乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白對腺樣囊性癌細胞株ACC-2生物學行為的影響

孟雪，齊曉宇，劉維賢，王瑤 ，王秋旭

（1. 中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院口腔頜面外科，沈陽 110004； 2. 遼寧省鐵法煤業(yè)集團總醫(yī)院口腔科，遼寧 鐵嶺 112000； 3. 沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院預防獸醫(yī)學教研室，沈陽 110866）

乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白對腺樣囊性癌細胞株ACC-2生物學行為的影響

孟雪1，齊曉宇2，劉維賢1，王瑤3，王秋旭1

（1. 中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院口腔頜面外科，沈陽 110004； 2. 遼寧省鐵法煤業(yè)集團總醫(yī)院口腔科，遼寧 鐵嶺 112000； 3. 沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院預防獸醫(yī)學教研室，沈陽 110866）

目的探討乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白 （HBXIP） 對腺樣囊性癌細胞株ACC-2生物學行為的影響及其機制。方法采用siRNA轉(zhuǎn)染法抑制腺樣囊性癌細胞株ACC-2中HBXIP的表達；實時PCR和Western blotting檢測HBXIP基因及蛋白表達水平；MTT法檢測HBXIP-siRNA對細胞增殖的影響；transwell法檢測HBXIP-siRNA對細胞侵襲的影響；劃痕實驗檢測HBXIP-siRNA對細胞遷移的影響；蛋白印跡方法檢測HBXIP-siRNA對PI3K/Akt信號通路中Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K及對S100A4蛋白表達量的影響。結(jié)果HBXIP在ACC-2中高表達，HBXIP-siRNA成功轉(zhuǎn)染細胞株。MTT結(jié)果顯示，48、72、96 h時實驗組中存活的細胞數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） ；劃痕實驗結(jié)果顯示，實驗組細胞遷移率明顯低于對照組 （P ＜ 0.01） ；transwell小室實驗結(jié)果顯示，實驗組中細胞侵襲個數(shù)明顯低于對照組 （P ＜ 0.01） ；蛋白印跡結(jié)果顯示，相對于對照組，實驗組細胞中p-Akt、p-PI3K及S100A4的表達量隨著HBXIP基因沉默而相對降低。結(jié)論HBXIP可促進腺樣囊性癌細胞株ACC-2增殖、遷移和侵襲，其機制可能與促進Akt、PI3K磷酸化及增加S100A4蛋白表達量有關(guān)。

乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白； 腺樣囊性癌細胞株ACC-2； 唾液腺； 生物學功能； PI3K/Akt信號通路

腺樣囊性癌 （adenoid cystic carcinoma，ACC） 是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，約占所有唾液腺惡性腫瘤的22%［1］，早期即侵犯神經(jīng)和血管，容易發(fā)生遠處肺部轉(zhuǎn)移［2］。目前ACC的治療多采用手術(shù)聯(lián)合放化療，但效果不佳。乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白 （hepatitis B X-interacting protein，HBXIP） 通過與乙肝病毒X （hepatitis B-virus X，HBX） 蛋白C末端特異性結(jié)合降低其活性，從而影響乙肝病毒的復制周期［3-4］。HBX蛋白被認為是一種多功能癌蛋白，既可以激活信號轉(zhuǎn)導通路，又可以直接作用于細胞轉(zhuǎn)錄因子，抑制肝癌細胞凋亡［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)，在唾液腺惡性腫瘤細胞中，HBX的表達水平升高，乙型肝炎病毒與唾液腺惡性腫瘤存在相關(guān)性。目前尚無文獻報道HBXIP與唾液腺ACC的相關(guān)性，因此，本研究擬探討HBXIP對唾液腺ACC細胞株ACC-2［7］增殖、遷移和侵襲功能的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達載體HBXIP-siRNA由沈陽萬類科技有限公司構(gòu)建，ACC-2細胞株購自武漢大學細胞保藏中心。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基 （美國Gibco公司） ，胎牛血清 （美國Hyclone公司） ，Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 （中國BioTeke公司） ，RNA simple Total RNA Kit和總RNA提取試劑盒 （中國TIANGEN公司） ，MTT試劑 （美國Sigma公司） ，NP-40裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PMSF （中國碧云天生物技術(shù)有限公司） ，ECL發(fā)光液 （中國七海復泰生物科技有限公司） 和脂質(zhì)體2000 （美國Invitrogen公司） 。

引物設(shè)計：針對HBXIP的核酸序列 （NM_006402）設(shè)計引物，HBXIP-F，GGAGCAGCACTTGGAAGACA；HBXIP-R，TCAGTGGGGTCAGAGGTTAG。β-actin-F，CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG；β-actin-R，CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT。引物均由沈陽萬類科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞株的培養(yǎng)及傳代：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)ACC-2細胞，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細胞生長至90%融合時傳代，接種密度為1∶3，每2 d傳代1次，最后接種于T25培養(yǎng)瓶中（4×105/瓶） ，待細胞密度達90%，收集細胞。

1.2.2 細胞分組及處理：將ACC-2細胞隨機分為實驗組 （瞬時轉(zhuǎn)染HBXIP-siRNA質(zhì)粒） ，陰性對照組（轉(zhuǎn)染無意義序列，NC組） 和未轉(zhuǎn)染組 （空白細胞） ，后2組為對照組。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine2000說明書，轉(zhuǎn)染前24 h將細胞傳代，待細胞密度至50%～60%，更換為無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理1 h后進行轉(zhuǎn)染。應用電鏡及免疫熒光方法檢測細胞是否轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染48 h后分別收集6孔培養(yǎng)板中各組細胞，進行基因和蛋白的檢測。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄PCR：用Trizol法分別提取3組細胞的總RNA，用SuperM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，以此為模板進行PCR反應。取PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，Gold View染料混勻染色，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照。實驗重復3次，Quantity One軟件分析電泳條帶灰度，比較3組細胞中HBXIP mRNA和蛋白的表達情況。

1.2.4 MTT實驗：轉(zhuǎn)染24 h后，計數(shù)3組細胞并接種于96孔培養(yǎng)板中 （2×103/孔） 。每組設(shè)計5個復孔，同時加入調(diào)零孔 （只加培養(yǎng)基、MTT、DMSO） 。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加入0.2 mg/mL MTT，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清，加入200 μ L DMSO，在酶標儀上測定其在490 nm處OD值。重復5次，取平均值。

1.2.5 劃痕實驗：細胞轉(zhuǎn)染24 h后，計數(shù)3組細胞并接種于6孔培養(yǎng)板中 （2×103/孔） 。每組設(shè)3個復孔，200 μ L槍頭垂直劃痕，加入無血清培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。于劃痕前（ 0 h） 和劃痕后16 h分別照相、測距，重復3次，取平均值。

1.2.6 transwell小室實驗：轉(zhuǎn)染24 h后，計數(shù)實驗組（轉(zhuǎn)染組） 和對照組（ NC組，未轉(zhuǎn)染組） 細胞，用無血清培養(yǎng)液1∶10稀釋，24孔板的transwell小室每個孔鋪100 μ L膠，加入100 μ L細胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，擦去膜上層細胞，將膜取下并進行檢測。實驗重復5次，取平均值。

1.2.7 Western blotting：向3組細胞中加入相應體積的NP-40裂解液，吹散至單細胞懸液，置于冰上靜置5 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，收集上清行定量分析。取40 μ g總蛋白行10%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，室溫培育2 h。加入一抗，4 ℃培育過夜，TTBS洗膜，分別加入驢抗山羊IgG-HRP（ HBXIP） 和羊抗兔IgG-HRP（ Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K及S100A4） ，37 ℃孵 育45 min，TTBS洗膜，應用增強型ECL顯色劑，試劑盒于暗室曝光顯影，實驗均重復3次，掃描膠片，用凝膠圖像處理系統(tǒng)（ Gel-Pro-Analyzer軟件） 分析目標條帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以x-±s表示，組間比較采用Student’s-t檢驗，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組細胞中HBXIP的表達

細胞成功轉(zhuǎn)染48 h后，實時PCR和Western blotting結(jié)果顯示，3組細胞中均可檢測到HBXIP mRNA和蛋白表達，且實驗組表達水平較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.01） ，見圖1、2。

圖1 實時PCR檢測3組中HBXIP基因的表達Fig.1 Expression of the HBXIP gene in experimental and control groups measured via RT-PCR

圖2 蛋白印跡法檢測3組HBXIP蛋白的表達Fig.2 Expression of HBXIP protein in experimental and control groups measured via Western blotting

2.2 siRNA-HBXIP對ACC-2細胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后，實驗組OD值 （0.355±0.062，0.697±0.071，1.020±0.111，1.086±0.122） 低于未轉(zhuǎn)染組 （0.402±0.068，0.907±0.112，1.354±0.138，1.414±0.144） 和 NC 組 （0.407±0.046，0.893±0.092，1.313±0.133，1.363±0.143） 。 在這4個時間點，實驗組細胞增殖率 （100.000±17.359，196.282±19.914，287.211±31.313，305.915±34.506）較對照組降低，在48、72、96 h時差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05） ，見圖3。

圖3 MTT法檢測3組細胞的增殖情況Fig.3 Proliferation of cells in the experimental and control groups measured via MTT method

2.3 siRNA-HBXIP對ACC-2遷移的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，劃痕后16 h，實驗組、NC組和未轉(zhuǎn)染組細胞遷移率分別為 17.00%±2.00%，30.72%±3.37%，33.01%±3.93%，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.01） ，見圖4、5。

圖4 劃痕實驗法檢測16 h時3組細胞的遷移率Fig.4 Migration rate of cells in the experimental and control groups over 16 h measured via the scratch test

2.4 siRNA-HBXIP對ACC-2侵襲能力的影響

transwell檢測結(jié)果提示，觀察24 h后，實驗組、NC組、未轉(zhuǎn)染組細胞侵襲數(shù)分別為45.00±4.64，81.00±9.03，83.60±8.35，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.01）。

2.5 siRNA-HBXIP對PI3K/Akt通路的影響

Western blotting結(jié)果顯示，HBXIP基因沉默后，實驗組HBXIP蛋白的相對表達量 （0.30±0.04） 明顯低于NC組 （0.97±0.02） 和未轉(zhuǎn)染組 （1.00±0.01）。HBXIP 基因沉默后，實驗組中 p-Akt、 p-PI3K和S100A4蛋白的表達降低 （0.64±0.02，0.40±0.01，0.64±0.02） ，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） ，見圖6。

圖5 光鏡下實驗組及對照組遷移情況的比較 ×100Fig.5 Comparison of cell migration patterns between the experimental and control groups under the microscope ×100

圖6 Western blotting法檢測3組細胞中p-Akt、Akt、p-PI3K、PI3K及S100A4蛋白的表達情況Fig.6 Expression of p-Akt，Akt，p-PI3K，PI3K and S100A4 protein in the three groups measured via Western blotting

3 討論

癌基因蛋白HBXIP是一種調(diào)節(jié)蛋白，可在動物肌肉組織以及惡性腫瘤組織中過表達。近年來，也有研究［5］發(fā)現(xiàn)它能與人體多種蛋白結(jié)合。在唾液腺惡性腫瘤細胞中可檢測到HBX的表達，表達陽性率高于對照組，提示乙型肝炎病毒與唾液腺惡性腫瘤存在相關(guān)性［7］。HBXIP還可促進乳腺癌細胞和肝癌細胞的增殖及遷移［8-11］，也能夠刺激Skp2基因啟動子的活性，并通過轉(zhuǎn)錄因子Sp1促進卵巢癌細胞遷移［12］。最新研究［13］發(fā)現(xiàn)，HBXIP過度表達與宮頸癌進展有關(guān)聯(lián)，并可能作為早期診斷宮頸癌的生物標志物。

PI3K/Akt信號通路是新發(fā)現(xiàn)的一條酪氨酸激酶級聯(lián)信號通路，是國內(nèi)外學者公認的癌細胞存活的重要通路，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。該信號通路可以在多種惡性腫瘤中過度活化［14］。有研究［15］發(fā)現(xiàn)HBXIP能誘導HepG2細胞增殖，激活PI3K/Akt信號通路。LIU等［16］發(fā)現(xiàn)過表達HBXIP可激活PI3K/Akt通路，HBXIP可能通過PI3K/Akt通路間接促進S100A4的表達，從而促進乳腺癌細胞的生長和遷移。也有研究［17］發(fā)現(xiàn)，HBXIP可下調(diào)PCK1的表達，通過下調(diào)肝癌細胞轉(zhuǎn)錄因子FOXO1和上調(diào)miR-135a，抑制靶向細胞中FOXO1 mRNA的3’UTR端，通過激活PI3K/Akt通路FOXO1蛋白的磷酸化水平，導致該蛋白從細胞核向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。

本研究組在前期實驗中對ACC細胞ACC-2中HBXIP蛋白的表達情況進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其在ACC-2中有較多表達，為進一步闡明HBXIP對ACC細胞株ACC-2的影響，選擇對HBXIP基因沉默，并研究其對ACC-2增殖、遷移和侵襲以及PI3K/Akt信號通路的影響。

RNA干涉 （RNA intergerence，RNAi） 是指在進化過程中高度保守的、雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，它能誘導序列特異的目標基因沉默，是由FIRE等［18］于1998年發(fā)現(xiàn)的迄今最有效的封閉基因表達方法之一。siRNA是RNAi途徑的中間產(chǎn)物，在RNA沉默通路中起核心作用，因此，本研究中構(gòu)建了siRNA-HBXIP真核表達載體。本研究結(jié)果顯示，HBXIP基因沉默能夠抑制ACC細胞株ACC-2的增殖、遷移和侵襲，并有可能是通過抑制S100A4蛋白的表達及PI3K和Akt磷酸化來實現(xiàn)的。本研究中所用HBXIP抑制劑有可能成為有效的化療藥物，其可能的機制是通過下調(diào)PI3K/Akt信號通路PI3K和Akt靶點蛋白的磷酸化和S100A4的蛋白表達，從而抑制唾液腺細胞的惡性轉(zhuǎn)化，同時抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。

總之，HBXIP可能通過激活PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白，在ACC細胞株ACC-2的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用，有關(guān)具體途徑和機制有待進一步研究。

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Effect of HBXIP Expression on the Biological Behavior of the Adenoid Cystic Carcinoma Cell Line ACC-2

MENG Xue1，QI Xiaoyu2，LIU Weixian1，WANG Yao3，WANG Qiuxu1
（1. Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China； 2. Department of Stomatology，Liaoning Province Tiefa Coal Group General Hospital，Tieling 112000，China； 3. Teaching & Research Section of Preventive Veterinary Medicine，College of Animal Science & Veterinary Medicine，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

ObjectiveTo study the effect of hepatitis B virus X-interacting protein （HBXIP） on the proliferation，migration，and invasion of ACC-2 cells，and the possible mechanism of the PI3K/Akt signaling pathway involved.MethodsThe chemically synthesized HBXIP-siRNA plasmid was transfected into the ACC-2 cells. RT-PCR and Western blotting were performed to detect the expression of HBXIP in the ACC-2 cells. Cell proliferation was measured via MTT assay. The invasive and migratory abilities of the ACC-2 cells were evaluated via the transwell chamber assay and scratch test，respectively. Western blotting also detected the impact of HBXIP-siRNA on Akt，p-Akt，PI3K，p-PI3K，and S100A4 protein expression.ResultsHBXIP was highly expressed and HBXIP-siRNA was successfully transfected in ACC-2 cells. MTT results showed that the number of surviving cells in the experimental group was significantly lower than that in the control group （P ＜ 0.05） . The scratch test results showed that the mobility of the experimental group was significantly lower than that of the control group （P ＜ 0.01） . The transwell assay showed that the rate of cell invasion of the experimental group was significantly lower than that of the control group （P ＜ 0.01） . Finally，Western blotting results revealed that the expression of p-Akt，p-PI3K，and S100A4 was relatively decreased in the experimental group when compared to that in the control group.ConclusionSilencing the HBXIP gene inhibited ACC-2 proliferation，invasion，and migration.

hepatitis B X-interacting protein； ACC-2 cell line； salivary gland； biological functions； PI3K/Akt signaling pathway

R782.7

A

0258-4646 （2017） 12-1082-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171130.1805.012.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.12.006

遼寧省科學技術(shù)計劃 （2011010215-404）

孟雪 （1986-） ，女，醫(yī)師，碩士.

王秋旭，E-mail：wangqx@sj-hospital.org

2017-03-31

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-11-30 18:05

（編輯 王又冬）