basic Microb,2015,55(5):679-684.

    [19] Neto J C G,Bower L,Erickson B Z,etal.Quantitative real-time polymerase chain reaction for detectingMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinisin pen-based oral,tonsillar,and nasal fluids[J].Journal of Veterinary Science,2015,16(2):195-201.

    [20] Kokotovic B,Friis N F,Ahrens P.Characterization ofMycoplasmahyosynoviaestrains by amplified fragment length polymorphism analysis,pulsed-field gel electrophoresis and 16S ribosomal DNA sequencing[J].J Vet Med B,2002,49(5):245-252.

    [21] Nielsen E O,Nielsen N C,Friis N F.Mycoplasmahyosynoviaearthritis in grower-finisher pigs[J].J Vet Med A,2001,48(8):475-486.

    [22] Boye M,Jensen T K,Ahrens P,etal.In situ hybridisation for identification and differentiation ofMycoplasmahyopneumoniae,MycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinisin formalin-fixed porcine tissue sections[J].Apmis,2001,109(10):656-664.

    [23] Neto J C G,Strait E L,Raymond M,etal.Antibody responses of swine following infection withMycoplasmahyopneumoniae,M.hyorhinis,M.hyosynoviaeandM.flocculare[J].Veterinary Microbiology,2014,174(1/2):163-171.

    [24] Schultz K K,Strait E L,Erickson B Z,etal.Optimization of an antibiotic sensitivity assay forMycoplasmahyosynoviaeand susceptibility profiles of field isolates from 1997 to 2011[J].Veterinary Microbiology,2012,158(1/2):104-108.

    [25] Makhanon M,Tummaruk P,Thongkamkoon P,etal.Comparison of detection procedures ofMycoplasmahyopneumoniae,Mycoplasmahyosynoviae,andMycoplasmahyorhinisin lungs,tonsils,and synovial fluid of slaughtered pigs and their distributions in Thailand[J].Trop Anim Health Pro,2012,44(2):313-318.

    [26] 彭凌,劉博婷,楊旭夫.豬鼻支原體套式PCR診斷方法的建立及應用[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2017,46(4):121-123.

    [27] 李穎平.間接免疫熒光抗體技術(shù)檢測豬肺炎支原體[J].山西農(nóng)業(yè)科學,2016,44(11):1702-1703,1707.

    Identification and Differential Diagnosis of Mycoplasma hyosynoviae and Mycoplasma hyorhinis

    LI Haili1,DENGZU Liying2,XU Yindi1,WANG Zhifang1,ZHANG Qingxian1,ZHU Wenhao1,FANG Jianyu1,YOU Yi1,HOU Zihua1,LANG Limin1,WANG Keling1

    (1.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China;2.Zhengzhou Infant Normal School,Zhengzhou 450000,China)

    In order to develop differential diagnosis method ofMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinis,Mycoplasmawas isolated and identified from Henan province and surrounding areas.Two pairs of primers were designed to amplifyMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinisDNA and the fragment sizes were 480 bp and 360 bp respectively.The results showed that the colony was a typical “fried egg” characteristic.The single amplified PCR showed that the isolated microbes wereMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinis.On the basis of single amplification,the double PCR reaction was established for detectingMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinis.The double PCR method could be used for detection and differential diagnosis ofMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinis.

    Mycoplasmahyosynoviae;Mycoplasmahyorhinis; differential diagnosis; double PCR

    S855

    A

    1004-3268(2017)11-0148-04

    2017-06-16

    河南省農(nóng)業(yè)科學院自主創(chuàng)新基金項目(2016ZC49)

    李海利(1982-),男,河南開封人,助理研究員,博士,主要從事動物傳染病臨床診斷及防控研究工作。

    E-mail:haili8693@sina.com

    猜你喜歡
    豬鼻病料病原
    基層獸醫(yī)采集送檢病羊、病料的要點
    長絲鱸潰爛癥病原分離鑒定和耐藥性分析
    基層獸醫(yī)豬病料常用采集操作技術(shù)
    西部論叢(2019年31期)2019-10-14 21:30:01
    動物圈爆款“豬鼻”
    豬繁殖與呼吸綜合征病原流行病學調(diào)查
    裝死的豬鼻蛇
    可愛的豬鼻龜
    基層獸醫(yī)實驗室樣品采集、工作中必須注意的問題與建議
    鵝病毒性傳染病病原的采集和分離
    食源性病原微生物的危害
    这个男人来自地球电影免费观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲一区中文字幕在线| www.www免费av| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 国产精品久久久av美女十八| 国产精品国产高清国产av| 国产成+人综合+亚洲专区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲精华国产精华精| 久久中文看片网| 亚洲真实伦在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 久久久久国产一级毛片高清牌| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久亚洲精品不卡| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美日韩精品网址| 手机成人av网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 我要搜黄色片| 88av欧美| 在线观看一区二区三区| 国产精品av视频在线免费观看| 美女免费视频网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 成人三级黄色视频| 美女午夜性视频免费| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 免费电影在线观看免费观看| 宅男免费午夜| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲精品粉嫩美女一区| a级毛片a级免费在线| 国产高清有码在线观看视频 | 巨乳人妻的诱惑在线观看| 好男人电影高清在线观看| 久热爱精品视频在线9| 久热爱精品视频在线9| 女同久久另类99精品国产91| 妹子高潮喷水视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 91字幕亚洲| 99re在线观看精品视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 他把我摸到了高潮在线观看| 长腿黑丝高跟| 黄色视频,在线免费观看| 天堂√8在线中文| 国产精品一及| 日韩三级视频一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 亚洲国产欧美人成| 一个人免费在线观看电影 | 最近视频中文字幕2019在线8| 嫩草影院精品99| 日本免费a在线| 天天添夜夜摸| 日韩欧美免费精品| 日韩欧美免费精品| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲av熟女| 1024视频免费在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 日韩高清综合在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 妹子高潮喷水视频| 国产成人系列免费观看| 丰满的人妻完整版| 久久精品影院6| 天天添夜夜摸| 一本精品99久久精品77| 禁无遮挡网站| 久久九九热精品免费| 操出白浆在线播放| 亚洲欧美激情综合另类| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日韩欧美国产在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品国产高清国产av| 老司机靠b影院| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲真实伦在线观看| 国产高清激情床上av| 哪里可以看免费的av片| 黄色视频,在线免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 日韩三级视频一区二区三区| 我要搜黄色片| 在线观看免费日韩欧美大片| 一进一出抽搐动态| 国产久久久一区二区三区| 午夜精品一区二区三区免费看| 一本精品99久久精品77| 人人妻人人看人人澡| 亚洲一区二区三区不卡视频| 美女 人体艺术 gogo| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产视频内射| 亚洲精品国产一区二区精华液| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| ponron亚洲| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲电影在线观看av| 手机成人av网站| 身体一侧抽搐| 成人精品一区二区免费| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产人伦9x9x在线观看| 免费看日本二区| 亚洲人成网站高清观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品永久免费网站| 黄色丝袜av网址大全| 黑人操中国人逼视频| 国产伦在线观看视频一区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲在线自拍视频| 天堂影院成人在线观看| 一本精品99久久精品77| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产成人欧美在线观看| 精品日产1卡2卡| 久久久久性生活片| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产99久久九九免费精品| 国产乱人伦免费视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产激情欧美一区二区| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产成人系列免费观看| 国产在线观看jvid| 亚洲真实伦在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久天堂一区二区三区四区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 99热只有精品国产| 久久久水蜜桃国产精品网| 91成年电影在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 成人av在线播放网站| 99久久国产精品久久久| 成年人黄色毛片网站| 精品久久久久久久末码| 欧美在线一区亚洲| 亚洲欧美激情综合另类| 夜夜夜夜夜久久久久| 久99久视频精品免费| 青草久久国产| 91麻豆av在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品91蜜桃| 一级片免费观看大全| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国内精品久久久久精免费| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 俄罗斯特黄特色一大片| 一本久久中文字幕| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 麻豆成人午夜福利视频| 美女 人体艺术 gogo| 看免费av毛片| 脱女人内裤的视频| 国产亚洲精品一区二区www| 国产成+人综合+亚洲专区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲精品一区av在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 免费人成视频x8x8入口观看| 最近最新免费中文字幕在线| cao死你这个sao货| 亚洲国产高清在线一区二区三| 不卡av一区二区三区| 给我免费播放毛片高清在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 老司机靠b影院| 无遮挡黄片免费观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 波多野结衣高清作品| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 波多野结衣高清作品| 亚洲18禁久久av| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美大码av| 级片在线观看| 亚洲免费av在线视频| 国产成人aa在线观看| 欧美3d第一页| 国产亚洲精品av在线| 国产视频一区二区在线看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产爱豆传媒在线观看 | 中出人妻视频一区二区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲无线在线观看| 久久九九热精品免费| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 黄色成人免费大全| 神马国产精品三级电影在线观看 | 天堂√8在线中文| 黄频高清免费视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 午夜亚洲福利在线播放| 性色av乱码一区二区三区2| 国产av又大| 久久性视频一级片| 国产69精品久久久久777片 | 国产精品久久视频播放| 久久香蕉激情| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 99riav亚洲国产免费| www.自偷自拍.com| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲精品色激情综合| 国产成人av教育| 国产精品电影一区二区三区| 手机成人av网站| 国产91精品成人一区二区三区| 99国产综合亚洲精品| 亚洲人成77777在线视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品第一国产精品| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲18禁久久av| 18美女黄网站色大片免费观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 日本一二三区视频观看| a在线观看视频网站| 国产v大片淫在线免费观看| 久久热在线av| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一级黄色大片毛片| 色噜噜av男人的天堂激情| 免费高清视频大片| 欧美黑人巨大hd| 毛片女人毛片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 一本综合久久免费| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲av成人av| 亚洲人成77777在线视频| 日本一二三区视频观看| 日日爽夜夜爽网站| 三级国产精品欧美在线观看 | 久久久精品大字幕| 欧美一级毛片孕妇| 成人18禁在线播放| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 黄片小视频在线播放| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 91九色精品人成在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | av中文乱码字幕在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产麻豆成人av免费视频| 黄色毛片三级朝国网站| 女同久久另类99精品国产91| 午夜福利成人在线免费观看| 日本一本二区三区精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品 欧美亚洲| 国产熟女午夜一区二区三区| 成人三级做爰电影| 高清在线国产一区| 精品久久久久久成人av| 午夜两性在线视频| 国产成人系列免费观看| 欧美色视频一区免费| 成人欧美大片| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩欧美免费精品| 99热这里只有精品一区 | 国产成人系列免费观看| 99在线人妻在线中文字幕| 1024手机看黄色片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 激情在线观看视频在线高清| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 超碰av人人做人人爽久久| 日本成人三级电影网站| 麻豆成人av视频| 午夜福利高清视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美3d第一页| 成年版毛片免费区| av在线观看视频网站免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 看非洲黑人一级黄片| 免费电影在线观看免费观看| av免费观看日本| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品av视频在线免费观看| 国产成人精品婷婷| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一级毛片aaaaaa免费看小| 九草在线视频观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲av一区综合| 亚洲第一电影网av| 日本黄大片高清| 草草在线视频免费看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 美女 人体艺术 gogo| 天堂影院成人在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 精品午夜福利在线看| 久久午夜亚洲精品久久| 国产91av在线免费观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日韩制服骚丝袜av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 青春草亚洲视频在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲av.av天堂| 床上黄色一级片| 我要搜黄色片| 久久草成人影院| 搞女人的毛片| 日韩制服骚丝袜av| 国产成人影院久久av| 亚洲人成网站在线观看播放| 不卡视频在线观看欧美| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一个人观看的视频www高清免费观看| 久久久久久久久久久丰满| 精品人妻偷拍中文字幕| 中文字幕久久专区| 国内精品美女久久久久久| 美女国产视频在线观看| 午夜精品在线福利| 欧美+日韩+精品| 日本五十路高清| 91在线精品国自产拍蜜月| 真实男女啪啪啪动态图| 日本黄大片高清| av免费在线看不卡| 高清毛片免费观看视频网站| 久久久a久久爽久久v久久| 在线天堂最新版资源| 亚洲无线在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美色视频一区免费| 国产在视频线在精品| 能在线免费观看的黄片| 中文字幕熟女人妻在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 免费看av在线观看网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲av成人av| 又爽又黄a免费视频| 国语自产精品视频在线第100页| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产黄色小视频在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 美女高潮的动态| 日韩成人伦理影院| .国产精品久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 欧美三级亚洲精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 午夜a级毛片| 日韩人妻高清精品专区| 一级毛片久久久久久久久女| 在线免费观看不下载黄p国产| 人人妻人人看人人澡| 久久精品国产清高在天天线| 国产人妻一区二区三区在| 欧美丝袜亚洲另类| 天堂√8在线中文| 狠狠狠狠99中文字幕| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国语自产精品视频在线第100页| 国产一区二区在线观看日韩| 国产成人a∨麻豆精品| 成年免费大片在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 小说图片视频综合网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久韩国三级中文字幕| 男的添女的下面高潮视频| 热99在线观看视频| 性色avwww在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产一区二区三区av在线 | 51国产日韩欧美| 麻豆成人av视频| 91久久精品国产一区二区三区| 男人狂女人下面高潮的视频| 99久久精品一区二区三区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲欧美清纯卡通| 日本三级黄在线观看| 中国美女看黄片| 国产久久久一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美另类亚洲清纯唯美| h日本视频在线播放| 美女国产视频在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲国产欧美人成| 成人一区二区视频在线观看| 久久国产乱子免费精品| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产久久久一区二区三区| 中文字幕久久专区| 亚洲国产精品成人综合色| 最近的中文字幕免费完整| 看黄色毛片网站| 波多野结衣巨乳人妻| 两个人的视频大全免费| 国产三级在线视频| 赤兔流量卡办理| 悠悠久久av| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产在视频线在精品| 免费看a级黄色片| av卡一久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 婷婷六月久久综合丁香| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 在线免费观看的www视频| 如何舔出高潮| 一区二区三区高清视频在线| 99久久精品国产国产毛片| 成人欧美大片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 一区二区三区免费毛片| 九色成人免费人妻av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 免费av观看视频| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 深爱激情五月婷婷| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 日本五十路高清| 丰满乱子伦码专区| av专区在线播放| 国产真实伦视频高清在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 国产成人一区二区在线| 免费av观看视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品国产高清国产av| 国产午夜精品论理片| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美一区二区亚洲| 成人一区二区视频在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 久久久久久久久大av| 亚洲五月天丁香| 特级一级黄色大片| 国产精品av视频在线免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 性欧美人与动物交配| 国产成人影院久久av| av在线老鸭窝| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲最大成人手机在线| 日韩欧美在线乱码| 欧美一区二区国产精品久久精品| 麻豆乱淫一区二区| 国产爱豆传媒在线观看| 秋霞在线观看毛片| 中文字幕av在线有码专区| 99久久精品热视频| 高清毛片免费看| 欧美最黄视频在线播放免费| www.色视频.com| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品无大码| 人妻少妇偷人精品九色| 悠悠久久av| 最后的刺客免费高清国语| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久人人爽人人爽人人片va| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲av二区三区四区| 国产精品久久久久久精品电影| 性色avwww在线观看| 一级黄色大片毛片| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 好男人在线观看高清免费视频| 欧美高清性xxxxhd video| 国产高清激情床上av| 中文字幕熟女人妻在线| 久久久国产成人精品二区| 国产伦在线观看视频一区| a级毛片a级免费在线| 99久国产av精品| 熟女电影av网| 黄色一级大片看看| 欧美性猛交黑人性爽| 黄色欧美视频在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 尾随美女入室| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 黄片wwwwww| 两个人视频免费观看高清| 欧美色欧美亚洲另类二区| 九九爱精品视频在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 身体一侧抽搐| 中文字幕av在线有码专区| 日本五十路高清| 精品免费久久久久久久清纯| 性欧美人与动物交配| 色综合色国产| 丰满人妻一区二区三区视频av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产色婷婷99| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产伦一二天堂av在线观看| 综合色av麻豆| 日韩视频在线欧美| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 日本免费一区二区三区高清不卡| 日韩强制内射视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 熟女电影av网| 免费观看人在逋| 成年免费大片在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 12—13女人毛片做爰片一| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美日本视频| 国产不卡一卡二| 日韩成人av中文字幕在线观看| 中出人妻视频一区二区| 国产69精品久久久久777片| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产成人91sexporn| 国产综合懂色| 亚洲自拍偷在线| 久久午夜福利片| 天堂中文最新版在线下载 | 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久人人爽人人片av| 国产三级中文精品| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 免费大片18禁| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久亚洲精品不卡| 色综合亚洲欧美另类图片| 禁无遮挡网站| 久久久久久久久久久免费av| 久久久精品94久久精品| 国产精品蜜桃在线观看 | 在线播放国产精品三级| 日韩人妻高清精品专区| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 我要搜黄色片| 直男gayav资源| 国内揄拍国产精品人妻在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 免费av毛片视频| 亚洲第一电影网av| 欧美一区二区精品小视频在线| 男人的好看免费观看在线视频| 一本精品99久久精品77| 黄片无遮挡物在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲av中文av极速乱| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产av麻豆久久久久久久| 久久久久国产网址|