表達(dá)人源SOD的畢赤酵母重組子的構(gòu)建

李新鳴，孫冶 ，肖純凌

（1. 沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽 110034； 2. 遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110034）

表達(dá)人源SOD的畢赤酵母重組子的構(gòu)建

李新鳴1，2，孫冶1，2，肖純凌2

（1. 沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽 110034； 2. 遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110034）

目的研究在畢赤酵母重組子中高表達(dá)有活性人源超氧化物歧化酶 （SOD） 方法。方法在畢赤酵母構(gòu)建表達(dá)重組人源SOD，對培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基中銅離子濃度和甲醇誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，并初步純化SOD。結(jié)果獲得了5個穩(wěn)定表達(dá)人源SOD的畢赤酵母重組子。色譜層析方法分離純化重組子培養(yǎng)上清中的SOD。在培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)基中銅離子濃度0.5%、甲醇誘導(dǎo)濃度1%時上清中SOD分泌量多，同時活力最好。結(jié)論建立畢赤酵母表達(dá)可溶性人源SOD的有效方法，實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母系統(tǒng)高效表達(dá)有活性人源SOD。為發(fā)酵生產(chǎn)人源SOD提供了研究基礎(chǔ)。

畢赤酵母； 重組子； 人源超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 是一種能夠催化有害的超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫的酶。1938年MANN和KEILIN［1］首次從牛紅細(xì)胞中分離出一種藍(lán)色的含銅蛋白質(zhì)，直到1969年MCCORD及FRIDOVICH［2］發(fā)現(xiàn)該蛋白有發(fā)生歧化反應(yīng)的功能。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布在動物、植物、微生物等體內(nèi)。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，它能夠平衡機(jī)體的氧自由基，從而避免體內(nèi)超氧陰離子自由基濃度過高時引起的不良反應(yīng)［2-3］?，F(xiàn)代生活壓力、環(huán)境污染、各種輻射和超量運(yùn)動都會造成氧自由基大量形成?，F(xiàn)已證實(shí)，由氧自由基引發(fā)的疾病多達(dá)60多種［3-5］。SOD可對抗與阻斷氧自由基對細(xì)胞造成的損害，及時修復(fù)受損細(xì)胞，是一種很有用途的藥用酶。

SOD根據(jù)含金屬輔基的不同分為3種：Cu，Zn-SOD，Mn-SOD和Fe-SOD。哺乳類動物體內(nèi)僅含有Cu，Zn-SOD與Mn-SOD。由于Cu，Zn-SOD的穩(wěn)定性高于Mn-SOD，并且在哺乳動物中含量遠(yuǎn)高于Mn-SOD，因此Cu，Zn-SOD在臨床應(yīng)用上更受重視［6-7］。SOD的獲得方法有3種：動物血、植物和基因工程菌中提取。從動物血液中可以大規(guī)模提取SOD，但是原材料有限，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，產(chǎn)品活力純度較低，而且動物源血液制品風(fēng)險大，容易造成環(huán)境污染及安全性問題。從植物提取資源充足，不污染環(huán)境，但缺點(diǎn)是提取率較低、耗費(fèi)大。同時來源于動植物的SOD均存在免疫原性等安全隱患。歐洲已從1999年禁止動物源性SOD用于人類［8］。從基因工程菌中獲得重組人源SOD則可以克服上述缺點(diǎn)。美國、日本及一些西歐國家已開發(fā)重組人源SOD藥物，有的研究已經(jīng)進(jìn)行了Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗(yàn)［9-10］。 我國除開展直接從人血中提取SOD外，近年來也開展重組人源SOD的研究，包括在大腸桿菌、釀酒酵母、昆蟲細(xì)胞、馬鈴薯中表達(dá)重組SOD［11-13］?，F(xiàn)有國內(nèi)市場上使用的SOD基本是動物血中提取的，而且天然來源的SOD穩(wěn)定性差。采用基因重組法生產(chǎn)人源SOD不僅可以降低其他來源SOD導(dǎo)致的免疫原性等安全問題，還可以解決人源SOD的來源有限問題。本研究利用基因工程技術(shù)，在畢赤酵母 （Pichia pastoris，P. pastoris）系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)重組人源SOD，獲得純化、有活性的人源SOD；同時通過優(yōu)化在P. pastoris培養(yǎng)上清液中大量獲得可溶性人源SOD。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

超微量紫外可見光分光光度計、軌道式搖床（美國Termo公司） ；全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（Tanon 2500R） ；細(xì)菌搖床（ 蘇州威爾公司） ；Whatman 3 MM濾紙（ Whatman 公司） ；硝酸纖維素膜（ 北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心） ；Wstern blotting 試劑盒ECL系統(tǒng)（ 美國solarbio公司） ；Rabbit Anti-SOD 單克隆抗體（ 南京凱基生物公司） ；BMGY培養(yǎng)基（ 酵母粉1.0 g，蛋白胨2.0 g，YNB培養(yǎng)基1.34 g，0.1 mol/L pH6.0磷酸緩沖液，甘油1.0 mL，加蒸餾水到100 mL YP培養(yǎng)基） ；YNB培養(yǎng)基、YP瓊脂培養(yǎng)基（ 青島海博生物公司） ；瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖（ 南京生興生物公司） ；甲醇（ 沈陽國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；10×CIP緩沖液、酚/氯仿、3 mol/L乙酸鈉、100%乙醇、80%乙 醇、Geneticin?抗 生 素、人 銅 鋅SOD（ Cu，Zn-SOD）酶聯(lián)免疫分析（ ELISA） 試劑盒。P. pastoris X33 /pPICZαA系統(tǒng)。Geneticin?抗生素（ 美國Gibco 公司）；人銅鋅SOD（ Cu，Zn-SOD） 酶聯(lián)免疫分析（ ELISA） 試劑盒（ 南京凱基生物公司） 。

1.2 P. pastoris系統(tǒng)表達(dá)重組人源SOD構(gòu)建

1.2.1 pPICZa-Cu，Zn-SOD重組質(zhì)粒構(gòu)建：對照GeneBank查找獲得人源Cu，Zn-SOD基因序列，選擇酵母菌喜好的密碼子，優(yōu)化人源SOD基因DNA序列，PCR擴(kuò)增合成可翻譯人源Cu，Zn-SOD的基因片段。按照pPICZa載體試劑盒說明，將合成SOD基因片段連接到載體上，并完成pPICZa-Cu，Zn-SOD重組質(zhì)粒構(gòu)建及陽性克隆篩選；于-20 ℃保持重組質(zhì)粒備用。

1.2.2 P. pastoris X33/ pPICZa-Cu，Zn-SOD重組子構(gòu)建及篩選：按照pPICZa載體試劑盒說明，完成pPICZa-Cu，Zn-SOD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，挑選轉(zhuǎn)化菌株提取基因組DNA，PCR特異性擴(kuò)增SOD基因片段，篩選出整合有SOD基因的P. pastoris X33轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)上清，Western blotting檢測分泌表達(dá)可溶性SOD產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化菌克隆株，選擇分泌表達(dá)SOD較高的克隆株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 P. pastoris重組子穩(wěn)定性測定：將上述篩選獲得P. pastoris X33/ pPICZa-Cu，Zn-SOD陽性克隆株培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清液經(jīng) Western blotting分析目的蛋白表達(dá)，將上述篩選獲得的陽性克隆株連續(xù)傳代30代，每傳代10次分別提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增鑒定轉(zhuǎn)化酵母菌株基因組是否穩(wěn)定整合SOD基因。

1.3 重組人源SOD的純化及活性檢測

離子交換柱層析Phenyl-HP Column純化目的蛋白重組人源SOD。 樣品，100 mL P.pastoris X33/pPICZa-SOD陽性克隆培養(yǎng)上清液；平衡緩沖液，20 mmol/L 磷 酸 鹽 緩 沖 液（ phosphate buffer，PB） ，3 mol/L（ NH4）2SO4，pH 7.4；洗脫液，20 mmol/L PB，2.5 mol/L、2 mol/L、1.5 mol/L、1 mol/L、0.5 mol/L 梯度（NH4）2SO4，pH 7.4。純化產(chǎn)物總SOD經(jīng)ELISA試劑盒檢測。

1.4 P. pastoris系統(tǒng)表達(dá)重組人源SOD優(yōu)化

1.4.1 P. pastoris種子液制備：挑取單菌落于裝有100 mL BMGY培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、220 r/min離心培養(yǎng)24 h，備用。

1.4.2 不同濃度甲醇下P. pastoris重組子表達(dá)SOD活力測定：在各重組P. pastoris克隆株分泌表達(dá)SOD過程中，分別在其培養(yǎng)液中添加甲醇至終濃度分別為0.5%、1%、2%，于30 ℃、225 r/min離心培養(yǎng)48 h，測定SOD活力。

1.4.3 不同時間各濃度銅離子處理P. pastoris重組子表達(dá)SOD活力測定：在各重組P. pastoris克隆株分泌表達(dá)SOD過程中，分別在其培養(yǎng)液中添加硫酸銅至終濃度分別為0%、0.2%、0.5%、1%，于30 ℃、225 r/min離心培養(yǎng)24、48 、72 h，測定SOD活力。各培養(yǎng)基于30 ℃ 170 r/min過夜培養(yǎng)至對數(shù)期。

1.4.4 P. pastoris重組子表達(dá)SOD的Western blotting測定：將P. pastoris發(fā)酵液上清20 μ L與5×樣品緩沖液（ 20 μ L＋5 μ L） 在Eppendorf管中混合。放入100 ℃加熱 5～10 min，提取總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h后，一抗為鼠抗人SOD抗體，二抗為辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗鼠抗體（ 1∶5 000） ，ECL顯色液處理，成像目的條帶。

1.5 SOD活力測定

1.5.1 SOD標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為72、48、24、12、6 U/mL，重復(fù)3次，于450 nm 波長依序測量各孔的吸光度 （optical density，OD）值。

1.5.2 樣品SOD活力測定：分別設(shè)空白孔和待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中加樣品稀釋（稀釋5倍） ，37 ℃溫育30 min，滌液靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5 次，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μ L （空白孔除外） ，溫育30 min，加入顯色劑A50 μ L，加入終止液終止。450 nm 波長依序測量各孔OD 值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

SOD活力標(biāo)測定的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線建立采用最小二乘法，線性方程檢驗(yàn)方法采用線性回歸方程的方差分析。不同濃度甲醇誘導(dǎo)下對6株不同重組子P. pastoris表達(dá)SOD活力差異采用單因素方差分析，不同時間、不同濃度銅離子處理重組P. pastoris表達(dá)SOD活力差異的檢驗(yàn)采用重復(fù)測量資料的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 P. pastoris系統(tǒng)表達(dá)重組人源SOD構(gòu)建

選擇酵母菌喜好的密碼子，優(yōu)化人源SOD基因DNA序列；完成人SOD基因-pPICZa載體構(gòu)建及陽性克隆篩選；目前保存有pPICZa-Cu，Zn-SOD重組質(zhì)粒。完成pPICZa-Cu，Zn-SOD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并整合到P. pastoris X33基因組；篩選獲得重組子陽性克隆6株，PCR擴(kuò)增鑒定轉(zhuǎn)化酵母菌株基因組整合有SOD基因 （圖1） ，保存其中5個整合有SOD基因的重組P. pastoris克隆株。隨機(jī)挑取3個克隆株，經(jīng)Western blotting測定表達(dá)人源SOD （圖2） 。

2.2 P. pastoris重組子穩(wěn)定性測定

圖1 PCR擴(kuò)增鑒定P.Pastoris X33/ pPICZa-Cu，Zn-SOD陽性克隆Fig.1 Identification of P. pastoris X33/pPICZa-Cu，Zn-SOD-positive clones by PCR amplification

圖2 P. pastoris X33/ pPICZa-SOD陽性克隆上清中SOD表達(dá)Fig.2 Expression of SOD in culture supernatants of P. pastoris X33/pPICZa-SOD-positive clones

測定2、4、5# 3個克隆，培養(yǎng)傳代后是否能維持基因組整合人SOD基因的穩(wěn)定。在YPD平板上連續(xù)傳代30代，分別取單菌落，提取酵母菌基因組DNA，PCR均可擴(kuò)增出人SOD基因片段，測定其DNA序列，證實(shí)該3個克隆株能穩(wěn)定攜帶SOD基因。見圖3。

2.3 重組人源SOD的純化及其活性測定

圖3 P. pastoris重組子穩(wěn)定性測定Fig.3 Stable insertion of the SOD gene in P. pastoris recombinants

結(jié)果顯示，有效純化來自于P. pastoris培養(yǎng)上清液中表達(dá)的人源SOD蛋白。純化的SOD蛋白保持活性，為295 U/mg，洗脫峰的電泳結(jié)果見圖4、圖5。

2.4 P. pastoris系統(tǒng)表達(dá)重組人源SOD的優(yōu)化

圖4 Phenyl-HP 柱層析純化培養(yǎng)上清液中SOD分析Fig.4 Analysis of SOD in culture supernatants by Phenyl-HP column chromatography

選取2#、4#、5# 3個克隆株，相同甲醇濃度 （1%）誘導(dǎo)和相同培養(yǎng)溫度（30 ℃），于不同培養(yǎng)時間取培養(yǎng)上清測定SOD表達(dá)。3個克隆株呈現(xiàn)不同的SOD表達(dá)動態(tài)變化。2#和4#克隆株在培養(yǎng)48 h后，上清中SOD表達(dá)增多。見圖6。

2.5 SOD標(biāo)準(zhǔn)品曲線確定

將不同酶活力的SOD標(biāo)準(zhǔn)品及各濃度下測得的OD值，做線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得SOD酶活力與吸光度值線性關(guān)系，見圖7。

2.6 不同濃度甲醇誘導(dǎo)P. pastoris表達(dá)SOD活力測定

改變甲醇的誘導(dǎo)濃度，對5株P(guān). pastoris重組克隆株表達(dá)SOD酶活力的影響明顯不同。4#克隆株對甲醇誘導(dǎo)濃度變化敏感，當(dāng)甲醇增加至1%濃度時，培養(yǎng)上清中表達(dá)SOD活力明顯提高，可達(dá)12 U/mL，顯著高于其他誘導(dǎo)濃度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（ P ＜0.05） ，見圖8。

2.7 不同時間各濃度銅離子處理P. pastoris表達(dá)SOD活力測定

在1%甲醇誘導(dǎo)條件下，進(jìn)一步優(yōu)化4#克隆株表達(dá)高活力SOD的培養(yǎng)條件。在發(fā)酵培養(yǎng)基中存在低濃度Cu2（+0%和0.2%） 和高濃度的Cu2（+1%） 時，均不影響表達(dá)SOD的酶活力；而在中濃度Cu2+（ 0.5%） 條件下可以顯著提高表達(dá)的SOD酶活力（ P ＜ 0.05） 。

圖5 純化的SOD產(chǎn)物15% SDS-PAGE分析Fig.5 Analysis of purified SOD products using 15% SDS-PAGE

圖6 不同培養(yǎng)時間不同克隆株SOD表達(dá)動態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes in secretion of SOD expressed in P. pastoris recombinants at different times during culture

圖7 SOD標(biāo)準(zhǔn)品曲線Fig.7 SOD standard curve

此外，在低、中濃度Cu2+作用下，隨著發(fā)酵時間的持續(xù)，4#克隆株表達(dá)SOD活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵時間48 h時表達(dá)SOD活力達(dá)到最大值，為18.1 U/mL。但是，在高濃度Cu2+作用下，隨著發(fā)酵時間的持續(xù)，4#克隆株表達(dá)的SOD活力呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，在發(fā)酵24 h時，SOD活力最大，為18.3 U/mL。見圖9。

3 討論

目前國內(nèi)多報道利用大腸桿菌，釀酒酵母克隆來表達(dá)人Cu，Zn-SOD［12-13］。大腸桿菌由于是原核生物不能正確折疊成天然的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且表達(dá)產(chǎn)物多為非分泌表達(dá)的SOD，需要復(fù)性等方法才可以得到有活性的目的蛋白。而且背景雜蛋白較多，純化比較麻煩，以及存在內(nèi)毒素難以去除等弊端［14］。釀酒酵母是真核生物，可以正確折疊和加工蛋白質(zhì)，可分泌SOD到培養(yǎng)基中，還可以克服大腸桿菌系統(tǒng)可能導(dǎo)致的內(nèi)毒素污染問題。但是釀酒酵母分泌效率低；大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)時，產(chǎn)生的乙醇會影響菌體本身生長，難以進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)［12-13，15］。

圖8 不同濃度甲醇下誘導(dǎo)P. pastoris重組子表達(dá)SOD活力Fig.8 Activity of SOD expressed in P. pastoris recombinants using different concentrations of methanol for induction

圖9 不同時間內(nèi)各濃度銅離子處理P. pastoris重組子表達(dá)SOD活力Fig.9 Activity of SOD expressed in P. pastoris recombinants treated with copper ions at different incubation times

P. pastoris表達(dá)系統(tǒng)自建立以來，很多在其他系統(tǒng)難以表達(dá)的蛋白都在此得到了表達(dá)［16-17］。表達(dá)外源蛋白方面的優(yōu)勢是：表達(dá)系統(tǒng)安全無毒、不致??；高表達(dá)，表達(dá)水平在毫克級，比其他系統(tǒng)高出10～100倍；穩(wěn)定性高，整合的外源蛋白基因不易丟失；高分泌性；外源蛋白可進(jìn)行多種修飾加工，更接近自然結(jié)構(gòu)；該表達(dá)系統(tǒng)可以進(jìn)行高密度發(fā)酵，產(chǎn)品容易純化［17］。本研究利用基因工程技術(shù)，在P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)重組人源SOD，并獲得了5個穩(wěn)定整合SOD基因并表達(dá)分泌型SOD的克隆株。

通過對培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基中銅離子濃度和甲醇誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，探討了P.pastoris表達(dá)人源Cu，Zn-SOD的有效方法。本研究中發(fā)現(xiàn)2#和4#克隆株培養(yǎng)48 h以后，發(fā)酵液上清中SOD含量開始增多，大量表達(dá)可溶性SOD。因?yàn)榧纫ＷC目的蛋白SOD在P. pastoris重組子的培養(yǎng)上清中有較高表達(dá)量，又需要表達(dá)的SOD維持較高的酶活力，才能發(fā)揮其抗氧化生物活性作用。因此，選取培養(yǎng)時間為48 h，通過不同濃度甲醇誘導(dǎo)SOD表達(dá)，不同的克隆株經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的SOD活力明顯不同。4#克隆株對甲醇誘導(dǎo)敏感，經(jīng)1%甲醇誘導(dǎo)可表達(dá)高活力的可溶性SOD，表達(dá)的活力較其他條件所表達(dá)的活力顯著增加。選取4#克隆株進(jìn)一步優(yōu)化，因?yàn)殂~離子是Cu，Zn-SOD具有抗氧化酶活力重要的因素，所以在培養(yǎng)液中添加不同濃度銅離子來檢測SOD活力。銅離子濃度為0%～1.0%，隨著時間增加SOD活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，然而在高濃度銅離子條件下，隨著時間的增加SOD活力呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。通過對培養(yǎng)條件優(yōu)化，明確了在培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)基中銅離子濃度為0.5%、甲醇誘導(dǎo)濃度1%時上清發(fā)酵液SOD分泌量多，同時活力最好。

綜上所述，本研究利用基因工程獲得有活性人源SOD，實(shí)現(xiàn)在P. pastoris系統(tǒng)高表達(dá)重組人源SOD，并通過優(yōu)化培養(yǎng)條件提高SOD活力，為其規(guī)?；a(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。同時，通過色譜層析方法，初步獲得了重組人源Cu，Zn-SOD的簡便、有效的分離純化方法，可以用于制備高純度、有活性的重組人源Cu，Zn-SOD。

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Construction of Recombinant Pichia pastoris Expressing Human SOD

LI Xinming1，2，SUN Ye1，2，XIAO Chunling2
（1. Department of Pathogenic Biology，College of Basic Medical Sciences，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China； 2. Liaoning Province Key Lab of Environment Pollution and Microecology，Shenyang 110034，China）

ObjectiveTo optimize the expression of active human Cu，Zn-superoxide dismutase （SOD） in recombinant Pichia pastoris（P.pastoris）.MethodsA recombinant human SOD expression construct was generated and expressed in P. pastoris. The culture time，concentration of copper ions in the medium，and conditions for methanol induction were optimized，and SOD was preliminarily purified.ResultsFive P. pastoris recombinants that stably expressed human SOD were obtained. SOD could be purified from the culture supernatants of the recombinant strains by chromatography. The amount of SOD secreted into the supernatant was high with optimal activity，when the incubation time was 48 h，copper ion concentration in the medium was 0.5%，and methanol concentration was 1%.ConclusionAn effective method for the expression of soluble human Cu，Zn-SOD in P. pastoris was established，and the enzyme produced using this method exhibited high activity. This method provides a foundation for further research on the production of human SOD by fermentation.

Pichia pastoris； recombinant； human superoxide dismutase

Q93-335

B

0258-4646 （2017） 12-1117-07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171130.1810.024.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.12.013

沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃 （F15-199-1-29）

李新鳴 （1973-） ，女，副教授，博士.

肖純凌，E-mail：xiaochunling@symc.edu.cn

2017-07-06

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-11-30 18:10

（編輯 武玉欣）