青海茶卡鹽湖嗜鹽堿芽胞桿菌資源分析

王小英， 劉國(guó)紅， 劉 波， 陳 崢， 潘志針， 朱育菁， 王階平， 唐建陽(yáng)

(1. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建 福州 350116； 2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所， 福建 福州 350003)

青海茶卡鹽湖嗜鹽堿芽胞桿菌資源分析

王小英1， 劉國(guó)紅2， 劉 波2， 陳 崢2， 潘志針2， 朱育菁2， 王階平2， 唐建陽(yáng)2

(1. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建 福州 350116； 2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所， 福建 福州 350003)

采用3種不同的培養(yǎng)基， 通過(guò)可培養(yǎng)法， 從青海茶卡鹽湖樣品中共分離獲得110株嗜鹽堿芽胞桿菌. 基于16S rRNA基因序列相似性鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析， 得出這些菌株為芽胞桿菌10個(gè)屬的41個(gè)種， 它們與最近匹配模式菌株的16S rRNA基因序列相似性在96%～100%之間， 以芽胞桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌， 共計(jì)25種83株； 存在6個(gè)潛在新種. 3種酶篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 87%的嗜鹽堿芽胞桿菌菌株具有產(chǎn)酶能力， 產(chǎn)蛋白酶70株， 產(chǎn)纖維素酶81株， 產(chǎn)木聚糖酶50株. 青海茶卡鹽湖中的芽胞桿菌種類(lèi)豐富多樣且能產(chǎn)多種酶， 并且潛藏著新的微生物物種， 研究結(jié)果可為嗜鹽堿芽胞桿菌資源開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ).

嗜鹽堿芽胞桿菌； 蛋白酶； 纖維素酶； 木聚糖酶; 青海??； 茶卡鹽湖

0 引言

嗜鹽堿芽胞桿菌是一類(lèi)重要的微生物資源， 因長(zhǎng)期受到鹽堿性條件的壓迫而具有獨(dú)特的生理特性， 可以產(chǎn)生多種堿性酶類(lèi)資源[1]， 如堿性蛋白酶、 堿性果膠酶、 堿性淀粉酶、 堿性纖維素酶及堿性木聚糖酶等， 廣泛應(yīng)用于洗滌、 造紙、 制造皮革等行業(yè)[2-4]. 近年來(lái)， 嗜鹽堿芽胞桿菌的嗜鹽堿機(jī)理[5]、 多樣性[6-8]、 堿性酶類(lèi)及其應(yīng)用[9]等都已成為研究熱點(diǎn).

茶卡鹽湖位于青海省海西蒙古族藏族自治州烏蘭縣茶卡鎮(zhèn)附近， 是柴達(dá)木盆地有名的天然結(jié)晶鹽湖. 茶卡鹽湖具有高鹽堿環(huán)境和獨(dú)特的地理氣候特征， 因而蘊(yùn)藏著豐富的嗜鹽堿微生物資源. 灑威等[10]從青海茶卡鹽湖中獲得2株在pH值為 10條件下生長(zhǎng)的極端嗜鹽堿真菌； 柴麗紅等[11]應(yīng)用變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析青?？驴蔓}湖與茶卡鹽湖土壤樣品的細(xì)菌多樣性, 初步發(fā)現(xiàn)這兩相鄰鹽湖的細(xì)菌均表現(xiàn)出豐富的多樣性且相互間具有較大差異性； 沈碩等[12]從青海茶卡鹽湖及察爾汗鹽湖中分離到200株嗜鹽菌并從中初步篩選到20株能夠抑制植物病原菌， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些嗜鹽菌對(duì)辣椒疫霉具有較強(qiáng)的抑制作用， 但目前尚未見(jiàn)關(guān)于青海茶卡鹽湖嗜鹽堿芽胞桿菌資源多樣性分析的研究報(bào)道. 為了較完整地了解青海茶卡鹽湖中嗜鹽堿芽胞桿菌種群的多樣性， 本研究采用3種不同的培養(yǎng)基從茶卡鹽湖樣品中分離嗜鹽堿芽胞桿菌， 同時(shí)分析其產(chǎn)酶多樣性， 為后期嗜鹽堿芽胞桿菌的資源開(kāi)發(fā)利用提供菌種來(lái)源.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

樣品采集于2015年8月23日青海省茶卡鹽湖中， 裝入無(wú)菌采集袋并進(jìn)行編號(hào)(01、 02、 03、 04、 05、 06)， 帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行分離.

1.1.2 分離和酶篩培養(yǎng)基

Horikoshi-I 培養(yǎng)基[13]： 葡萄糖10.0 g， 蛋白胨5.0 g， 酵母浸出物5.0 g， K2HPO41.0 g， MgSO40.2 g， Na2CO310.0 g(單獨(dú)滅菌)， 瓊脂15～20 g， 水1 000 mL， pH值為 9.0. 改良LB-I培養(yǎng)基(75.0 g·L-1NaCl)： 胰蛋白胨10.0 g， 酵母浸出物5.0 g， NaCl 75.0 g， 瓊脂15～20 g， 水1 000 mL， pH值為 9.0. 改良LB-II培養(yǎng)基(150.0 g·L-1NaCl)： 胰蛋白胨10.0 g， 酵母浸出物5.0 g， NaCl 150.0 g， 瓊脂15～20 g， 水1 000 mL， pH 值為9.0. 以上培養(yǎng)基均置于高壓蒸汽滅菌鍋中， 121 ℃滅菌20 min.

纖維素酶篩選培養(yǎng)基： 酵母浸出物10.0 g， NaCl 5.0 g， 胰蛋白胨10.0 g， 羧甲基纖維素鈉10.0 g， 瓊脂15～20 g， 水1 000 mL， pH值為 9.0. 顯色試劑[14]： 2 g KI+1 g I2+300 mL水. 蛋白酶篩選培養(yǎng)基： 牛肉浸膏3.0 g， 蛋白胨10.0 g， NaCl 5.0 g， 脫脂奶粉20 g， 水1 000 mL， 瓊脂15～20 g， pH 值為9.0， 奶粉與瓊脂分開(kāi)滅菌. 木聚糖酶篩選培養(yǎng)基： 木聚糖5 g， 瓊脂15～20 g， 水1 000 mL， pH值為 9.0. 以上培養(yǎng)基均置于高壓蒸汽滅菌鍋中， 121 ℃滅菌20 min， 奶粉滅菌條件為115 ℃， 15 min.

1.1.3 主要試劑和儀器

細(xì)菌通用16S rRNA引物27F及1492R由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成. PCR反應(yīng)試劑： 10×Buffer、 dNTP(10 mmol·L-1(each))、Taq酶(2.5 U·μL-1)購(gòu)自上海鉑尚生物技術(shù)有限公司， 100 bp Marker購(gòu)自上海英駿生物技術(shù)有限公司. DNA提取試劑： 100 mmol·L-1NaCl， 10 mmol·L-1Tris/HCl， 1 mmol·L-1EDTA， Tris飽和酚(pH 值為8.0).

儀器包括UVP GelDoc-It TS Imaging System凝膠成像儀(美國(guó)UVP公司)、 Tpersonal Biometra梯度PCR儀(華粵行儀器有限公司)、 PowerPac Basic BIO-RAD電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、 Eppendorf Centrifuge 5418R離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)等.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嗜鹽堿芽胞桿菌的資源分離與鑒定

芽胞桿菌的分離參考劉國(guó)紅等[15]的描述方法. 采用苯酚-氯仿法提取芽胞桿菌基因組DNA. 采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序工作. 通過(guò)EZtaxon-e[16]進(jìn)行菌株16S rRNA基因序列分析， 利用Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[17-18].

1.2.2 嗜鹽堿芽胞桿菌資源的酶活分析

采用透明圈法[19]， 用無(wú)菌牙簽刮取適量菌體分別點(diǎn)接于各種酶的篩選培養(yǎng)基， 30 ℃培養(yǎng)2 d觀察平板上產(chǎn)透明圈情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜鹽堿芽胞桿菌資源的分離

采用3種不同培養(yǎng)基從青海茶卡鹽湖6份樣品中共分離獲得了110株嗜鹽堿芽胞桿菌， 其中Horikoshi-I培養(yǎng)基中分離到58株， LB-I培養(yǎng)基中有35株， LB-II培養(yǎng)基中僅有17株， Horikoshi-I培養(yǎng)基分離到的嗜鹽堿芽胞桿菌數(shù)量最多. 這些嗜鹽堿芽胞桿菌多數(shù)菌落偏小， 顏色主要有黃色、 乳白色， 少數(shù)為金黃色， 圓形不透明， 表面光滑濕潤(rùn)或粘稠狀態(tài)居多， 干燥粗糙者偏少， 邊緣形態(tài)有整齊、 不規(guī)則、 鋸齒形， 菌落高度絕大多數(shù)為隆起狀， 扁平狀較少.

2.2 嗜鹽堿芽胞桿菌的分子鑒定

經(jīng)16S rRNA基因序列鑒定， 不同培養(yǎng)基分離到的嗜鹽堿芽胞桿菌種類(lèi)不同(見(jiàn)表1). Horikoshi-I培養(yǎng)基分離到5個(gè)屬、 26個(gè)種， LB-I培養(yǎng)基(75.0 g·L-1NaCl)分離到5個(gè)屬、 16個(gè)種， LB-II培養(yǎng)基(150.0 g·L-1NaCl)分離到6個(gè)屬、 10個(gè)種. 經(jīng)統(tǒng)計(jì)可得， 3種培養(yǎng)基共分離獲得的芽胞桿菌存在部分重復(fù)， 隸屬于10個(gè)屬41個(gè)種， 分別為居鹽水芽胞桿菌屬(Aquisalibacillus)(1種3株)、 芽胞桿菌屬(Bacillus)(25種83株)、 房間芽胞桿菌屬(Domibacillus)(1種1株)、 纖細(xì)芽胞桿菌屬(Gracilibacillus)(2種2株)、 喜鹽芽胞桿菌屬(Halobacillus)(3種7株)、 咸海鮮芽胞桿菌屬(Jeotgalibacillus)(1種1株)、 大洋芽胞桿菌屬(Oceanobacillus)(3種7株)、 類(lèi)芽胞桿菌屬(Paenibacillus)(1種1株)、 深海芽胞桿菌屬(Thalassobacillus)(1種2株)、 枝芽胞桿菌屬(Virgibacillus)(3種3株).

在Horikoshi-I與LB-I培養(yǎng)基上都能夠生長(zhǎng)的種類(lèi)有： 海水芽胞桿菌(Bacillusaquimaris)、 深褐芽胞桿菌(Bacillusatrophaeus)、 環(huán)狀芽胞桿菌(Bacilluscirculans)、Bacilluscrassostreae、 堀越氏芽胞桿菌(Bacillushorikoshii)、 地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、 假堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌(Bacilluspseudofirmus)及短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus). 在LB-I與LB-II培養(yǎng)基上都能夠生長(zhǎng)的種類(lèi)有： 岸喜鹽芽胞桿菌(Halobacilluslitoralis). 在3種培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)的種類(lèi)有： 圖畫(huà)大洋芽胞桿菌(Oceanobacilluspicturae). 其余的種類(lèi)只在3種培養(yǎng)基中的任意一種上分離獲得.

表1嗜鹽堿芽胞桿菌的16SrRNA基因鑒定與產(chǎn)酶活性

序號(hào)培養(yǎng)基類(lèi)型菌株編號(hào)最近匹配中文名稱(chēng)相似性/%序列號(hào)蛋白酶(H/C)纖維素酶(H/C)木聚糖酶(H/C)1H-IFJAT-44622Bacilluspolygoni蓼屬芽胞桿菌98．37KU95560005．403．922H-IFJAT-44623Bacilluspseudofirmus假堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌98．72KU95560105．584．703H-IFJAT-44624Bacilluspseudofirmus假堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌98．05KU95560204．133．834H-IFJAT-44625Bacilluscirculans環(huán)狀芽胞桿菌98．80KU95560309．233．885H-IFJAT-44626Bacillussimplex簡(jiǎn)單芽胞桿菌99．86KU9556042．392．0306H-IFJAT-44627Domibacillusenclensis國(guó)化室房間芽胞桿菌100KU95560502．5007H-IFJAT-44629Bacillusfrigoritolerans耐寒芽胞桿菌99．78KU9556061．63008H-IFJAT-44630Bacillussimplex簡(jiǎn)單芽胞桿菌99．79KU9556071．98009H-IFJAT-44631Oceanobacilluspicturae圖畫(huà)大洋芽胞桿菌99．93KU95560800010H-IFJAT-44632Oceanobacillusprofundus深層大洋芽胞桿菌100KU95560902．63011H-IFJAT-44633Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556103．332．91012H-IFJAT-44634Bacillusaerius空氣芽胞桿菌100KU9556112．462．242．8313H-IFJAT-44635Bacillusdrentensis鉆特省芽胞桿菌97．84KU95561200014H-IFJAT-44636Bacillussafensis沙福芽胞桿菌100KU9556132．360015H-IFJAT-44637Bacillusaerius空氣芽胞桿菌100KU9556141．812．432．3416H-IFJAT-44638Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556153．932．343．5417H-IFJAT-44639Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．92KU9556163．412．77018H-IFJAT-44640Bacillusfrigoritolerans耐寒芽胞桿菌99．93KU9556171．3300

續(xù)表1

序號(hào)培養(yǎng)基類(lèi)型菌株編號(hào)最近匹配中文名稱(chēng)相似性/%序列號(hào)蛋白酶(H/C)纖維素酶(H/C)木聚糖酶(H/C)19H-IFJAT-44641Bacillusfrigoritolerans耐寒芽胞桿菌99．93KU9556182．650020H-IFJAT-44642Bacillusoceanisediminis海洋沉積芽胞桿菌99．93KU95561901．89021H-IFJAT-44643Bacillussafensis沙福芽胞桿菌100KU9556203．210022H-IFJAT-44644Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．64KU9556214．232．363．7023H-IFJAT-44645Bacillussalsus好鹽芽胞桿菌99．86KU95562204．88024H-IFJAT-44646Bacillusthuringiensis蘇云金芽胞桿菌99．57KU9556231．892．313．3225H-IFJAT-44647Bacillushalmapalus鹽敏芽胞桿菌99．29KU95562402．07026H-IFJAT-44648Bacilluslicheniformis地衣芽胞桿菌98．92KU95562502．04027H-IFJAT-44649Bacillussalsu好鹽芽胞桿菌99．78KU95562605．47028H-IFJAT-44650Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556273．421．862．6329H-IFJAT-44651Bacillus frigoritolerans耐寒芽胞桿菌99．57KU9556283．312．611．6130H-IFJAT-44652Bacillushalmapalus鹽敏芽胞桿菌99．15KU9556291．901．73031H-IFJAT-44653Bacillusfrigoritolerans耐寒芽胞桿菌99．93KU9556302．301．27032H-IFJAT-44654Bacillusaquimaris海水芽胞桿菌99．29KU9556312．684．883．6533H-IFJAT-44655Bacillusaquimaris海水芽胞桿菌99．50KU9556323．092．972．3234H-IFJAT-44656Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556333．311．652．8235H-IFJAT-44657Bacillushorikoshii堀越氏芽胞桿菌99．08KU9556341．702．242．3336H-IFJAT-44658Gracilibacillusthailandensis泰國(guó)纖細(xì)芽胞桿菌98．90KU95563502．237．0337H-IFJAT-44659Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．86KU9556364．104．143．1038H-IFJAT-44660Bacillushalmapalus鹽敏芽胞桿菌99．15KU9556372．321．63039H-IFJAT-44661Bacillussimplex簡(jiǎn)單芽胞桿菌99．64KU9556384．010040H-IFJAT-44662Bacilluslicheniformis地衣芽胞桿菌98．85KU9556391．581．671．6341H-IFJAT-44663Bacilluscrassostreae100KU9556404．133．623．8542H-IFJAT-44664Bacillusalcalophilus嗜堿芽胞桿菌98．69KU9556411．950043H-IFJAT-44665Bacillussubtilis枯草芽胞桿菌99．93KU9556423．732．60044H-IFJAT-44666Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556433．352．77045H-IFJAT-44667Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556444．482．53046H-IFJAT-44668Bacillusfrigoritolerans耐寒芽胞桿菌100KU9556452．321．36047H-IFJAT-44669Bacillusoceanisediminis海洋沉積芽胞桿菌99．93KU95564601．98048H-IFJAT-44670Bacillusalkalisediminis堿性沉積芽胞桿菌99．08KU95564703．54049H-IFJAT-44671Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556484．922．49050H-IFJAT-44672Bacillushorikoshii堀越氏芽胞桿菌98．04KU9556492．582．19051H-IFJAT-44673Bacillushorikoshii堀越氏芽胞桿菌98．93KU9556502．771．92052H-IFJAT-44674Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556513．311．902．4553H-IFJAT-44675Bacilluspumilus短小芽胞桿菌99．85KU9556522．310054H-IFJAT-44676Bacilluspumilus短小芽胞桿菌99．79KU9556532．550055H-IFJAT-44677Bacillusoceanisediminis海洋沉積芽胞桿菌99．93KU95565401．632．4756H-IFJAT-44678Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556553．462．422．8657H-IFJAT-44679Bacillusaquimaris海水芽胞桿菌99．22KU95565602．953．5258H-IFJAT-44680Paenibacilluslautus燦爛類(lèi)芽胞桿菌99．49KU95565702．86無(wú)59LB-IFJAT-44689Virgibacillussalexigens需鹽枝芽胞桿菌98．14KU9556582．14-060LB-IFJAT-44690Bacilluscirculans環(huán)狀芽胞桿菌99．30KU95565905．31061LB-IFJAT-44691Bacilluspseudofirmus假堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌99．31KU9556603．912．27062LB-IFJAT-44692Bacilluscohnii科恩芽胞桿菌98．70KU95566101．82063LB-IFJAT-44693Bacillushorikoshii堀越氏芽胞桿菌99．22KU9556623．322．432．2864LB-IFJAT-44694Bacilluscohnii科恩芽胞桿菌99．79KU95566302．72065LB-IFJAT-44695Bacillusflexus彎曲芽胞桿菌99．93KU9556642．783．832．97

續(xù)表1

序號(hào)培養(yǎng)基類(lèi)型菌株編號(hào)最近匹配中文名稱(chēng)相似性/%序列號(hào)蛋白酶(H/C)纖維素酶(H/C)木聚糖酶(H/C)66LB-IFJAT-44696Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556654．122．585．8667LB-IFJAT-44697Bacilluslicheniformis地衣芽胞桿菌99．79KU9556662．092．352．6768LB-IFJAT-44698Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556674．862．185．5069LB-IFJAT-44699Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556684．222．875．0570LB-IFJAT-44700Bacilluspumilus短小芽胞桿菌99．79KU9556693．9804．6971LB-IFJAT-44701Bacillusaquimaris海水芽胞桿菌99．57KU9556702．422．624．0072LB-IFJAT-44702Oceanobacilluspicturae圖畫(huà)大洋芽胞桿菌99．86KU95567102．833．7573LB-IFJAT-44703Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556724．772．577．4974LB-IFJAT-44704Bacillusaquimaris海水芽胞桿菌99．22KU9556733．321．932．7375LB-IFJAT-44705Oceanobacilluspicturae圖畫(huà)大洋芽胞桿菌99．36KU9556745．232．079．4376LB-IFJAT-44706Halobacilluslitoralis岸喜鹽芽胞桿菌99．79KU95567504．06077LB-IFJAT-44707Bacillusboroniphilus嗜硼芽胞桿菌100KU9556763．783．183．4578LB-IFJAT-44708Bacillushorikoshii堀越氏芽胞桿菌99．81KU9556772．091．782．0979LB-IFJAT-44709Bacilluspumilus短小芽胞桿菌99．86KU955678004．0580LB-IFJAT-44710Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．79KU9556793．992．026．8481LB-IFJAT-44711Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556804．032．366．2982LB-IFJAT-44712Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556813．602．636．7383LB-IFJAT-44713Bacillushorikoshii堀越氏芽胞桿菌99．43KU9556823．332．103．1884LB-IFJAT-44714Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．50KU9556833．991．856．1485LB-IFJAT-44715Bacilluspumilus短小芽胞桿菌99．79KU9556843．6403．9186LB-IFJAT-44716Bacilluscohnii科恩芽胞桿菌99．79KU95568502．22087LB-IFJAT-44717Bacilluslicheniformis地衣芽胞桿菌99．19KU9556861．961．662．3788LB-IFJAT-44718Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556872．972．555．4989LB-IFJAT-44719Bacillusagaradhaerens黏瓊脂芽胞桿菌99．93KU95568800090LB-IFJAT-44720Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556893．202．267．0791LB-IFJAT-44721Bacillusatrophaeus深褐芽胞桿菌99．93KU9556905．713．097．0992LB-IFJAT-44722Jeotgalibacilluscampisalis鹽地咸海鮮芽胞桿菌99．29KU9556911．811．542．1693LB-IFJAT-44723Bacilluscrassostreae99．68KU9556924．763．852．7494LB-IIFJAT-45313Halobacilluslitoralis岸喜鹽芽胞桿菌99．09KU9556931．401．45095LB-IIFJAT-45314Virgibacilluszhanjiangensis湛江枝芽胞桿菌100KU9556941．621．26096LB-IIFJAT-45315Thalassobacillusdevorans食有機(jī)物深海芽胞桿菌99．86KU9556952．491．50097LB-IIFJAT-45316Gracilibacillusorientalis東邊纖細(xì)芽胞桿菌100KU95569601．83098LB-IIFJAT-45317Halobacilluslitoralis岸喜鹽芽胞桿菌99．72KU9556971．930099LB-IIFJAT-45318Thalassobacillusdevorans食有機(jī)物深海芽胞桿菌99．65KU95569801．680100LB-IIFJAT-45319Virgibacillusnatechei＇鹽反硝化枝芽胞桿菌96．75KU955699000101LB-IIFJAT-45320Oceanobacillusmanasiensis瑪納斯大洋芽胞桿菌99．16KU955700000102LB-IIFJAT-45321Halobacillusprofundi深海喜鹽芽胞桿菌99．65KU955701000103LB-IIFJAT-45322Halobacillusdabanensis岸喜鹽芽胞桿菌99．65KU955702000104LB-IIFJAT-45323Halobacillusdabanensis岸喜鹽芽胞桿菌99．44KU955703000105LB-IIFJAT-45324Oceanobacilluspicturae圖畫(huà)大洋芽胞桿菌99．93KU955704000106LB-IIFJAT-45325Aquisalibacilluselongatus延伸居鹽水芽胞桿99．79KU955705000107LB-IIFJAT-45326Aquisalibacilluselongatus延伸居鹽水芽胞桿99．79KU955706000108LB-IIFJAT-45327Halobacilluslitoralis岸喜鹽芽胞桿菌98．94KU955707000109LB-IIFJAT-45328Aquisalibacilluselongatus延伸居鹽水芽胞桿99．64KU955708000110LB-IIFJAT-45329Oceanobacilluspicturae圖畫(huà)大洋芽胞桿菌99．21KU955709000

注： H-I表示Horikoshi-I培養(yǎng)基； 0表示不產(chǎn)酶

2.3 嗜鹽堿芽胞桿菌新種資源的系統(tǒng)發(fā)育分析

Kim等[20]報(bào)道了16S rRNA基因序列相似性低于98.65%時(shí)， 可判斷為不同的種的潛在新種資源. 由表1可知， 菌株FJAT-44622、 FJAT-44624、 FJAT-44635、 FJAT-44672、 FJAT-44689及FJAT-45319的16S rRNA基因序列相似性均小于98.37%， 可能為潛在新種， 該6株嗜鹽堿芽胞桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1. 由圖1可知， 這6株嗜鹽堿芽胞桿菌分為3群.

第一群為芽胞桿菌屬rRNA group 6， 包含2種潛在新種， 其中FJAT-44622與蓼屬芽胞桿菌(BacilluspolygoniYN-1T)的親緣關(guān)系最近， 16S rRNA基因序列相似性達(dá)98.37%， FJAT-44624與假堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌(BacilluspseudofirmusDSM 8715T)的16S rRNA基因序列相似性達(dá)98.05%.

第二群為枝芽胞桿菌屬(Virgibacillus)， 包含2種潛在新種， 其中FJAT-45319與鹽反硝化枝芽胞桿菌(VirgibacillusnatecheiFarDT)的16S rRNA基因序列相似性達(dá)96.75%， FJAT-44689與需鹽枝芽胞桿菌(VirgibacillussalexigensC-20MoT)的16S rRNA基因序列相似性達(dá)98.14%.

第三群為芽胞桿菌屬rRNA group 1和group 6， 包含2種潛在新種， 其中FJAT-44635獨(dú)立構(gòu)成一個(gè)分支， 與鉆特省芽胞桿菌(BacillusdrentensisLMG 21831T)的16S rRNA基因序列相似性達(dá)97.84%， FJAT-44672與堀越氏芽胞桿菌(BacillushorikoshiiDSM 8719T)的16S rRNA基因序列相似性達(dá)98.04%.

圖1 青海省茶卡鹽湖中潛在芽胞桿菌新種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Pylogeney of potential new Bacillus species isolated from Qinghai Chaka Salt Lake

2.4 嗜鹽堿芽胞桿菌資源的酶活分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1. 從110株嗜鹽堿芽胞桿菌中篩選到96個(gè)產(chǎn)酶菌株， 其中70株產(chǎn)蛋白酶(見(jiàn)圖2)， 深褐芽胞桿菌(B.atrophaeus)FJAT-44721的H/C值高達(dá)5.71； 81株產(chǎn)纖維素酶(見(jiàn)圖3)， 環(huán)狀芽胞桿菌(B.circulans)FJAT-44625的H/C值高達(dá)9.23； 50株產(chǎn)木聚糖酶(見(jiàn)圖4)， 圖畫(huà)大洋芽胞桿菌(Oceanobacilluspicturae)FJAT-44705的H/C值高達(dá)9.43.

由表1可知， 能同時(shí)產(chǎn)蛋白酶、 纖維素酶、 木聚糖酶3種酶的芽胞桿菌有6種， 它們是空氣芽胞桿菌(Bacillusaerius)(2株)、 嗜硼芽胞桿菌(Bacillusboroniphilus)(1株)、B.crassostreae(2株)、 彎曲芽胞桿菌(Bacillusflexus)(1株)、 蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)(1株)及鹽地咸海鮮芽胞桿菌(Jeotgalibacilluscampisalis)(1株). 能同時(shí)產(chǎn)蛋白酶、 纖維素酶2種酶的芽胞桿菌有6種， 它們是深褐芽胞桿菌(B.atrophaeus)(23株)、 食有機(jī)物深海芽胞桿菌(Thalassobacillusdevorans)(2株)及湛江枝芽胞桿菌(Virgibacilluszhanjiangensis)(1株)、 枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)(1株)、 堀越氏芽胞桿菌(Bacillushorikoshii)(6株)、 深褐芽胞桿菌(B.atrophaeus)(23株). 能同時(shí)產(chǎn)纖維素酶及木聚糖酶的芽胞桿菌有4種， 它們是蓼屬芽胞桿菌(Bacilluspolygoni)(1株)、 泰國(guó)纖細(xì)芽胞桿菌(Gracilibacillusthailandensis)(1株)、 海水芽胞桿菌(B.aquimaris)(5株)、 海水芽胞桿菌(Bacillusaquimaris)(5株). 其余芽胞桿菌僅能產(chǎn)這3種酶中的一種酶或是不產(chǎn)這3種酶.

圖2 菌株產(chǎn)蛋白酶情況 圖3 菌株產(chǎn)纖維素酶情況 圖4 菌株產(chǎn)木聚糖酶情況Fig.2 Protease-producing activity Fig.3 Cellulase-producing activity Fig.4 Xylanase-producing activity

3 討論

1) 鹽湖嗜鹽堿芽胞桿菌分離培養(yǎng)基的選擇. 不同成分、 不同鹽質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基分離到的嗜鹽堿芽胞桿菌種類(lèi)不同， 隨著鹽質(zhì)量濃度的升高， 分離到的芽胞桿菌種數(shù)呈減少的趨勢(shì)， Horikoshi-I培養(yǎng)基最多， LB-I培養(yǎng)基(75.0 g·L-1NaCl)次之， LB-II培養(yǎng)基(150.0 g·L-1NaCl)最少， 說(shuō)明青海茶卡鹽湖地區(qū)的高鹽堿土壤環(huán)境中嗜鹽堿芽胞桿菌的多樣性低于中度鹽分和低度鹽分的鹽堿土壤； 而總菌落數(shù)則相反， 高鹽堿的土壤環(huán)境中嗜鹽堿芽胞桿菌總菌落數(shù)高于中低鹽堿的， 該結(jié)果與王建明等[21]對(duì)塔里木盆地荒漠鹽堿生境嗜(耐)鹽堿細(xì)菌的研究結(jié)果相反. 鹽湖嗜鹽堿芽胞桿菌采用Horikoshi-I培養(yǎng)基分離效果最好， 分離的種類(lèi)多， 與王建明等[21]的研究結(jié)果相同. 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 在NaCl質(zhì)量濃度75.0～150.0 g·L-1范圍內(nèi)， 分離獲得的芽胞桿菌數(shù)量約占總數(shù)的50%， 表明該地區(qū)有近半數(shù)的芽胞桿菌資源對(duì)高鹽環(huán)境具有較高的耐受力， 該結(jié)果與杜傳英等[22]對(duì)東北地區(qū)耐鹽芽胞桿菌篩選統(tǒng)計(jì)的結(jié)果相同. 綜上表明， 培養(yǎng)基鹽堿條件是選擇合適分離嗜鹽堿芽胞桿菌培養(yǎng)基需考慮的重要因素.

2) 鹽湖嗜鹽堿芽胞桿菌鑒定. 16S rRNA基因是原核生物分類(lèi)地位判斷的黃金指標(biāo)之一， 當(dāng)兩株菌之間16S rRNA基因序列相似性低于98.65%時(shí)， 可認(rèn)為是兩種不同的種[20]. 通過(guò)16S rRNA基因序列分析， 本研究分離獲得的110株嗜堿芽胞桿菌初步鑒定為10個(gè)屬、 41個(gè)種， 其中25個(gè)種隸屬于芽胞桿菌屬. 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明存在6個(gè)潛在的芽胞桿菌新種， 它們與最近匹配模式菌株的16S rRNA基因序列相似性皆低于98.65%. 根據(jù)Logan等[23]和Tindall等[24]描述的產(chǎn)芽胞細(xì)菌新種鑒定標(biāo)準(zhǔn)， 需要進(jìn)一步進(jìn)行分類(lèi)學(xué)研究方可確定其準(zhǔn)確的分類(lèi)地位， 潛在新種的分析有待于進(jìn)一步研究.

3) 鹽湖嗜鹽堿芽胞桿菌資源多樣性. 據(jù)前人研究結(jié)果表明， 我國(guó)鹽堿湖中存在著豐富的芽胞桿菌資源. 與胡軼倫等[25]報(bào)道的新疆柴達(dá)布盆地鹽湖、 馮偉等[26]報(bào)道的天津團(tuán)泊湖、 鄭賀云等[27]報(bào)道的新疆阿克蘇地區(qū)鹽堿地、 陳超等[28]報(bào)道的新疆七角井鹽湖、 吳海平等[29]報(bào)道的新疆達(dá)坂鹽湖及王陶[6]報(bào)道的新疆羅布泊的鹽堿環(huán)境中分離到的嗜鹽堿芽胞桿菌相比， 本研究挖掘到的芽胞桿菌屬(Bacillus)、 纖細(xì)芽胞桿菌屬(Gracilibacillus)、 喜鹽芽胞桿菌屬(Halobacillus)、 咸海鮮芽胞桿菌屬(Jeotgalibacillus)、 大洋芽胞桿菌屬(Oceanobacillus)、 類(lèi)芽胞桿菌屬(Paenibacillus)、 深海芽胞桿菌屬(Thalassobacillus)及枝芽胞桿菌屬(Virgibacillus)， 在上述地區(qū)也有發(fā)現(xiàn). 同時(shí)， 芽胞桿菌為采樣地點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌群， 這與新疆柴達(dá)布盆地鹽湖[25]、 天津團(tuán)泊湖[26]、 新疆阿克蘇地區(qū)鹽堿地[27]及新疆羅布泊地區(qū)[6]分析結(jié)果一致. 本研究在青海茶卡鹽湖鹽堿環(huán)境中首次發(fā)現(xiàn)了居鹽水芽胞桿菌屬(Aquisalibacillus)與房間芽胞桿菌屬(Domibacillus)， 表明青海茶卡鹽湖中存在著豐富的嗜鹽堿芽胞桿菌種群， 為挖掘嗜鹽堿芽胞桿菌資源的研究提供了科學(xué)依據(jù).

4) 鹽湖嗜鹽堿芽胞桿菌資源酶活篩選. 嗜鹽堿芽胞桿菌能產(chǎn)生多種堿性酶， 在工業(yè)、 環(huán)保、 醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值. 通過(guò)酶篩實(shí)驗(yàn)， 發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶菌株占總數(shù)的87%， 同時(shí)產(chǎn)3種酶的有6種， 產(chǎn)兩種酶的有10種， 其中深褐芽胞桿菌(B.atrophaeusFJAT-44721)具有較高的產(chǎn)蛋白酶活性， 環(huán)狀芽胞桿菌(B.circulansFJAT-44625)具有較高的產(chǎn)纖維素酶活性， 圖畫(huà)大洋芽胞桿菌(O.picturaeFJAT-44705)具有較高的產(chǎn)木聚糖酶活性. 陳超[28]發(fā)現(xiàn)新疆七角井鹽湖可培養(yǎng)喜鹽芽胞桿菌屬(Halobacillus)具有高效的產(chǎn)蛋白酶能力， 而芽胞桿菌屬(Bacillus)不具備產(chǎn)蛋白酶能力， 這與本研究中大部分芽胞桿菌屬(Bacillus)具有良好的產(chǎn)酶能力趨勢(shì)相反. 同時(shí)， 孫同毅等[30]從天津塘沽鹽堿土壤中也分離到1株能產(chǎn)堿性蛋白酶的嗜堿芽胞桿菌(Bacillusalcalophilus)， 在一定程度上反映了嗜堿芽胞桿菌(B.alcalophilus)具有產(chǎn)蛋白酶的潛力. 產(chǎn)竹華等[31]對(duì)我國(guó)近海中度嗜鹽菌進(jìn)行產(chǎn)酶多樣性分析時(shí)， 雖然未發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)蛋白酶的芽胞桿菌種屬， 但發(fā)現(xiàn)枝芽胞桿菌屬(Virgibacillus)及喜鹽芽胞桿菌屬(Halobacillus)具有產(chǎn)纖維素酶的能力， 本研究發(fā)現(xiàn)的岸喜鹽芽胞桿菌(H.litoralis)與湛江枝芽胞桿菌(V.zhanjiangensis)具有產(chǎn)纖維素酶及蛋白酶的能力， 該結(jié)果與陳超[28]及產(chǎn)竹華等[31]的研究趨勢(shì)相同， 從而豐富了芽胞桿菌產(chǎn)酶資源多樣性. 孟凡旭等[32]在阿牙克庫(kù)木湖分離到的嗜鹽菌中未檢測(cè)到纖維素酶和木聚糖酶活性， 本研究發(fā)現(xiàn)了一批能產(chǎn)纖維素酶及木聚糖酶的芽胞桿菌， 它們是蓼屬芽胞桿菌(B.polygoni)、 泰國(guó)纖細(xì)芽胞桿菌(G.thailandensis)和海水芽胞桿菌(B.aquimaris). 由此可見(jiàn)， 青海茶卡鹽湖中蘊(yùn)藏著的嗜鹽堿芽胞桿菌潛藏著較高的產(chǎn)酶能力及豐富的產(chǎn)酶多樣性.

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AnalysisofhalophilicandalkaliphilicBacillusresourcesfromQinghaiChakaSaltLake

WANG Xiaoying1， LIU Guohong2， LIU Bo2， CHEN Zheng2， PAN Zhizhen2， ZHU Yujing2，WANG Jieping2， TANG Jianyang2

(1. College of Biological Science and Technology, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China；2. Agricultural Bio-resource Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian 350003, China)

110 halophilic and alkaliphilicBacillusstrains were isolated and cultured using three medium. Based on 16S rRNA gene similarities and phylogeny analysis, it was indicated that these halophilic and alkaliphilicBacillusstrains belonged to 10 genera including 41 species with 16S rRNA gene 96%～100% similarity to the their closed type strains. The genusBacilluswas the dominant resource in Chaka Salt Lake, which include 25Bacillusspecies including 83 strains. 6 strains may represent the potential new species. From the three enzymes screening, it was showed that approximately 87% strains could produce enzymes, among which 70 strains produced protease, 81 strains produced cellulose and 50 strains produced xylanase. The research indicated that there was not only an abundant diversity ofBacillus, which could produce many kinds of enzymes, but also some potential new microbial species in Qinghai Chaka Salt Lake, which provided basis for reasonable development of halophilic and alkaliphilicBacillusresources.

halophilic and alkaliphilicBacillus; protease; cellulose; xylanase; Qinghai Province； Chaka Salt Lake

10.7631/issn.1000-2243.2017.05.0761

1000-2243(2017)05-0761-09

Q939

A

2016-05-20

劉波(1957- )， 研究員， 主要從事微生物生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)生物藥物研究， fzliubo@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31370059)； 福建省農(nóng)業(yè)科技重大專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2015NZ0003)； 福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程資助項(xiàng)目(FJZZZY-1544)； 福建省種業(yè)創(chuàng)新資助項(xiàng)目“福建芽胞桿菌資源保藏中心”； 福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2016J01129)； 福建省公益資助項(xiàng)目(2015R1018-7)； 青年英才計(jì)劃資助項(xiàng)目(YJRC2015-17)

(責(zé)任編輯： 洪江星)