一株耐鋅菌株的分離鑒定及其生長(zhǎng)特性研究

曹 禮， 李曉慧， 張芹輝， 賈東波， 孫曉杰， 徐麗梅， 雷玉明

(河西學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 張掖 734000)

一株耐鋅菌株的分離鑒定及其生長(zhǎng)特性研究

曹 禮， 李曉慧， 張芹輝， 賈東波， 孫曉杰， 徐麗梅， 雷玉明

(河西學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 張掖 734000)

從造紙廠排污口的土壤中分離對(duì)鋅具有較強(qiáng)耐受性的菌株HXZ-1。菌株HXZ-1能夠在含鋅離子濃度為50 mg/L的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，能耐受鋅離子的最高濃度為1000 mg/L。結(jié)合其生理生化特征和16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將該菌株鑒定為原小單孢菌屬(Promicromonosporasp. HXZ-1)。菌株HXZ-1最適培養(yǎng)條件為：鋅離子濃度為50 mg/L、葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源。當(dāng)鋅離子濃度為50 mg/L時(shí)，菌株HXZ-1對(duì)鋅吸附率最大，為29.1%；當(dāng)鋅離子濃度為500 mg/L時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為10 h時(shí)，菌株HXZ-1吸附率最大，為18.8%。菌株HXZ-1是一株對(duì)鋅有較強(qiáng)抗性和吸附性的細(xì)菌，為重金屬污染的微生物修復(fù)提供參考。

耐鋅；16S rRNA；原小單孢菌屬；生長(zhǎng)特性

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，資源開(kāi)發(fā)與利用為國(guó)家的建設(shè)和發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)的同時(shí)，也造成了生態(tài)環(huán)境的破壞甚至生態(tài)失衡，比如采礦、冶金、煉油等重工業(yè)產(chǎn)生的污染物。越來(lái)越多的重金屬離子通過(guò)各種途徑進(jìn)入土壤和水體環(huán)境中，從而對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成了重大影響[1]。

鋅是維持機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝的重要物質(zhì)，曾被譽(yù)為“生命之花”[2]。鋅離子進(jìn)入環(huán)境后，它具有高毒性、難轉(zhuǎn)化、難遷移和生物富集等特性。其一旦進(jìn)入環(huán)境后不能被生物轉(zhuǎn)化，將參與食物鏈的循環(huán)，最終在人體內(nèi)富集，破壞人體內(nèi)正常的生理代謝，危害人體健康[3]。實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，人體尿樣中含鋅量為1000 μg/L以上時(shí)，人體處于鋅中毒狀態(tài)[4]。

微生物修復(fù)技術(shù)因其具有處理費(fèi)用低,對(duì)環(huán)境影響小、效率高等優(yōu)點(diǎn), 在治理重金屬污染方面具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來(lái)，利用環(huán)境中的微生物來(lái)修復(fù)重金屬離子對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染問(wèn)題逐漸引起人們的重視。如廖佳等從鉛鋅礦區(qū)分離篩選出耐鋅菌株AspergillusoryzaeHA，研究了不同試驗(yàn)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響以及菌株對(duì)鋅離子的吸附[5]；樊霆等從某鋅尾砂壩土壤中篩選分離得到一株對(duì)鋅具有較強(qiáng)抗性的菌株AspergillusflavusCTB430-1，鋅對(duì)該菌株的最低抑菌濃度為800 mg/L[6]；王慧萍等從江西德興銅礦重金屬污染土壤中篩選得到一株菌株Sphingomonassp. DX-T3-03，可以抗 25 mmol/L的鋅[7]；李慧芬等從鉛鋅尾礦區(qū)與污水灌溉區(qū)土壤中篩選到一株抗鋅的菌株StreptomycesciscaucasicusCCNWHX 72-14，對(duì)鋅的抗性達(dá)到845 mg/L[8]；李進(jìn)等從湖南資興鉛鋅礦區(qū)的尾砂礦礦渣中篩選到菌株VerticilliuminsectorumJ3，在最佳條件下對(duì)鋅的去除率為 87.7%[9]。因此，從重金屬污染區(qū)土壤中分離耐性菌株用于治理重金屬污染，已成為生物修復(fù)生態(tài)環(huán)境的有效途徑[10-12]。

本研究從甘肅省某造紙廠排污口污水處，長(zhǎng)期受重金屬污染的土壤中篩選出一株具有抗鋅能力的菌株，通過(guò)其生理生化特征和16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定該菌株，通過(guò)不同碳源、氮源和金屬離子對(duì)其菌株HXZ-1生長(zhǎng)影響的研究，探討該菌株的生長(zhǎng)特性，為該菌在重金屬污染的微生物修復(fù)技術(shù)中提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離純化所得，樣品采自甘肅省某造紙廠排污口土壤的不同位置，裝塑料袋密封保存，備用。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

分子操作中所用的酶、抗生素均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，其余試劑為分析純。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 8.0，pH 7.0，固體培養(yǎng)基在上述培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15 g/L的瓊脂。

1.1.3 儀器與設(shè)備

分析天平(FA2104N)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-X400)、分光光度計(jì)(722 s)購(gòu)于上海精密科學(xué)儀器有限公司；高壓式蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-50SII)購(gòu)于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺(tái)(SWCJ-1)購(gòu)于蘇州凈化設(shè)備；離心機(jī)(IS-R)購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠； Alpha凝膠成像系統(tǒng)(JS-780)購(gòu)于上海思伯明儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 耐鋅菌株的馴化與分離

耐鋅菌株的分離采用梯度壓力馴化法[7]。稱取10 g待測(cè)污水樣品，加入100 mL無(wú)菌水中，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，使細(xì)菌充分懸浮。移取1 mL培養(yǎng)液至另一盛有新鮮的5% LB培養(yǎng)基(含100 mg/L的ZnCl2)的三角瓶中于30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d；移取l mL培養(yǎng)液至另一盛有新鮮的5% LB培養(yǎng)基(含200 mg/L的ZnCl2)的三角瓶中于30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d；培養(yǎng)后依次移入含300、400、500、600、700、800、900和1000 mg/L ZnCl2的5% LB液體培養(yǎng)基中于30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。吸取適量菌液稀釋涂布于含有500 mg/L ZnCl2的固體LB培養(yǎng)基上，于30℃下培養(yǎng)48 h，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落，經(jīng)連續(xù)分離純化后，得到具有鋅抗性的菌株，編號(hào)為HXZ-1，將純化的菌培養(yǎng)后于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生理生化特征鑒定

菌株形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)等參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]《Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology》[14]等進(jìn)行。

1.2.3 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及其測(cè)序

采用高鹽法提取菌體的染色體總DNA[15]。以菌株的總DNA為模板，使用通用引物來(lái)擴(kuò)增菌株的16S rRNA基因。5′端引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(Escherichiacolibases 8～27)，3′端引物為5′-TACCTTGTTACGACTT-3′(E.colibases 1507～1492)。50 μL的反應(yīng)體系：10×Buffer 5.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)4.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL，引物(1 mmol/L)各1.0 μL，DNA模板(50.0 ng/μL)1.0 μL，Taq酶(5.0 U/μL)0.5 μL，超純水33.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；最后，72℃再延伸10 min。取PCR產(chǎn)物于0.75%的瓊脂糖凝膠上電泳。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司完成測(cè)序。

1.2.4 菌株HXZ-1對(duì)不同碳源利用試驗(yàn)

試驗(yàn)測(cè)定的碳源分別為：葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、木糖、麥芽糖、阿拉伯糖。在無(wú)碳源培養(yǎng)基中分別加入不同碳源使其終濃度為0.5%。將菌株HXZ-1按3% (V/V) 的接種量接種到裝有20 mL 不同碳源培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，在600 nm下測(cè)吸光值，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行，取平均值。

1.2.5 菌株HXZ-1對(duì)不同氮源利用試驗(yàn)

試驗(yàn)測(cè)定的氮源分別為：酵母粉、蛋白胨、硝酸鈉、硝酸銨、尿素、亞硝酸鈉、草酸銨。在無(wú)氮源培養(yǎng)分別加不同氮源使其終濃度為0.5%，將菌株HXZ-1按3%(V/V)的接種量接種到裝有20 mL 不同氮源培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，在600 nm下測(cè)吸光值，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行，取平均值。

1.2.6 不同鋅離子濃度對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)的影響

在50 mL三角瓶中分別裝入20 mL LB培養(yǎng)基，于120℃滅菌30 min。在培養(yǎng)基中加入ZnCl2母液，使其終濃度分別為0、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000和1200 mg/L，以1%的接種量分別接入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的種子液，設(shè)置空白對(duì)照(不添加任何金屬離子)，于30℃，150 r/min培養(yǎng)11 h取樣，在600 nm下測(cè)吸光值，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，各樣品均設(shè)不接菌的空白對(duì)照。

1.2.7 菌株HXZ-1在不同鋅離子濃度下的吸附試驗(yàn)[16]

1.2.8 菌株HXZ-1在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鋅離子的吸附試驗(yàn)[17]

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鋅菌株HXZ-1的篩選

樣品經(jīng)過(guò)多次馴化培養(yǎng)后，吸取適量菌液稀釋涂布于含有800 mg/L ZnCl2的固體LB培養(yǎng)基上，于30℃下培養(yǎng)48 h，得到一株長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，編號(hào)為HXZ-1，在LB固體平板上生長(zhǎng)24 d后形成乳黃色、不透明、邊緣整齊、表面隆起、濕潤(rùn)光滑、易挑起的圓形菌落(如圖1-A和1-B)，革蘭氏染色為陽(yáng)性(如圖1-C)，無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢。

2.2 不同鋅離子濃度對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)的影響

通過(guò)菌株HXZ-1在不同濃度的鋅離子液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，了解菌株對(duì)不同鋅離子濃度的耐受性情況。如圖2所示，當(dāng)鋅離子濃度為1200 mg/L時(shí)，OD600為0，菌體生長(zhǎng)被完全抑制；當(dāng)鋅離子濃度為50 mg/L時(shí)，OD600最大，為0.895。從總體趨勢(shì)來(lái)看，隨著鋅離子濃度的逐漸增大，OD600的值先升高后降低。這說(shuō)明，低濃度的鋅離子(50 mg/L)對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)均有刺激作用，而鋅離子濃度高于50 mg/L時(shí)會(huì)對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)有抑制作用，抑制作用隨濃度增加而增大。這可能是由于高濃度的鋅離子對(duì)菌株有一定的毒性，導(dǎo)致新陳代謝活性和生長(zhǎng)量降低[6]。據(jù)報(bào)道，菌株耐鋅濃度為1～10 mmol/L時(shí)為中度耐鋅細(xì)菌，而耐鋅濃度超過(guò)10 mmol/L為抗鋅細(xì)菌[18]，菌株HXZ-1能耐受鋅離子的最高濃度為1000 mg/L，因此可以判斷出菌株HXZ-1為抗鋅細(xì)菌。

圖1 菌株HXZ-1在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(A)及其革蘭氏染色(B)的結(jié)果

圖2 不同鋅離子濃度對(duì)菌種HXZ-1生長(zhǎng)的影響

2.3 16S rRNA基因擴(kuò)增

菌株HXZ-1的基因組DNA提取結(jié)果見(jiàn)圖3，基因組DNA在電泳圖上的23 130 bp附近一條明顯的條帶，可以用于PCR擴(kuò)增，16S rRNA 序列擴(kuò)增長(zhǎng)度為1500 bp左右。

2.4 16S rRNA基因序列的測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)16S rRNA基因的測(cè)序結(jié)果，將其序列與EzTaxon-e server(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)數(shù)據(jù)庫(kù)中16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，選擇其中的12株菌的16S rRNA基因序列用于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，采用CLUSTAL_X將菌株XHZ-1的16S rRNA基因序列與其同源關(guān)系相近的序列比對(duì)分析后[19]，把兩頭的序列剪切整齊，用MEGA version 5.0 軟件包中的Kimura-Parameter Distance 模型計(jì)算進(jìn)化距離，用Neighbor-Joining 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[20]，1000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算自引導(dǎo)值(Bootstrap)以評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的置信度。結(jié)果如圖4，菌株HXZ-1所得16S rRNA基因序列與其序列相近的菌株都在Promicromonospora屬，與模式菌株P(guān)romicromonosporaflavaCC 0387T具有最高的相似性為98.46%，結(jié)合前述的菌株形態(tài)特征，可以鑒定該菌株HXZ-1為原小單孢菌屬(Promicromonosporasp. HXZ-1)。

圖3 菌株HXZ-1的基因組DNA、16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

M1: λDNA /HindIII Marker; M2: DL 2000 Marker; 1: total DNA of strain HXZ-1; 2: 16S rRNA gene

圖4 菌株 HXZ-1的系統(tǒng)發(fā)育分析

The scale bar represents an evolutionary distance of 0.01， the accession numbers are in parentheses

2.5 菌株HXZ-1對(duì)不同碳源利用試驗(yàn)

不同碳源對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)影響的結(jié)果如圖5所示。不同的微生物利用糖、醇、有機(jī)酸、脂肪酸等的能力有很大的差異，這是菌株鑒定中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。在以NH4NO3作氮源的情況下，供試的8種碳源中：菌株HXZ-1對(duì)葡萄糖、甘露醇和蔗糖的利用較好，其中對(duì)葡萄糖利用最好，OD600值最大，為0.771；對(duì)淀粉、阿拉伯糖和麥芽糖利用較差，說(shuō)明菌株HXZ-1的最適碳源為葡萄糖。

圖5 不同碳源對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)的影響

2.6 菌株HXZ-1對(duì)不同氮源利用試驗(yàn)

不同氮源對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)影響的結(jié)果如圖6所示。不同的微生物利用氮源的能力有很大的差異，也是菌株鑒定中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。在以葡萄糖作碳源的情況下，供試的7種氮源中：菌株HXZ-1對(duì)2種有機(jī)氮源蛋白胨、酵母粉利用較好，而對(duì)硝酸鈉和亞硝酸鈉的利用較差，當(dāng)?shù)鞍纂俗鳛榈磿r(shí)，OD600值最大，為0.728；說(shuō)明菌株HXZ-1的最適氮源為蛋白胨。

圖6 不同氮源對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)的影響

2.7 菌株HXZ-1對(duì)不同濃度鋅離子的吸附試驗(yàn)

菌株HXZ-1對(duì)不同濃度鋅離子的吸附率如圖7所示。微生物對(duì)不同濃度的金屬離子的吸附能力有很大的差異。從總體趨勢(shì)來(lái)看，隨著鋅離子濃度的增大，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率先升高后降低。在0～50 mg/L，隨著鋅離子濃度的增加，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)鋅離子濃度大于50 mg/L時(shí)，吸附率逐漸減小，當(dāng)大于200～1000 mg/L之間，吸附率較低。當(dāng)鋅離子濃度為50 mg/L時(shí)，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率最大，為29.1%，這可能與菌株HXZ-1在含有50 mg/L的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好有關(guān)。

2.8 菌株HXZ-1在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)鋅離子的吸附試驗(yàn)

微生物在不同生長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)金屬離子的吸附能力有很大的差異，在培養(yǎng)體系中鋅離子濃度為500 mg/L時(shí)仍能生長(zhǎng)的細(xì)菌，被認(rèn)為是耐鋅性較強(qiáng)的微生物[18]。當(dāng)鋅離子濃度為500 mg/L時(shí)，菌株HXZ-1在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鋅吸附率的結(jié)果如圖9所示?？偟膩?lái)看，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率先升高后降低。該菌株HXZ-1在0～4 h內(nèi)，吸附率上升趨勢(shì)較慢；在4～10 h內(nèi)，吸附率上升趨勢(shì)較快；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于10 h時(shí)，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率開(kāi)始下降。試驗(yàn)表明，當(dāng)菌株HXZ-1的培養(yǎng)時(shí)間為10 h時(shí)，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率最大，為18.8%。

圖7 培養(yǎng)基中不同鋅濃度時(shí)菌體HXZ-1對(duì)鋅吸附率的影響

圖8菌株HXZ-1在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Zn2+吸附率的影響

3 結(jié)論

本研究從某造紙廠的污水中篩選到一株對(duì)鋅具有抗性的菌株HXZ-1，對(duì)其進(jìn)行生理生化研究和系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為原小單孢菌屬(Promicromonosporasp. HXZ-1)。當(dāng)前，抗鋅菌株報(bào)道較多，主要在Aspergillus,Penicillium,Sphingomonas,Streptomyces和Verticillium等屬[5-9, 21]，尚未在Promicromonospora屬有抗鋅菌株的報(bào)道。因此，Promicromonospora屬抗鋅菌株的分離，為鋅污染區(qū)域的微生物修復(fù)提供了新的菌種資源。

菌株HXZ-1在鋅離子濃度為50 mg/L的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，能耐受鋅離子的最高濃度為1000 mg/L。菌株HXZ-1在葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源生長(zhǎng)最好。當(dāng)菌株HXZ-1在此最優(yōu)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，鋅離子濃度為50 mg/L時(shí)，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率最大，為29.1%；當(dāng)鋅離子濃度為500 mg/L時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為10 h時(shí)，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率最大，為18.8%。因此，菌株HXZ-1是一株對(duì)鋅有較強(qiáng)抗性和吸附性的細(xì)菌，在重金屬鋅污染區(qū)域的微生物修復(fù)中有著良好的應(yīng)用潛力。

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Isolationandidentificationofazinc-resistancestrainandresearchonitsgrowthcharacteristics

CAO Li, LI Xiao-hui, ZHANG Qin-hui, JIA Dong-bo, SUN Xiao-jie, XU Li-mei, LEI Yu-ming

(College of Agriculture and Biotechnology; Key Laboratory of Hexi Corridor Resourses Utilization of Gansu, Hexi University, Zhangye 734000, China)

A bacterium with strong tolerance to zinc, strain HXZ-1, was isolated from sewage of a paper mill. It could tolerate 1000 mg/L of zinc ion. Based on the phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene and the physiologic & biochemical characteristics, it was identified asPromicromonosporasp. HXZ-1. The culture conditions of strain HXZ-1 were zinc ion concentration of 50 mg/L, glucose as carbon source and peptone as the nitrogen source. When the concentration of zinc ions in cultural liquid was 50 mg/L, the zincic adsorption rate of HXZ-1 reached the maximum of 29.1%; the maximum zincic adsorption rate of strain HXZ-1 run up to 18.8% after cultured 10 h in concentration of zinc ions as 500 mg/L. Strain HXZ-1 had better adsorption effect and tolerance to zinc.

zinc-resistance； 16S rRNA；Promicromonospora； growth characteristics

2016-11-26；

2017-01-05

河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(No. XZ1401)

曹 禮，副教授，博士，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)，E-mail：caolicl@126.com

雷玉明，教授，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)，E-mail：zyymlei@126.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.060

Q93-331; Q935

A

2095-1736(2017)06-0060-05