酸性染料比色法測定半枝蓮中總生物堿的含量

邵 蘭 趙其第 費(fèi)洪榮

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271016)

酸性染料比色法測定半枝蓮中總生物堿的含量

邵 蘭 趙其第 費(fèi)洪榮

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271016)

目的 建立半枝蓮中總生物堿含量的測定方法。方法 以鹽酸小檗堿為對照品，酸性染料作顯色劑，采用紫外分光光度法測定半枝蓮中總生物堿的含量。結(jié)果 酸性染料法的顯色條件為加pH 3.5緩沖液至5 ml，加溴甲酚綠5 ml，充分振搖15 min，氯仿萃取2次(5 ml/次)，測定波長為41 nm，在0.064～0.38 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9997) ，平均回收率99.2%，RSD為2.38%，測得半枝蓮中總生物堿含量為0.167%。結(jié)論 該測定方法操作簡單，重復(fù)性好、靈敏度高，可用于測定半枝蓮中總生物堿的含量。

酸性染料比色法；半枝蓮；總生物堿

半枝蓮(Scutellaria barbata D. Don)為唇形科黃芩屬植物，以全草入藥，異名紫連草、韓信草、并頭草、牙刷草、通經(jīng)草等[1]。主要產(chǎn)于江蘇、浙江、四川、安徽、陜西、福建、河南、廣東等省，具有抗癌、清熱解毒、消腫止痛、化瘀利尿、活血祛疲的功效[2-4]，是一種常用的中藥。其化學(xué)成分主要有黃酮類、生物堿、酚類、有機(jī)酸、甾醇、多糖等[5-8]，其中生物堿是其主要的活性成分之一，具有抗腫瘤的作用[9-10]。

目前文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于半枝蓮中生物堿的含量測定方法有紫外分光光度法、酸堿滴定法、高效液相色譜法[11]，酸堿滴定法誤差準(zhǔn)確度低；高效液相色譜法只能測定某種生物堿的量；紫外分光光度法以鹽酸小檗堿為對照品，348 nm下測定，該方法只能同時(shí)測定有紫外吸收的成分，很難準(zhǔn)確測定總生物堿的含量。本研究根據(jù)酸性染料的陰離子與生物堿陽離子形成有顏色的絡(luò)合物的原理，紫外分光光度法測定有色絡(luò)合物的量，從而確定總生物堿的含量，為半枝蓮中生物堿類成分的開發(fā)和利用提供了科學(xué)的理論依據(jù)，同時(shí)也為半枝蓮進(jìn)一步的開發(fā)和利用提供參考。

1 儀器和試劑

759系列紫外可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；FC-104 電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；MIK-PH100便攜式pH計(jì)(杭州美控自動(dòng)化技術(shù)有限公司)；半枝蓮(山東泰安鴻康大藥房)；鹽酸小檗堿對照品(上海同田生化技術(shù)有限公司，批號09030522，純度98%)；其它試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)溶液的制備

2.1.1pH 3.8溴甲酚綠染料溶液的配制 取1.60 g無水醋酸鈉，加入90 ml水使溶解，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.5。取溴甲酚綠約50 mg，加入0.05 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml至超聲波儀器中10 min溶解后，再加入pH 3.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液至100 ml，備用[8]。

2.1.2對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，用pH 3.5醋酸-醋酸鈉緩沖液配制濃度為0.32 mg/ml的對照品溶液，備用。

2.1.3樣品溶液的制備

取半枝蓮2 g，加入6%鹽酸∶甲醇(1∶9)溶液50 ml，40 ℃超聲提取3次(30 min/次)，減壓抽濾，合并濾液，回收甲醇，烘箱干燥，溶于10 ml pH 3.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液，備用。

2.2最大吸收波長的測定

精密量取鹽酸小檗堿對照品液及供試品液1 ml分別置于2個(gè)分液漏斗中，分別依次加入pH 3.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液5 ml、pH 3.5的溴甲酚綠染料溶液5 ml，充分振搖15 min后氯仿萃取2次(5 ml/次)，合并氯仿溶液并稀釋至25 ml，無水硫酸鈉脫水，隨行試劑為空白，分別用紫外可見分光光度計(jì)在200～600 nm下掃描，樣品和對照均在418 nm下有最大吸收。見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的紫外吸收光譜圖

2.3最佳緩沖液pH的選擇

pH對生物堿與溴甲酚綠染料形成絡(luò)合物的穩(wěn)定性影響較大[12]。本實(shí)驗(yàn)考察了pH值為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液對生物堿含量測得的影響。精密量取鹽酸小檗堿對照品液2 ml分別置于分液漏斗中，分別加入pH為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0的緩沖液5 ml， 溴甲酚綠染料溶液10 ml，充分振搖，靜置15 min后氯仿萃取隨行試劑作空白，按照2.2項(xiàng)下的方法依次測定。結(jié)果不同pH下，鹽酸小檗堿對照品均在418 nm下有最大吸收，從吸光度值和0～1.5 h內(nèi)測定的穩(wěn)定性上來看，pH 3.5時(shí)吸光度最大，穩(wěn)定性最好，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用pH值為3.5的緩沖液。結(jié)果見表1。

表1 不同緩沖液處理的鹽酸小檗堿418 nm下的吸光度

2.4溴甲酚綠染料溶液用量的確定

精密量取鹽酸小檗堿對照品溶液0.5 ml，分別置5個(gè)分液漏斗中，再分別加入pH 3.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液至3 ml，接著分別加入溴甲酚綠染料溶液2 ml，5 ml，7 ml，8 ml，10 ml，隨行試劑作空白，按照2.2項(xiàng)下的方法測定418 nm下的吸光度值。結(jié)果表明當(dāng)溴甲酚綠染料溶液用量為5 ml時(shí)吸光度最大，故選用溴甲酚綠染料溶液最佳用量為5 ml。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取鹽酸小檗堿對照品液0.2 ml，0.4 ml，0.6 ml，0.8 ml，1.0 ml，1.2 ml置6個(gè)分液漏斗中，分別依次加入pH 3.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液至5 ml、溴甲酚綠染料溶液5 ml，另取3 ml緩沖液加入隨行試劑作空白，按照2.2項(xiàng)下的方法萃取，于418nm下測定吸光度值。以鹽酸小檗堿的量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為y=2.618x+0.0067(R=0.9997)，結(jié)果表明鹽酸小檗堿在0.064～0.384 mg內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取鹽酸小檗堿對照品液0.6 ml，按2.5同法操作，分別于0 h，0.5 h，1 h，1.5 h，2.0 h依法測定吸光度值，結(jié)果RSD為0.55%，表示標(biāo)準(zhǔn)品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取半枝蓮5份，每份2 g，按2.1.3的方法制備樣品溶液，2.2的方法于418 nm下測定，結(jié)果表明總生物堿含量的RSD=1.77%(n=5)，表明重復(fù)性較好。

2.3.4加樣回收率 精密稱取已知含量的同一批半枝蓮粗粉5份，每份2 g，精密稱定，分別加入鹽酸小檗堿對照品溶液0.1 ml，分別按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別精確吸取1.0 ml，按照2.2項(xiàng)下方法操作，418 nm 處測定吸光度，平均回收率為99.2%，RSD為2.38%。

2.4樣品含量測定

分別取半枝蓮粗粉5份，每份2 g，按照2.1.3項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，每份取1 ml按照2.2項(xiàng)下的方法于418 nm下測定吸光度，計(jì)算半枝蓮中總生物堿的含量為0.167%(以鹽酸小檗堿計(jì))，結(jié)果見表2。

表2 半枝蓮中總生物的含量

3 討 論

半枝蓮具有抗腫瘤、免疫增強(qiáng)、抗氧化、抗微生物等作用，其中scutebarbatine A、scutebarbatine B、scutebarbatine C等二萜類生物堿為其抗腫瘤作用的主要成分[13]。半枝蓮中含有十幾種生物堿，其含量測定的方法有高效液相色譜法，但是該方法只能同時(shí)測定某種或某幾種生物堿的含量。本實(shí)驗(yàn)以酸性染料為顯色劑、鹽酸小檗堿為對照品，測定了半枝蓮中總生物堿的含量，方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性較好，為以后半枝蓮及其制劑中總生物堿的含量測定提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)考察了總生物堿紫外分光光度法含量測定常用的顯色劑溴酚藍(lán)、溴麝香草酚藍(lán)和溴甲酚綠，從顯色的穩(wěn)定性上來看，溴甲酚綠更適合作為半枝蓮中總生物堿含量測定的顯色劑[14]。上述三種作為顯色劑測定總生物堿的含量的方法均屬于酸性染料比色法，其基本原理是在適當(dāng)?shù)膒H介質(zhì)中，堿性成分可以與氫離子結(jié)合為陽離子，然后與酸性染料解離出的陰離子定量的結(jié)合為有色絡(luò)合物離子對。生物堿是否完全與染料試劑陰離子結(jié)合取決于緩沖液的pH值、緩沖液的用量及酸性染料的用量。故本研究對溴甲酚綠作顯色劑的緩沖液pH、緩沖液的用量及溴甲酚綠的用量進(jìn)行考察，以確定半枝蓮中總生物堿含量測定的最佳條件。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局.中華本草[M].第2 版.上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:210.

[2] Zhi-Jun Dai, Wang-Feng Lu, Jie Gao, et al. Anti-angiogenic effect of the total flavonoids in Scutellaria barbata D. Don[J]. Complementary and Alternative Medicine，2013, 13:150-160.

[3] LI Hui-wei, JIU Mao-lin, GUANG Wen-wu, et al. Scutellaria barbata D.Don induces G1/S arrest via modulation of p53 and Akt pathways in human colon carcinoma cells[J]. Oncology Reports，2013,29: 1623-1628.

[4] LING ZHANG, QIAOYAN CAI, JIUMAO LIN, et al. Chloroform fraction of Scutellaria barbata D. Don promotes apoptosis and suppresses proliferation in human colon cancer cells[J]. Molecular Medicina Reports, 2014,9: 701-706.

[5] XU YM, GUO LW, CHEN JW. Isolation and physico-chemical properties of polysaccharide from the herb of Scutellaria barbata D.Don [J]. Nat Prod Res Develop, 1992, 4(1):1-5.

[6] Dai SJ,Chen M,Liu K,et al. Four new neo-clerodane diterpenoid alkaloids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities[J]. Chem Pharm Bull (Tokyo)，2006, 54(6):869-872.

[7] Dai SJ,Wang GF,Chen M, et al. Five new neo-clerodane diterpenoid alkaloids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities[J].Chem Pharm Bull (Tokyo)，2007, 55(8):1218-1221

[8] Dai SJ,Liang DD,Ren Y, et al. New neo-clerodane diterpenoid alkaloids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities[J]. Chem Pharm Bull (Tokyo)，2008, 56(2):207-209.

[9] Dai SJ,Peng WB,Shen L, et al. Two new neo-clerodane diterpenoid alkaloids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities[J].J Asian Nat Prod Res，2009, 11(5):451-456.

[10] Dai SJ, Peng WB, Shen L, et al.New norditerpenoid alkaloids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities[J]. Nat Prod Res，2011,25(11):1019-1024.

[11] 涂琪順,蔡光明,何群,等.HPLC法測定半枝蓮中二萜類生物堿scutebarbatine B[J]. 中草藥, 2008,39(2): 280-282.

[12] 曾寶, 古俊輝, 唐君蘋, 等. 酸性染料比色法測定巴豆中總生物堿的含量[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 28(2): 170-172.

[13] Dai SJ,Peng WB,Zhang DW, et al.Cytotoxic neo-clerodane diterpenoid alkaloids from Scutellaria barbata[J]. J Nat Prod,2009, 72(10):1793-1797.

[14] 羅長青,羅北亮.酸性染料比色法測定鉤藤的總生物堿含量[J].中藥材, 2007, 30(8): 1021-1024.

Determination of total alkaloids in Scutellaria barbata D. Don by acid dye colorimetry

SHAOLanZHAOQi-diFEIHong-rong

(College of Pharmacy, Taishan Medical University, Taian 271016, China)

Objective: To establish a method for the assay of the total alkaloids in Scutellaria barbata D. Don. Methods: Acidic dye colorimetry was used for the determination of total alkaloids in Scutellaria barbata D. Don with berberine hydrochloride as reference substance. Results: Acid dye colorimetric conditions were as follows: pH3.5 buffer to5.0 ml, adding 5ml bromocresol green, extracting for two times (5ml/time) with chloroform, shaking out completely, stewing for 15 min, then determining at the wavelength of 418nm. The concentration of magnoflorine showed good linearity within the range of 0.064～0.384 mg,r=0.9997, and the average recovery ratio was 99.2% with RSD of 2.38%. The total alkaloids content in Scutellaria barbata D. Don was 0.167% determined by this method. Conclusion: This method is simple, highly sensitive, accurate and reproducible, which can be used for determination of the total alkaloids in Scutellaria barbata D. Don

acid dye colorimetry; scutellaria barbata D. Don; total alkaloids

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510439082)。

邵蘭，女，泰山醫(yī)學(xué)院2013級藥學(xué)本科專業(yè)學(xué)生。

費(fèi)洪榮，E-mail：hrfei@tsmc.edu.cn。

R917

A

1004-7115(2017)12-1361-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.013

2017-09-01)