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    重組人膠原蛋白微生物限度檢查方法的建設(shè)及驗證

    2017-12-19 12:11:32李曉穎侯增淼史瑾翟寧寧楊金芳楊小琳趙金禮
    科技創(chuàng)新與應(yīng)用 2017年35期

    李曉穎+侯增淼+史瑾+翟寧寧+楊金芳+楊小琳+趙金禮

    摘 要:目的:建立重組人膠原蛋白原料的微生物限度檢測方法及控制菌檢測方法,并進行方法學(xué)驗證,用于重組人膠原蛋白原料的質(zhì)量控制。方法:依據(jù)《中國藥典》2015版四部通則1105和1106,對重組人膠原蛋白原料需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)進行檢測,并對控制菌進行檢測。結(jié)果:連續(xù)3批重組人膠原蛋白原料回收率范圍在0.8-1.2之間,符合規(guī)定;控制菌檢測方法符合規(guī)定。結(jié)論:重組人膠原蛋白需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢測采用直接接種法,控制菌檢測采用常規(guī)法。

    關(guān)鍵詞:人膠原蛋白;微生物限度;方法建設(shè);方法學(xué)驗證。

    中圖分類號:S961.6 文獻標(biāo)志碼:A 文章編號:2095-2945(2017)35-0098-02

    前言

    重組人膠原蛋白是通過生物技術(shù)手段構(gòu)建的工程菌株,經(jīng)發(fā)酵,分離純化制備的器械原料,其主要成分為重組人膠原蛋白。根據(jù)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn),應(yīng)進行細(xì)菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)以及控制菌檢查,根據(jù)中國藥典2015版四部通則1105,1106規(guī)定[1],建立重組人膠原蛋白原料的微生物限度檢查方法,驗證培養(yǎng)基靈敏度,并進行方法適用性檢查,為重組人膠原蛋白原料建立符合質(zhì)量控制要求的檢測方法。

    1 設(shè)備材料

    1.1 材料

    胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基,麥康凱液體培養(yǎng)基,麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基,溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基均購自陜西標(biāo)普,氯化鈉,聚山梨酯80。

    高壓滅菌鍋(上海申安),超凈工作臺(蘇凈凈化),分析天平(萬分之一,奧豪斯),生化培養(yǎng)箱(上海博泰),水浴鍋。

    金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003],銅綠假單胞菌[CMCC(B)44102],枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501],大腸埃希菌[CMCC(B)44102],白色念珠菌[CMCC(F)98001],黑曲霉[CMCC(F)98003]均購自陜西標(biāo)普,各菌種的工作菌種均傳至第3代。

    1.2 供試品

    本公司按規(guī)定工藝生產(chǎn)的連續(xù)3批重組人膠原蛋白凍干海綿,批號分別為:201704010,201704011,201704012。

    2 實驗方法

    2.1 菌液制備

    接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌,大腸埃希菌,枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,30~35℃培養(yǎng)18~24小時,培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,20~25℃培養(yǎng)48小時,培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液;接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi),用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌孢子懸液。

    2.2 供試品制備

    稱取供試品1g,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10ml,配制成1:10供試品溶液。

    2.3 直接接種法方法適用性檢查

    2.3.1 供試品組制備

    取90mm無菌平皿6塊,每塊加入1ml供試品溶液,3塊平皿注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固,33℃倒置培養(yǎng)3天,逐日觀察;3塊平皿注入15-20ml的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固,25℃倒置培養(yǎng)5天,逐日觀察。

    2.3.2 實驗組制備

    取90mm無菌平皿15塊,每塊加入1ml供試品溶液,再各吸取1ml小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉至3塊平皿,注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固,33℃倒置培養(yǎng)3天,逐日觀察;取90mm無菌平皿6塊,每塊平皿加入1ml供試品溶液,再各吸取1ml小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉至3塊平皿,注入15-20ml的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固,25℃倒置培養(yǎng)5天,逐日觀察。

    2.3.3 陽性組制備

    取90mm無菌平皿15塊,各吸取1ml小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉至3塊平皿,均注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固后,33℃倒置培養(yǎng)3天,逐日觀察;取90mm無菌平皿6塊,各吸取1ml小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉至3塊平皿,均注入15-20ml的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固后,25℃倒置培養(yǎng)3天,逐日觀察。

    2.3.4 陰性組制備

    各吸取1ml稀釋劑至6塊平皿,3塊注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,3塊注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固,于對應(yīng)溫度倒置培養(yǎng),作為陰性對照,逐日觀察。

    2.4 控制菌檢查方法適用性驗證

    2.4.1 實驗組制備

    取1:10供試品溶液10ml,接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,加入小于100cfu/ml大腸埃希菌菌懸液,35℃培養(yǎng)18-24小時,取1ml接種于100ml麥康凱液體培養(yǎng)基,44℃培養(yǎng)18-24h,后劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上,35℃倒置培養(yǎng)18-24小時[2];取1:10供試品溶液10ml,接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,加入小于100cfu/ml金黃色葡萄球菌菌懸液,35℃培養(yǎng)18-24小時,后劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上,35℃倒置培養(yǎng)18-24小時;取1:10供試品溶液10ml,接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,加入小于100cfu/ml銅綠假單胞菌菌懸液,33℃培養(yǎng)18-24小時,后劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基上,35℃倒置培養(yǎng)18-24小時。endprint

    2.4.2 供試品組制備

    取1:10供試品溶液10ml,接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,于35℃培養(yǎng)18-24小時,后劃線接種于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上,35℃倒置培養(yǎng),觀察生長狀況。

    2.4.3 陽性組制備

    各吸取小于100cfu/ml的大腸埃希菌,金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌接種于100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,于35℃培養(yǎng)18-24小時,后劃線接種于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上,35℃倒置培養(yǎng),觀察生長狀況。

    2.4.4 陰性組制備

    吸取10ml的0.9%無菌氯化鈉,分別接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,于35℃培養(yǎng)18-24小時,后劃線接種于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上,35℃倒置培養(yǎng),觀察生長狀況。

    3 實驗結(jié)果

    3.1 菌液稀釋級確定

    通過對不同菌懸液進行稀釋培養(yǎng),最終確定各菌懸液稀釋級,結(jié)果如表1:

    3.2 直接接種法方法適用性檢查

    根據(jù)《中國藥典》2015版四部通則1105規(guī)定,回收率等于試驗組菌落數(shù)減去供試品組菌落數(shù)的值與菌液陽性組菌落數(shù)的比值,回收率在0.5-2.0范圍內(nèi)時,可照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù),結(jié)果如表2。

    金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,枯草芽孢桿菌,白色念珠菌,黑曲霉回收率在0.8-1.2之間。符合規(guī)定。表明重組人膠原蛋白原料的檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計,可以照此檢查方法和檢查條件進行供試品的微生物限度檢查。

    連續(xù)3批重組人膠原蛋白凍干海綿需氧菌總數(shù)分別為120cfu/g,110cfu/g,90cfu/g,霉菌和酵母菌總數(shù)分別為<10cfu/g,<10cfu/g,<10cfu/g,符合《中國藥典》2015版四部通則1105規(guī)定的需氧菌總數(shù)不得超過200cfu/g,霉菌和酵母菌總數(shù)不得超過20cfu/g。

    3.3 控制菌檢查

    根據(jù)《中國藥典》2015版四部通則1106規(guī)定試驗組和陽性組應(yīng)檢出試驗菌,供試品組,陰性對照組應(yīng)不得檢出,即該試驗方法成立。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌控制菌檢查結(jié)果如表3。

    實驗組和陽性組大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌在相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基上均生長良好;陰性組無菌生長;符合《中國藥典》2015版四部控制菌檢查驗證要求。

    連續(xù)3批重組人膠原蛋白凍干海綿控制菌未檢出,符合規(guī)定。

    4 結(jié)束語

    從上述結(jié)果來看,金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,枯草芽孢桿菌,白色念珠菌,黑曲霉回收率在0.8-1.2之間,說明樣品對金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,枯草芽孢桿菌,白色念珠菌,黑曲霉均沒有抑菌作用,可采用直接接種法進行需氧菌、霉菌和酵母菌的檢查??刂凭鷻z查方法學(xué)驗證符合規(guī)定,可用于進行樣品的控制菌檢查。

    參考文獻:

    [1]國家藥典委員會.中國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:140-149.

    [2]李敏,申國慶,龔春燕.復(fù)方土茯苓膠囊微生物限度檢查方法驗證[J].藥學(xué)與臨床研究,2017,25(1):33-35.endprint

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