轉(zhuǎn)Fat-1基因豬外源基因遺傳穩(wěn)定性分析

華文君，鄭新民，華再東，畢延震，宋忠旭，任紅艷

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064)

轉(zhuǎn)Fat-1基因豬外源基因遺傳穩(wěn)定性分析

華文君，鄭新民，華再東，畢延震，宋忠旭，任紅艷

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064)

測(cè)定轉(zhuǎn)Fat-1基因豬外源基因遺傳穩(wěn)定性，為轉(zhuǎn)基因豬育種選擇優(yōu)質(zhì)新材料提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。采用PCR和Southern印跡雜交方法對(duì)轉(zhuǎn)Fat-1基因傳代生產(chǎn)仔豬進(jìn)行檢測(cè)，了解Fat-1基因在豬基因組中的整合情況，統(tǒng)計(jì)傳代豬轉(zhuǎn)基因陽性比率，與自然基因單等位基因正常遺傳比率進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)2代傳代仔豬Fat-1基因陽性比率為57.14%，F(xiàn)3代傳代仔豬陽性比率為46.67%。F1代公豬外源Fat-1基因是1拷貝基因，傳代配種母豬使用非轉(zhuǎn)基因母豬，仔豬陽性比率與自然基因單等位基因正常遺傳比率(50%)差異不顯著。Fat-1基因在豬育種傳代過程中遺傳力沒有下降，轉(zhuǎn)Fat-1基因公豬能夠穩(wěn)定遺傳生產(chǎn)后代豬。

Fat-1基因； 轉(zhuǎn)基因豬; 遺傳穩(wěn)定性； 多聚不飽和脂肪酸

飲食中總脂肪和飽和脂肪的攝入量占總熱量的比例不斷減少，而ω-6多聚不飽和脂肪酸(ω-6 PUFAs)的攝入增加和ω-3多聚不飽和脂肪酸(ω-3 PUFAs)減少,導(dǎo)致ω-6與ω-3 PUFAs比例達(dá)到20∶1，甚至更高,這種情況對(duì)心血管疾病、慢性疾病具有明顯影響[1]，并且使超重和肥胖的患病率顯著增加。紅細(xì)胞(RBC)膜磷脂中ω-6 PUFAs及ω-6與ω-3 PUFAs比例增加可導(dǎo)致肥胖的風(fēng)險(xiǎn)增加。通過增加攝入二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)能夠減少疾病產(chǎn)生，ω-6/ω-3 PUFAs平衡對(duì)身體健康具有重要意義[2]。ω-3 PUFAs能夠降低膜脂中膽固醇含量，增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性[3-4]，降低心腦血管疾病產(chǎn)生的比例[5]，具有抗炎、抗凝血等作用，還可抑制腫瘤生長(zhǎng)[6-7]，影響多種人類神經(jīng)性疾病[8-9]，食品中適量補(bǔ)充ω-3 PUFAs對(duì)身體保健具有多種功效。

人和哺乳動(dòng)物缺少ω-3、ω-6多不飽和脂肪酸脫氫酶，不能夠生成ω-3、ω-6 PUFAs，2種物質(zhì)必須從食物中獲取。秀麗線蟲Fat-1基因編碼的ω-3多聚不飽和脂肪酸脫氫酶具有將ω-6 PUFAs轉(zhuǎn)化生成ω-3 PUFAs的能力[10-11]。采用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈ω-3 PUFAs是解決ω-3 PUFAs食物短缺的有效方法之一，轉(zhuǎn)Fat-1基因豬可提高豬肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,具有很好的應(yīng)用前景。轉(zhuǎn)Fat-1基因牛、豬已成功制備[12],轉(zhuǎn)Fat-1基因豬ω-6/ω-3 PUFAs的比值從14.53下降到2.62[13]。

外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中能夠穩(wěn)定遺傳是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新品種育種的重要研究?jī)?nèi)容之一，豬基因組是自然界長(zhǎng)期自然選擇進(jìn)化形成的穩(wěn)定基因組,通過基因工程技術(shù)人工整合的外源基因在豬基因組中的整合結(jié)構(gòu)是否能夠穩(wěn)定遺傳,需要進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物傳代測(cè)試才能夠明確。測(cè)試外源基因遺傳穩(wěn)定性對(duì)轉(zhuǎn)基因豬育種選擇優(yōu)良個(gè)體，及改進(jìn)轉(zhuǎn)基因方法具有重要意義。本試驗(yàn)采用PCR和Southern印跡雜交方法對(duì)轉(zhuǎn)Fat-1基因傳代生產(chǎn)仔豬進(jìn)行檢測(cè)，了解Fat-1基因在豬基因組中的整合情況，統(tǒng)計(jì)陽性豬比率，以分析Fat-1基因在轉(zhuǎn)基因豬中的遺傳穩(wěn)定性，為轉(zhuǎn)基因豬育種選擇優(yōu)質(zhì)新材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

基因組總DNA提取試劑盒、Southern印跡雜交檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)生命技術(shù)公司，地高辛標(biāo)記核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)羅氏公司，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ購(gòu)自美國(guó)Promega公司，2×PCR反應(yīng)混合液購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 轉(zhuǎn)Fat-1基因豬配種傳代

從豬場(chǎng)保種的轉(zhuǎn)Fat-1基因豬中選擇F1代轉(zhuǎn)基因陽性耳號(hào)3028公豬，配種1頭非轉(zhuǎn)基因陰性母豬，從F2代生產(chǎn)仔豬中選取1頭陽性公豬，在其12月齡配種1頭陰性母豬，母豬產(chǎn)仔斷奶后再與相同陽性公豬配種。及時(shí)保存生產(chǎn)仔豬樣品，檢測(cè)Fat-1基因在豬基因組中的整合情況。

1.3 PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)Fat-1基因豬

1.3.1 豬基因組總DNA提取 采集仔豬耳組織樣品，用75%乙醇保存，每頭仔豬取25 mg耳組織，記錄仔豬樣品編號(hào)和對(duì)應(yīng)的仔豬耳號(hào)。應(yīng)用基因組總DNA提取試劑盒提取總DNA，使用膜吸附法完成樣品制備。每個(gè)樣品加入180 μL組織消化液、20 μL蛋白酶K溶液，50 ℃消化12 h，加入20 μL RNase，37 ℃消化35 min。用200 μL洗脫液溶解DNA樣品，測(cè)定DNA濃度，樣品-20 ℃保存。

1.3.2 PCR法檢測(cè)Fat-1基因 每個(gè)樣品取DNA 120 ng,使用引物HFP1、HFP2擴(kuò)增Fat-1 基因片段。特異擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為600 bp。陽性對(duì)照為基因?qū)胧褂玫馁|(zhì)粒，陰性對(duì)照采用非轉(zhuǎn)基因豬樣品。

擴(kuò)增引物序列為HFP1: 5′-GTGATGCTATTGCTTTATTTGTAAC-3′；HFP2: 5′-GGAGCAGTGGTGGAATGCCT-3′。PCR反應(yīng)體系：2×PCR反應(yīng)混合液12.5 μL，DNA樣品120 ng，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，加ddH2O至總體積25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s,62 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s,30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。PCR法檢測(cè)14頭F2代傳代仔豬，15頭F3代傳代仔豬。

1.4 Southern印跡雜交分析Fat-1基因整合

PCR法檢測(cè)得到的轉(zhuǎn)Fat-1基因豬，通過苯酚抽提方法純化其DNA樣品，使用Southern印跡雜交檢測(cè)Fat-1基因整合情況。PCR陽性豬、陰性豬總DNA各取15 μg,苯酚抽提1次，氯仿/異戊醇抽提1次，加2倍體積的無水乙醇沉淀DNA。-20 ℃冷凍后離心取沉淀，70%乙醇洗沉淀1次。DNA樣品抽真空干燥后，加入20 μL ddH2O溶解，用10 μL限制性內(nèi)切酶XbaⅠ于37 ℃消化7 h，將消化樣品抽真空濃縮到15 μL。陽性對(duì)照為基因?qū)胧褂玫馁|(zhì)粒，陰性對(duì)照采用非轉(zhuǎn)基因豬樣品。

檢測(cè)使用地高辛標(biāo)記核酸檢測(cè)試劑盒完成，PCR擴(kuò)增Fat-1基因600 bp片段，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物作為Southern印跡雜交探針。樣品用經(jīng)堿變性、中和處理的1%瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜23 h，120 ℃烤膜30 min。對(duì)尼龍膜在42 ℃進(jìn)行預(yù)雜交1 h、雜交過夜，在68 ℃水浴條件下洗膜2次。室溫封阻尼龍膜、結(jié)合抗體、洗抗體，暗室避光進(jìn)行免疫顯色反應(yīng)26 h，觀察記錄Southern印跡雜交帶。陽性豬特異雜交帶為1.8 kb，陰性豬沒有雜交帶。統(tǒng)計(jì)傳代豬轉(zhuǎn)基因陽性比率，與自然基因單等位基因正常遺傳比率用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 F2代轉(zhuǎn)Fat-1基因傳代豬的檢測(cè)

F1代3028號(hào)陽性公豬(Fat-1基因1拷貝[14])配種3205號(hào)非轉(zhuǎn)基因陰性母豬，生產(chǎn)F2代仔豬14頭。用PCR法檢測(cè)14頭傳代仔豬樣品，共8頭仔豬檢測(cè)結(jié)果為轉(zhuǎn)Fat-1基因陽性(圖1)，對(duì)應(yīng)仔豬耳號(hào)分別為5001、5002、5004、5007、5008、5009、5010、5014號(hào)。F2代轉(zhuǎn)基因陽性豬比率為57.14%，公豬外源基因?yàn)?拷貝基因，配種母豬是陰性母豬，仔豬轉(zhuǎn)基因陽性比率與自然基因單等位基因正常遺傳比率(50%)差異不顯著，表明Fat-1基因能夠穩(wěn)定遺傳到F2代仔豬。

M:DNA分子標(biāo)記；1:陽性對(duì)照；2:陰性對(duì)照；3—16:仔豬樣品 圖1 F2代轉(zhuǎn)Fat-1基因豬檢測(cè)

2.2 F3代轉(zhuǎn)Fat-1基因傳代豬的檢測(cè)

2.2.1 第1次配種陽性仔豬檢測(cè) F2代轉(zhuǎn)Fat-1基因5009號(hào)陽性公豬配種5012號(hào)陰性母豬，生產(chǎn)F3代仔豬8頭。PCR法檢測(cè)8頭轉(zhuǎn)Fat-1基因傳代仔豬，得到5頭陽性豬(圖2)，對(duì)應(yīng)豬耳號(hào)分別為9010、9050、9060、9080、9090。疑似陽性豬1頭，耳號(hào)為9070。6頭豬樣品經(jīng)Southern印跡雜交分析，4個(gè)樣品有1.8 kb特異雜交帶，確認(rèn)為Fat-1基因整合陽性，陽性豬耳號(hào)為9010、9050、9080、9090。仔豬陽性比率為50.00%，公豬攜帶1拷貝外源基因，陰性母豬配種，仔豬轉(zhuǎn)基因陽性比率與自然基因單等位基因正常遺傳比率(50%)相同。

M:DNA分子標(biāo)記；1—8:仔豬樣品；9、10:陰性對(duì)照；11、12:陽性對(duì)照 圖2 第1次配種F3代轉(zhuǎn)Fat-1基因豬PCR檢測(cè)

2.2.2 第2次配種陽性仔豬檢測(cè) F2代轉(zhuǎn)Fat-1基因5009號(hào)陽性公豬再次配種5012號(hào)陰性母豬，生產(chǎn)F3代仔豬7頭。PCR法檢測(cè)7頭轉(zhuǎn)Fat-1基因傳代仔豬，得到3頭陽性豬(圖3)，對(duì)應(yīng)豬耳號(hào)為9002、9004、9007。疑似陽性豬1頭，耳號(hào)為9003。4頭豬樣品經(jīng)Southern印跡雜交分析，其中3個(gè)樣品有1.8 kb特異雜交帶(圖4)，確認(rèn)為Fat-1基因整合陽性，陽性豬耳號(hào)為9002、9004、9007。仔豬陽性比率為42.86%，公豬外源基因?yàn)?拷貝，配種母豬是陰性母豬，仔豬轉(zhuǎn)基因陽性比率與自然單等位基因正常遺傳比率(50%)差異不顯著。

M:DNA分子標(biāo)記；1、2:陽性對(duì)照；3、4:陰性對(duì)照；5—11:仔豬樣品

1:陽性對(duì)照；2:陰性對(duì)照；3—6:仔豬樣品

F2代轉(zhuǎn)Fat-1基因豬2次配種生產(chǎn)15頭F3代仔豬，經(jīng)過PCR和Southern雜交檢測(cè)，7頭豬為轉(zhuǎn)基因整合陽性，仔豬陽性比率為46.67%，與自然單等位基因正常遺傳比率(50%)差異不顯著，表明Fat-1基因能夠穩(wěn)定遺傳到F3代仔豬。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)Fat-1基因豬中的外源基因遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試分析，F(xiàn)2代傳代仔豬Fat-1基因陽性比率為57.14%，F(xiàn)3代傳代仔豬陽性比率為46.67%。F1代公豬外源Fat-1基因是1拷貝基因，配種母豬都是非轉(zhuǎn)基因陰性母豬，傳代仔豬陽性比率與自然基因單等位基因正常遺傳比率(50%)差異不顯著,Fat-1基因能夠從F1代豬穩(wěn)定遺傳到F3代豬?？梢姡現(xiàn)at-1基因在豬基因組中的整合穩(wěn)定，豬育種傳代過程中遺傳力沒有下降，轉(zhuǎn)Fat-1基因耳號(hào)5009公豬能夠?yàn)榻⑥D(zhuǎn)Fat-1基因豬品系提供優(yōu)良種質(zhì)材料。

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Analysis of Exogenous Gene Hereditary Stability in Fat-1 Transgenic Pigs

HUA Wenjun,ZHENG Xinmin,HUA Zaidong,BI Yanzhen,SONG Zhongxu,REN Hongyan

(Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding of Hubei Province,Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430064,China)

In order to provide data for transgenic pig breeding selection of high quality new materials and establish experimental basis to improve transgenic method,Fat-1 transgenic pig exogenous gene genetic stability was tested and analysed.The integration ofFat-1 gene in pig genome andFat-1 gene genetic stability were detected by PCR and Southern blotting inFat-1 transgenic passage piglets.The transgenic positive rate of piglets was counted,and the heritability difference significance betweenFat-1 gene and natural single allele was analysed.The positive rate ofFat-1 gene in F2generation piglets was 57.14% and the positive rate of F3passage piglets was 46.67%.The exogenousFat-1 gene in F1generation poar was 1 copy gene and breeding sows were non-transgenic pigs.The heritability difference betweenFat-1 gene and natural single allele was not significant.TheFat-1 gene heritability did not decline during the passage of swine breeding,andFat-1 transgenic pig could stably produce moreFat-1 transgenic piglets.

Fat-1 gene; transgenic pigs; hereditary stability; PUFAs

S813.3

A

1004-3268(2017)11-0144-04

2017-06-10

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2016ZX08006002-006)；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目(2017-620-004-001)；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院競(jìng)爭(zhēng)性項(xiàng)目(2016jzxjh013)；湖北省技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)重大項(xiàng)目(2016ABA117)

華文君(1969-)，男，湖北團(tuán)風(fēng)人，副研究員，本科，主要從事轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和動(dòng)物繁殖研究工作。

E-mail:huawenjun08@aliyun.com