兔膝骨性關節(jié)炎模型關節(jié)液中IL-1、IL-6及TNF-ɑ水平的影響研究

黃飛麒 陳燕梅 趙 曉 姚乃捷 陳揚生 林 展

(廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院正骨科，廣東 廣州 510080)

兔膝骨性關節(jié)炎模型關節(jié)液中IL-1、IL-6及TNF-ɑ水平的影響研究

黃飛麒 陳燕梅 趙 曉 姚乃捷 陳揚生 林 展

(廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院正骨科，廣東 廣州 510080)

目的 探究兔膝骨性關節(jié)炎模型中鹽酸氨基葡萄糖對IL-1、IL-6及TNF-ɑ濃度的影響。方法 選擇成年雄性兔20只，分為OTL組(A組)與對照組(B組)各10只。兩組分別制備膝骨性關節(jié)炎模型，B組按常規(guī)飲食，A組于制模成功后每日喂食鹽酸氨基葡萄糖。收集兩組右膝關節(jié)液檢測其中IL-1、IL-6及TNF-ɑ水平。結果 A組與B組治療前各項炎性因子水平對比，差異均不顯著(P>0.05)。經(jīng)治療后A組膝關節(jié)液中炎性因子測定濃度均降低，對比可知統(tǒng)計意義顯著(P<0.05)。結論 OTL可抑制兔膝關節(jié)液中IL-1、IL-6及TNF-ɑ的含量升高，進而緩解骨性病變與關節(jié)損傷。

膝骨性關節(jié)炎；IL-1；IL-6；TNF-ɑ

膝骨性關節(jié)炎(KOA)為退行性骨關節(jié)病變，中老年人群多發(fā)。該病早期表現(xiàn)為反復關節(jié)腫脹，病情進展可出現(xiàn)關節(jié)畸形或功能喪失。KOA不同發(fā)病期病理表現(xiàn)存在差異，與免疫因素、傷口等均存在關系。對于KOA的發(fā)病機理尚不明確，但是證實與炎性因子有關[1]。其中在KOA發(fā)病中發(fā)揮關鍵介導作用的因子中，被發(fā)現(xiàn)的有白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-ɑ)等。KOA早期多采用藥物作為主要治療方式，而中期需輔助手術。非甾體抗炎藥為早期常用藥，能夠對PGE生成進行抑制，達到緩解疼痛、消炎的目的，但是長期服用存在副反應。鹽酸氨基葡萄糖(OTL)被西方作為KOA的常規(guī)治療藥物，但是在我國的應用卻存在一些爭議。本次研究擬構建兔膝骨性關節(jié)炎模型，探究OTL對關節(jié)液中IL-1、IL-6、TNF-ɑ濃度的作用機制，現(xiàn)將實驗及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料

選擇20只月齡在3.2～4.3月之間的健康雄性成年大白兔，體重1.9～2.4 kg。實驗試劑：鹽酸氨基葡萄糖(240 mg/粒)、兔IL-1、IL-6與TNF-ɑ試劑盒。實驗儀器包括酶標儀、離心機、Na2S以及相關手術器械。

1.2方法

1.2.1分組與制模 隨機分為A、B兩組，各為10只。應用硫化鈉將所有兔右膝部位的毛脫去，經(jīng)耳緣靜脈注射濃度為3%的麻醉藥物，綁敷于手術臺上，依據(jù)Hulth法制備KOA模型。沿兔髕骨正中線切開約3 cm，露出股四頭肌與髕骨韌帶，將髕骨外翻，牽拉屈曲露出半月板，切開交叉韌帶去除半月板。制模術中避免損傷周圍軟骨、神經(jīng)與血管。抽屜實驗檢查呈陽性，則可清洗縫合切口。制模手術后抽取右膝關節(jié)沖洗液待測，并在術后三天內給予抗感染治療。術后B組給予標準兔飼料定時喂養(yǎng)，A組于術后第二天在常規(guī)飲食的基礎上給予適量OTL(80 mg/kg)，連續(xù)喂食兩個月。于傷口愈合后每日兩次驅趕實驗兔行走，每次至少30 min。

1.2.2IL-1、IL-6、TNF-ɑ水平測定 喂養(yǎng)兩個月后將所有實驗兔通過空氣栓塞處死，將脛腓骨至股骨下三分之一骨端切除，修正右膝關節(jié)周圍組織，維持關節(jié)囊不受損，于髕上關節(jié)囊切開約0.5 cm，將1 ml蒸餾水注入右膝關節(jié)中，屈曲活動右膝關節(jié)，待混合均勻后抽取關節(jié)液約5 ml置入試管中。后離心，轉速4500 r/min。取上層液置入冰柜內保存待用。采用酶聯(lián)免疫吸附法，依據(jù)試劑盒說明分別測定各種炎性因子的含量。方法：于酶標板上設置十個標準孔，加入樣品進行稀釋，混合均勻。預留空白孔、待測孔，將稀釋液加入標準孔中稀釋至五倍。于溫育箱中設置37 ℃培育30 min，使用稀釋洗滌液對樣品進行洗滌，反復五次。后加入酶標測試劑，重復以上步驟。每個孔中分別加入顯色劑，輕微震蕩搖勻，加入適量終止液，待顏色變化停止。以空白孔為基準，以波長為500 nm測定每孔中液體的OD值，繪制相應的坐標曲線，進而測定樣品中炎性因子的濃度。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1A、B兩組右膝關節(jié)液中治療前各項炎性因子含量對比

制模成功后兩組均測出IL-1、IL-6與TNF-ɑ，提示與骨性關節(jié)炎進展存在關系。A組與B組各項炎性因子測定水平比較，差異均不顯著(P>0.05)。見表1。

表1 A、B兩組實驗前各項炎性因子水平比較

2.2A、B兩組治療后右膝關節(jié)液中IL-1、IL-6與TNF-ɑ含量對比

經(jīng)過兩個月喂養(yǎng)給藥，A組關節(jié)液中IL-1、IL-6與TNF-ɑ測定水平，與B組比較各項均下降明顯(P<0.05)。見表2。

表2 A、B兩組治療后各項炎性因子水平比較

3 討 論

3.1KOA模型可行性分析

KOA模型的制備是分析KOA病理學因素的輔助工具，在探究治療法方面也發(fā)揮著關鍵作用。兔膝關節(jié)解剖結構與人體類似，故選用。實驗中切斷兔膝關節(jié)內側半月板、交叉韌帶，導致膝關節(jié)穩(wěn)定性喪失，下肢無法對抗正常應力，加之缺少緩沖保護，很容易加重關節(jié)損傷。且兔KOA模型的各項生化指標與人體基本一致，故依據(jù)Hulth法開展實驗是可行的。此外，試驗中全部選擇雄性兔，排除了性激素對結果的干擾。實驗中通過肉眼觀察，均提示模型制備成功。

3.2IL-1、IL-6、TNF-ɑ在KOA中的作用

KOA發(fā)病機制復雜，多認為存在力學、生化因素共同作用，導致膝軟骨細胞降解失衡有關。研究表明，KOA中各類炎性因子發(fā)揮的作用不可小覷[2]。其中部分蛋白質因子能夠促使膝軟骨細胞外基質代謝失衡，進而導致膝關節(jié)發(fā)生退行性改變，如IL-1、TNF-ɑ等。在膝軟骨修復期，關節(jié)液中IL-1、IL-6、TNF-ɑ等水平與炎癥程度存在正相關性[3]。提示其與膝軟骨的損傷存在相關性，且IL-1、IL-6與TNF-ɑ之間具備促進性[4]。膝關節(jié)軟骨的組成包括軟骨細胞與大部分基質，其中基質中富含膠原纖維，在軟骨抵抗張力、傳導應力方面發(fā)揮的作用十分顯著，且可維持正常的細胞形態(tài)。IL-1可誘導膝軟骨細胞生成NO，加快細胞凋亡速度，并產生參與炎性反應的PGE2[5]。IL-1也可與TNF-ɑ協(xié)同誘導血漿酶原生成，進而改變外基質結構，加重骨質炎癥反應。IL-6在軟骨病變全程中均存在，且可加快基質、纖維細胞降解，進一步破壞膝軟骨[6]。

3.3將OTL應用于KOA中的機理

當前KOA早期治療藥物的作用分為兩類，即改善炎癥與延緩病情。前者包括糖皮質激素等，短期應用能夠有效緩解病痛，但副作用明顯[7]。后者主要為氨基葡糖糖等，口服后可生成酸根離子與游離葡萄糖，并在血液循環(huán)的作用下進入不同組織中。這類藥物作用于KOA的機制一是延緩軟骨被破壞，二是促進基質合成。OTL進入人體后可擴散至軟骨細胞中，和促進蛋白多糖生成，進而與軟骨基質作用形成彈性結構，發(fā)揮抵抗關節(jié)應力、避免骨質受損的作用。同時OTL可激活IL-1受體，使其與IL-1相互抑制競爭，破壞IL-1的調控機制。實驗表明，OTL分解生成的酸根離子，也可為骨細胞營養(yǎng)生成創(chuàng)造條件，進而調控細胞蛋白多糖的合成。KOA引發(fā)的副作用小，胃部不適的發(fā)病率不到4.5%。部分研究也表明，其對于人體糖代謝、胰島素代謝未造成影響[8]。

本次實驗表明，OTL對于延緩KOA病情有一定的效果，對關節(jié)液中IL-1、IL-6及TNF-ɑ的生成存在抑制作用，為臨床治療提供了重要依據(jù)。

[1] 武敏,黃傳兵.骨關節(jié)炎的中醫(yī)藥治療研究進展[J].世界中西醫(yī)結合雜志,2013,8(9):964-966.

[2] 方策,宋德為,劉元祿.健骨活血丸對骨性關節(jié)炎模型兔關節(jié)液和血清中TNF-ɑ表達的影響[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志,2013,21(5):12-14.

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The rabbit model of knee osteoarthritis in the joint fluid, IL-6 and IL-1 the level of TNF-ɑ impact study

HUANGFei-qiCHENYan-meiZHAOXiaoYAONai-jieCHENYang-shengLINZhan

(Dept.of Orthopedics,First Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Guangzhou 510080,China)

Objective:Glucosamine hydrochloride on the rabbit model of knee osteoarthritis in the joint fluid, IL-6 and IL-1 the influence of the level of TNF-ɑ.Methods:Select 20 adult white rabbit, divided into OTL group (group A) and control group (group B) 10. Preparation of knee osteoarthritis models respectively in both groups, group B according to the normal diet, after the success of the group A in moulding the daily feeding glucosamine hydrochloride, two months after the contrast analysis of two groups of bilateral knee joint X-ray images.Collect were measured in two groups of right knee joint fluid, IL-6 and IL-1 level of TNF-ɑ.Results:Group A and group B before treatment of various inflammatory factors level comparison, no significant difference (P>0.05).After treatment group A decrease in the determination of inflammatory factor in knee joint fluid level, contrast there were significant differences(P<0.05).Conclusion:OTL inhibits the rabbit knee joint fluid, IL-6 and IL-1 the content of TNF-ɑ rise, thereby alleviating the bony lesions and joint damage.

knee osteoarthritis;IL-1;IL-6;TNF-ɑ

建設中醫(yī)藥強省立項資助科研課題(No:20151271)。

黃飛麒(1980—)，男，副主任中醫(yī)師，在讀博士，主要從事中醫(yī)骨傷科方面的研究。

R684

A

1004-7115(2017)12-1364-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.014

2017-10-09)