皂莢種質(zhì)資源RSAP遺傳多樣性分析及指紋圖譜的構(gòu)建

范定臣，張安世，劉 瑩，駱 揚(yáng)

(1.河南省林業(yè)科學(xué)研究院，河南 鄭州 450008； 2.焦作師范高等專(zhuān)科學(xué)校 理工學(xué)院，河南 焦作 454000)

皂莢種質(zhì)資源RSAP遺傳多樣性分析及指紋圖譜的構(gòu)建

范定臣1，張安世2*，劉 瑩2，駱 揚(yáng)2

(1.河南省林業(yè)科學(xué)研究院，河南 鄭州 450008； 2.焦作師范高等專(zhuān)科學(xué)校 理工學(xué)院，河南 焦作 454000)

利用RSAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)18份皂莢種質(zhì)材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，從45對(duì)RSAP引物中篩選了12對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出167個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶154個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPL)為92.22%。各引物Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息指數(shù)(I)的平均值分別為0.229 8和0.371 6，18份皂莢種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)(GS)為0.431 1～0.988 0。 UPGMA聚類(lèi)分析表明，在GS為0.62處可將18份皂莢種質(zhì)資源分為3組，其中，野皂莢單獨(dú)為一組，山皂莢和皂莢-T聚為一組，其他皂莢材料聚為一組。利用6對(duì)引物擴(kuò)增的9個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，構(gòu)建了18份皂莢種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜，可以將其區(qū)分并精準(zhǔn)鑒定。

皂莢； RSAP； DNA指紋圖譜； 遺傳多樣性

皂莢(GlediysiasinensisLam.)又叫皂角，屬豆科蘇木亞科皂莢屬(GleditsiaLinn.)植物，是我國(guó)重要的鄉(xiāng)土樹(shù)種，廣泛分布于我國(guó)東北、華北、華東、華南等地,多生長(zhǎng)于平原、山谷及丘陵地區(qū)，具有悠久的栽培歷史。皂莢適應(yīng)性廣[1]，抗性強(qiáng)，能抗旱、耐鹽、耐高溫[2]。皂莢具有多種用途，皂莢、皂刺、皂根、皂葉均可入藥,莢果富含皂甙，是重要的化工原料[3],具有很高的藥用價(jià)值和工業(yè)價(jià)值[4]，殺蟲(chóng)、殺鼠效果也非常好[5-6]。皂莢又是優(yōu)良的生態(tài)樹(shù)種，具有多種生態(tài)屬性，廣泛用作經(jīng)濟(jì)林、用材林、防護(hù)林及園林綠化[7]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)皂莢的研究主要集中在皂莢果實(shí)與皂刺中活性成分[1,8-9]、引種栽培[10]、生態(tài)屬性[11]等方面，有關(guān)遺傳學(xué)[12-14]方面的研究還僅限于表型分析。最近，分子標(biāo)記技術(shù)已開(kāi)始在皂莢研究中應(yīng)用。邢俊連等[15]利用已公布的皂莢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)得到6 494條EST-SSR特異性引物，對(duì)6個(gè)來(lái)源地的12份皂莢材料進(jìn)行了有效性篩選和多態(tài)性分析，并利用篩選出的有效引物對(duì)皂莢9個(gè)近緣種進(jìn)行了引物通用性檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)，這些引物在其近緣種間具有很高的通用性，為以后開(kāi)展皂莢種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究提供了有效的分析方法和手段。李偉等[16]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)10個(gè)南方皂莢群體進(jìn)行了遺傳多樣性研究，具體分析了皂莢群體遺傳結(jié)構(gòu)形成的原因，并提出了皂莢的保護(hù)策略。目前，尚未見(jiàn)到有關(guān)皂莢RSAP分子標(biāo)記研究的報(bào)道。

限制性位點(diǎn)擴(kuò)增多態(tài)性(Restriction site amplified polymorphism,RSAP)是由杜曉華等[17]基于基因組上廣泛分布的限制性酶切位點(diǎn)而建立的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)。RSAP在PCR擴(kuò)增程序上參照了SRAP標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)，借鑒了RAPD標(biāo)記隨機(jī)序列的模糊匹配原理，在操作上又避免了AFLP的限制酶切等復(fù)雜步驟，具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可靠、產(chǎn)率中等特點(diǎn)，已在辣椒[18-19]、南瓜[20]、大花三色堇[21]、龍須菜[22]等植物研究上得到了成功應(yīng)用。本試驗(yàn)采用RSAP標(biāo)記對(duì)河南省18份皂莢種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并構(gòu)建DNA指紋圖譜，以期為皂莢種質(zhì)資源的鑒定、雜交育種親本的選配等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試皂莢材料包括3個(gè)種共18份，具體見(jiàn)表1。其中野皂莢、山皂莢和皂莢-T為實(shí)生苗，其余均為嫁接苗。

表1 供試材料

1.2 皂莢基因組DNA的提取

采用改良CTAB法[23]提取皂莢基因組DNA，并將模板DNA質(zhì)量濃度稀釋至20 ng/μL，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RSAP-PCR分析

選用10個(gè)RSAP引物(Rs1—Rs10)兩兩組合共45對(duì)RSAP引物對(duì)供試材料進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體積為10 μL，包括DNA 1.0 μL、正反引物各 0.5 μL、2×TaqMasterMix 5.0 μL、RNase-Free water 3.0 μL。RSAP-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠分離。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行條帶的統(tǒng)計(jì)分析。電泳圖在相同位置上若出現(xiàn)DNA條帶記為“1”，無(wú)則記為“0”，形成1，0矩陣，將此矩陣導(dǎo)入POPGENE 1.32軟件進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPL)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息指數(shù)(I)等遺傳多樣性參數(shù)分析，最后通過(guò)NTSYS-pc 2.0軟件依據(jù)UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析。同時(shí)，參照云天海等[24]的方法構(gòu)建18份皂莢種質(zhì)材料的DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 RSAP引物篩選與多態(tài)性分析

以供試的18份皂莢材料對(duì)45對(duì)RSAP引物進(jìn)行了篩選，最終篩選出了條帶清晰、多態(tài)性高的12對(duì)引物，所用引物序列及多態(tài)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。12對(duì)引物共擴(kuò)增出167個(gè)條帶，多態(tài)性條帶154個(gè)，PPL為92.22%，說(shuō)明皂莢具有較高的RSAP多態(tài)性。在被統(tǒng)計(jì)的12對(duì)引物中，引物組合Rs7-Rs10擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)最多，為24個(gè)，引物組合Rs1-Rs6、Rs1-Rs7、Rs5-Rs10和Rs7-Rs9擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)最少，為10個(gè)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)為13.92個(gè)。引物組合Rs6-Rs10的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)POPGENE 1.32軟件分析得到皂莢遺傳多樣性參數(shù)(表2)，各引物Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)的變化范圍為0.148 6～0.302 8，平均值為0.229 8，H值最高的引物組合為Rs2-Rs9(0.302 8)，H值最低的引物組合為Rs1-Rs8(0.148 6)；各引物Shannon’s信息指數(shù)(I)的變化范圍為0.256 7～0.461 7，平均值為0.371 6，I值最高的引物組合為Rs2-Rs9 (0.461 7)，I值最低的引物組合為Rs1-Rs8(0.256 7)。

表2 RSAP引物及多態(tài)性分析

注：T為位點(diǎn)總數(shù); N為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)。

M:標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量； 1～18:材料編號(hào)同表1，下同

2.2 皂莢種質(zhì)資源間的遺傳相似性和聚類(lèi)分析

利用NTSYS-pc軟件計(jì)算皂莢種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)，結(jié)果表明，18份皂莢種質(zhì)材料間的GS為0.431 1～0.988 0，平均值為0.756 6，變幅為0.556 9，說(shuō)明供試材料間存在較大的遺傳差異。其中焦科4和焦科5的GS最大(0.988 0)，親緣關(guān)系最近，豫皂1和皂莢-T的GS最小(0.431 1)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

利用NTSYS-pc軟件對(duì)18份皂莢種質(zhì)材料進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖2)，結(jié)果表明，在GS為0.62處可將18份皂莢種質(zhì)材料分為3組。第1組為野皂莢；第2組為山皂莢和皂莢-T；第3組共有15份皂莢材料：密刺、豫皂2、懷皂王2、博科、皂莢-H、碩刺、焦科1、焦科3、豫皂1、太行2、濟(jì)科、嵩刺1、焦科2、焦科4和焦科5。該聚類(lèi)結(jié)果與皂莢的傳統(tǒng)分類(lèi)基本一致。

圖2 18份皂莢種質(zhì)資源的聚類(lèi)分析結(jié)果

2.3 皂莢種質(zhì)資源DNA指紋圖譜的構(gòu)建

通過(guò)分析篩選的12對(duì)引物對(duì)18份皂莢種質(zhì)材料的擴(kuò)增結(jié)果，選取其中Rs2-Rs9、Rs4-Rs7、Rs4-Rs8、Rs5-Rs10、Rs6-Rs10和Rs7-Rs9六對(duì)引物擴(kuò)增的9個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建了18份皂莢種質(zhì)的DNA指紋圖譜(圖3)。每份材料都有唯一的指紋圖譜，可以將18份皂莢種質(zhì)材料區(qū)分并準(zhǔn)確鑒定。

圖3 18份皂莢種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜

3 結(jié)論與討論

3.1 皂莢種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

與形態(tài)學(xué)標(biāo)記相比，分子標(biāo)記能直接反映基因組DNA的遺傳變異信息，有助于了解種質(zhì)資源之間的遺傳差異，對(duì)于種質(zhì)資源的合理利用具有重要意義。在本研究中，利用RSAP標(biāo)記就DNA擴(kuò)增的總位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)百分率、Nei’s 基因多樣性指數(shù)、 Shannon’s 信息指數(shù)等多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，12對(duì)引物共擴(kuò)增出167條帶，其中多態(tài)性條帶154條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率高達(dá)92.22%，Nei’s 基因多樣性指數(shù)、Shannon’s 信息指數(shù)分別為0.229 8和0.371 6，說(shuō)明18份皂莢種質(zhì)資源具有較高的RSAP多態(tài)性,遺傳變異也較為豐富。上述研究結(jié)果可以為皂莢優(yōu)良品種的選育和皂莢種質(zhì)資源的鑒定提供理論指導(dǎo)。

3.2 皂莢種質(zhì)資源的聚類(lèi)分析

本研究涉及野皂莢、山皂莢和皂莢3個(gè)種共18份材料。聚類(lèi)結(jié)果表明，在GS為0.62處可將18份皂莢種質(zhì)材料分為3組。其中，野皂莢單獨(dú)為一組，山皂莢和皂莢-T聚為一組，其余15份皂莢嫁接苗聚為一組。從整體結(jié)果來(lái)看，該聚類(lèi)結(jié)果與皂莢的傳統(tǒng)分類(lèi)基本吻合。在上述第3組的15份皂莢種質(zhì)材料中，焦科4和焦科5是以皂莢莢果為目的選育的品種，其余均以皂刺為目的選育。焦科4和焦科5的接穗均為莢果較大的不同皂莢品種，聚類(lèi)結(jié)果顯示，兩者在所有供試材料中親緣關(guān)系最近，與預(yù)期相符。濟(jì)科是以嵩刺1為接穗、山皂莢為砧木的嫁接品種，兩者首先聚在一起，具有很近的親緣關(guān)系，也與實(shí)際情況相吻合。另外，皂莢-T是從土耳其引進(jìn)種子的3年生播種苗，起初曾被作為皂莢品種，但其3年生播種苗無(wú)論從葉的形態(tài)、皮孔大小及形狀以及嫩枝的顏色都與山皂莢極為相似，因此認(rèn)為該種子在引進(jìn)時(shí)可能鑒定有誤。本研究結(jié)果顯示，山皂莢和皂莢-T聚為一組，兩者具有很近的親緣關(guān)系，因此，應(yīng)將皂莢-T歸為山皂莢而非皂莢品種，同時(shí)還要結(jié)合其他分子標(biāo)記技術(shù)及其以后的生長(zhǎng)過(guò)程中所表現(xiàn)出的其他形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3.3 RSAP標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源鑒定上的應(yīng)用分析

分子標(biāo)記以其高效、快捷、準(zhǔn)確度高、信息量大、適合數(shù)字化等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為植物種質(zhì)鑒定的有效方法。喬利仙等[25]利用RSAP標(biāo)記技術(shù)從擴(kuò)增的408條多態(tài)性條帶中選取其中10條穩(wěn)定且重復(fù)性好的條帶構(gòu)建了15個(gè)紫菜系的DNA 指紋圖譜，并將此圖譜實(shí)現(xiàn)了計(jì)算機(jī)化，可以驗(yàn)證這些紫菜系的身份。劉澤發(fā)等[20]利用SRAP和RSAP 2種標(biāo)記方法，對(duì)印度南瓜品種雜交種子進(jìn)行了純度鑒定試驗(yàn)，選用引物 E1M5 和 R1R7能夠較好地鑒定紅栗二號(hào)、紅栗、錦栗二號(hào)和錦栗南瓜，并將引物R1R7檢測(cè)的錦栗雜交種子純度與田間檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，其吻合率達(dá)到 90%。本研究利用RSAP技術(shù),選用6對(duì)引物擴(kuò)增的9個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建了18份皂莢種質(zhì)材料的DNA指紋圖譜，為皂莢種質(zhì)資源的鑒別提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

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Genetic Diversity and Fingerprints of Glediysia sinensis Germplasms Based on RSAP

FAN Dingchen1,ZHANG Anshi2*,LIU Ying2,LUO Yang2

(1.Henan Academy of Forestry,Zhengzhou 450008,China; 2.School of Science，Jiaozuo Teachers College，Jiaozuo 454000,China)

Genetic diversity of 18Glediysiasinensisgermplasms was analyzed by the RSAP markers.The results showed that 12 primers were screened out of 45 primer pairs and 167 bands were obtained，including 154 polymorphic bands，with the percentage of polymorphic loci(PPL) of 92.22%.The average Nei’s gene diversity(H) and Shannon’s information index(I) were 0.229 8 and 0.371 6,and the genetic similarity coefficients among the tested samples ranged from 0.431 1 to 0.988 0.UPGMA analysis showed that 18Glediysiasinensiswere clustered into 3 groups with the genetic similarity coefficient of 0.62.Glediysiaheterophyllaformed the first group,Glediysiamelanacanthaand Zaojia-T were clustered into the second group,and the others were clustered into the third group.In total of 18Glediysiasinensisgermplasm DNA fingerprints were constructed from 9 polymorphic loci amplified by 6 primer pairs and these materials could be distinguished and identified accurately.

Glediysiasinensis; RSAP； DNA fingerprint; genetic diversity

S718.46

A

1004-3268(2017)11-0103-05

2017-06-20

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(14210221100850)；2015年河南省林業(yè)廳科技興林項(xiàng)目

范定臣(1967-)，男，河南沁陽(yáng)人，高級(jí)工程師，本科，主要從事園林綠化及林木育種研究。

E-mail:fdclky@139.com

*

張安世(1965-)，男，河南博愛(ài)人，教授，碩士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail:aszhang1212@163.com