一種CD3+T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)CD69分子的檢測(cè)方法

王 靜 王一任 王克強(qiáng)

(1.泰安市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 泰安 271000； 2. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部2016級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)班，山東 青島 266000)

一種CD3+T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)CD69分子的檢測(cè)方法

王 靜1王一任2王克強(qiáng)2

(1.泰安市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 泰安 271000； 2. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部2016級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)班，山東 青島 266000)

目的 建立一種人外周血CD3+T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)CD69的檢測(cè)方法。方法 分離獲取健康人PBMC，用PMA+IM(佛波醇酯+離子霉素)刺激PBMC，用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(Brefeldin A，BFA)阻斷細(xì)胞內(nèi)因子的分泌，用皂角素(Saponin)破膜，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+T細(xì)胞胞內(nèi)CD69陽(yáng)性率，以確定最佳的破膜時(shí)間。結(jié)果 最佳的破膜時(shí)間為15 min，CD3+T細(xì)胞胞內(nèi)CD69表達(dá)的陽(yáng)性率較高，可達(dá)87.82%。結(jié)論 流式細(xì)胞術(shù)是一種檢測(cè)CD3+T細(xì)胞內(nèi)CD69的較好方法，這一方法也為CD3+T細(xì)胞內(nèi)其他分子的檢測(cè)分析奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

CD3+T細(xì)胞；CD69分子； PMA+IM；流式細(xì)胞術(shù)

人體發(fā)揮細(xì)胞免疫功能的細(xì)胞主要是T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞?，F(xiàn)已證實(shí)，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)在殺傷腫瘤細(xì)胞、控制腫瘤生長(zhǎng)中起重要作用[1]。CD3+T是成熟T淋巴細(xì)胞的共同分化抗原，CD3+T細(xì)胞已在骨髓增生異常綜合癥(MDS)的研究中被證實(shí)為其共刺激分子表達(dá)存在異常改變，其表達(dá)異?？赡茉贛DS的發(fā)病機(jī)制中起一定作用[2]；并且，有研究證實(shí)MDS患者骨髓CD3+T細(xì)胞中TET2 mRNA表達(dá)減低，DLK1 mRNA表達(dá)增高，提示CD3+T細(xì)胞有“質(zhì)”的異常，這可能是導(dǎo)致機(jī)體免疫監(jiān)視功能下降的機(jī)制之一[3]。在重型再生障礙性貧血(SAA)患者CD3+T細(xì)胞存在端粒長(zhǎng)度及相關(guān)蛋白基因表達(dá)異常，且與病情相關(guān)[4]。目前有關(guān)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的方法，基本上是檢測(cè)T淋巴細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的細(xì)胞因子[5-7]，雖然這樣做也能反映出T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的基本情況，但不夠精確。CD69分子是淋巴細(xì)胞活化最早表達(dá)的膜表面分子，通常作為T(mén)細(xì)胞活化標(biāo)志用于許多研究中[8]。為CD3+T細(xì)胞內(nèi)分子的檢測(cè)分析以及CD69分子表達(dá)在血液學(xué)的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中奠定一個(gè)方法學(xué)基礎(chǔ)，筆者用流式細(xì)胞儀，通過(guò)特異性染色技術(shù)，對(duì)單個(gè)CD3+T細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)CD69分子進(jìn)行了檢測(cè)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器 美國(guó)Beckman-counter公司流式細(xì)胞儀(Coulter EPICSR XL-MCL)；美國(guó)Harris hw0301T-VBA CO2孵箱；梧光WJ12-50 XSB-14倒置顯微鏡；日本Olympus BH光學(xué)顯微鏡；Falcon公司細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.1.2主要試劑 RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液[9]；美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的佛波醇酯(PMA，產(chǎn)品編號(hào)：P1585)；杭州四季青生物公司生產(chǎn)的新生牛血清(NBS)；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所生產(chǎn)的淋巴細(xì)胞分離液(批號(hào)：20000408)；美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的離子霉素(IM，產(chǎn)品編號(hào)：I0643)；美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的多聚甲醛(PFA，產(chǎn)品編號(hào)：M122)；美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的皂角素(Saponin，產(chǎn)品編號(hào)：S4521)；美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(Brefeldin A，BFA，產(chǎn)品編號(hào)：B7651)；美國(guó)Ancell公司生產(chǎn)的anti-CD3PE(產(chǎn)品編號(hào)：9734008)；美國(guó)Ancell公司生產(chǎn)的anti-CD69FITC(產(chǎn)品編號(hào)：819010)。

1.2方法

1.2.1準(zhǔn)備細(xì)胞懸液 選擇健康成人，抽取外周靜脈血，用肝素抗凝，然后用淋巴細(xì)胞分離液分離獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.5～2×106/ml，備用。

1.2.2細(xì)胞分組處理 細(xì)胞分三個(gè)處理組：①組I：PBMC；②組II：PBMC + PMA(20 ng/ml)+ IM(1 μg/ml)；③組III：PBMC + PMA(20 ng/ml)+ IM(1μg/ml)+ BFA(10μg/ml)。將1.5～2×106/ml細(xì)胞懸液，每空1 ml加入24孔培養(yǎng)板中，在37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)4 h，然后收集細(xì)胞，再用PBS-5% FCS-0.1% NaN3洗滌，用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸濃度成1.5～2×106/ml，備用。

1.2.3CD3+T細(xì)胞表面CD69分子檢測(cè) 用CD3PE/CD69FITC雙染色，檢測(cè)上述組I、組II、組III中CD3+T細(xì)胞的CD69表達(dá)情況。

1.2.4CD3+T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)CD69分子檢測(cè) 對(duì)組I、組II、組III中CD3+T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的CD69進(jìn)行檢測(cè)。①細(xì)胞表面染色：取9個(gè)染色管分別加入組I(3個(gè)管)、組II(3個(gè)管)、組III(3個(gè)管)細(xì)胞懸液各100 μl，每管再加入anti-CD3PE，置于4 ℃冰箱30 min,取出后用PBS-5%FCS-0.1%NaN3洗滌細(xì)胞,然后用離心機(jī)以3000 rpm離心5 min,棄上清；②細(xì)胞固定：各管加PBS-2%PFA 400 μl，置于4 ℃冰箱20 min，取出后用PBS-5%FCS-0.1%NaN3洗滌細(xì)胞，然后用離心機(jī)以3000 rpm離心5 min,棄上清；③細(xì)胞穿膜：各管加PBS-0.1%Saponin-10%FCS 400 μl，置于4 ℃冰箱，各組5 min、15 min和25 min各取出1管，分別用離心機(jī)以3000 rpm離心5 min,棄上清；④細(xì)胞內(nèi)染色：各管加anti-CD69FITC，置于4 ℃冰箱30 min,取出后用PBS-5%FCS-0.1%NaN3洗滌細(xì)胞,然后用離心機(jī)以3000 rpm離心5 min,棄上清；再用PBS-5%FCS-0.1%NaN3洗滌細(xì)胞,用離心機(jī)以3000 rpm離心5 min,棄上清；最后，將細(xì)胞重懸于400 μl PBS-0.5%PFA中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

選用氬離子激光波長(zhǎng)488 nm，以FSC/SSC二維點(diǎn)圖設(shè)門(mén)于淋巴細(xì)胞群體，用MinMDI Version 2.8軟件分析所得數(shù)據(jù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，不同破膜時(shí)間的比較采用方差分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1破膜條件的選擇

用PBS-0.1%Saponin 4 ℃對(duì)細(xì)胞處理5 min、15 min和25 min的破膜結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果顯示，5 min時(shí)，對(duì)細(xì)胞破膜力度不足，CD3+T細(xì)胞胞內(nèi)CD69的陽(yáng)性率僅為66.90%；處理15 min時(shí)，細(xì)胞形態(tài)破壞不大，CD3+T細(xì)胞胞內(nèi)CD69的陽(yáng)性率為87.91%，破膜效果較好；處理25 min時(shí)，細(xì)胞形態(tài)受到破壞，CD3+T細(xì)胞所占比例僅為58.40%，破膜過(guò)度。

表1 PBS-0.1%Saponin 4 ℃不同作用時(shí)間的破膜結(jié)果

注：CD3+T陽(yáng)性率比較(單因素方差分析)F=29.119,P<0.001，兩兩比較：*與5 min和15 min比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；CD69陽(yáng)性率比較(單因素方差分析)F=112.805,P<0.001，兩兩比較：△與15 min和25 min比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

2.2CD3+T細(xì)胞表面CD69分子檢測(cè) PBMC(組I)中的CD3+T細(xì)胞表面表達(dá)CD69陽(yáng)性率為(0.65±0.05)%；PMA和IM刺激4 h后(組II) CD3+T細(xì)胞表面CD69表達(dá)陽(yáng)性率為(64.09±1.96)%；加入阻斷劑BFA(組III)后，CD3+T細(xì)胞表面CD69表達(dá)陽(yáng)性率為(4.60±0.12)%,見(jiàn)圖1(A1、B1、C1)。結(jié)果表明刺激劑(PMA、IM)和阻斷劑(BFA)均是有效的。

2.3CD3+T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)CD69分子檢測(cè) PBMC(組I)中的CD3+T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CD69陽(yáng)性率為(0.49±0.04)%；PMA和IM刺激4 h后(組II) CD3+T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)CD69表達(dá)陽(yáng)性率為(2.81±0.16)%；加入阻斷劑BFA(組III)后，CD3+T細(xì)胞表面CD69表達(dá)陽(yáng)性率為(87.91±2.30)%,見(jiàn)圖1(A2、B2、C2)。此結(jié)果表明對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的檢測(cè)是成功的。

圖1 PBMC中CD3+ T細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)CD69分子檢測(cè)

PBMC：圖A1、A2；PBMC + PMA + IM：圖B1、B2；PBMC + PMA + IM + BFA：圖C1、C2。圖A1、B1、C1：CD3PE/CD69FITC雙染，檢測(cè)CD3+T細(xì)胞表面CD69分子；圖A2、B2、C2：CD3PE/CD69FITC雙染，檢測(cè)CD3+T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的CD69分子。

3 討 論

本方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CD69分子的原理，是用BFA抑制細(xì)胞分泌CD69分子，讓CD69分子滯留在細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)對(duì)CD3+T細(xì)胞固定、破膜、打孔等處理，用熒光素標(biāo)記的抗細(xì)胞單抗，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)因子的檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)PBMC(組I)中的CD3+T細(xì)胞表面表達(dá)CD69陽(yáng)性率很少，僅為(0.65±0.05)%；當(dāng)CD3+T細(xì)胞在不加蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑、被PMA和IM刺激活化細(xì)胞表面CD69分子應(yīng)高表達(dá)，且在刺激6 h達(dá)高峰[10-12]。本實(shí)驗(yàn)CD3+T細(xì)胞被PMA和IM刺激活化4 h后表面CD69表達(dá)上升為(64.09±1.96)%，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[10-12]。在加入阻斷劑BFA(組III)后，CD3+T細(xì)胞表面CD69表達(dá)陽(yáng)性率急劇下降，僅為(4.60±0.12)%。結(jié)果表明刺激劑(PMA、IM)和阻斷劑(BFA)均是有效的。

對(duì)CD3+T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的CD69檢測(cè)，PBMC(組I)中的CD3+T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CD69陽(yáng)性率極少，僅(0.49±0.04)%，細(xì)胞經(jīng)PMA和IM刺激4 h后(組II)但無(wú)阻斷劑BFA時(shí)，CD3+T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)CD69表達(dá)陽(yáng)性率為(2.81±0.16)%,加入阻斷劑BFA(組III)后，CD3+T細(xì)胞表面CD69表達(dá)陽(yáng)性率為(87.91±2.30)%,可推斷破膜打孔有效。實(shí)驗(yàn)破膜用PBS-0.1%Saponin，4 ℃處理細(xì)胞15 min效果較好。選擇用4 ℃實(shí)驗(yàn)，操作簡(jiǎn)單，放4 ℃冰箱即可，便于控制溫度，且4 ℃下細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低，更易于打孔。

綜上所述，CD3+T細(xì)胞受PMA和IM刺激并有BFA存在時(shí)，可檢測(cè)到CD3+T細(xì)胞87.82%的細(xì)胞內(nèi)CD69表達(dá)，獲得了較好的結(jié)果,這為CD3+T細(xì)胞內(nèi)其他分子的檢測(cè)分析以及CD69表達(dá)在血液學(xué)的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中奠定了一個(gè)方法學(xué)基礎(chǔ)。

[1] Kelly JM,Darey PK,Markby JL,et al.Induction of tumor-specific T cell menmory by NK cell-mediated tumor rejection[J].Nat Immunol,2002,3(1):83-90.

[2] 曾慧，吳德沛，歐陽(yáng)建，等.骨髓增生異常綜合癥CD3+CD4+T細(xì)胞共刺激分子表達(dá)的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液雜志，2008,16(5)：1082-1085.

[3] 張薇，付蓉，王化泉，等. 骨髓增生異常綜合癥患者骨髓CD3+細(xì)胞TET2和DLK1基因表達(dá)分析[J].中華血液學(xué)雜志，2012，33(Supp1)：261.

[4] 王婷，付蓉，王化泉，等. 重型再生障礙性貧血CD3+T細(xì)胞端粒長(zhǎng)度及shelterin基因的表達(dá)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2013,93(20)：1533-1536.

[5] 王克強(qiáng),侯彥強(qiáng),朱蓓，等. γδT細(xì)胞的擴(kuò)增及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子ζ鏈相關(guān)蛋白-70的免疫印跡檢測(cè)[J].中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2013,19(6)：461-463.

[6] Caraher EM, Parenteau M, Gruber H, et al. Flow cytometric analysis of intracellular IFN-g,IL-4 and IL-10 in CD3+4+T cells from rat spleen[J]. J Immunol Meth,2000,244(1-2):29-40.

[7] Tayebi H, Lienard A, Billot M, et al. Detection of intracellular cytokines in citrated whole blood or marrow samples by flow cytometry[J]. J Immunol Meth,1999,229(1-2):121-130.

[8] 李清華，魏麗，王克強(qiáng). CD69分子在γδT細(xì)胞中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2016,22(4)：371-373.

[9] 王克強(qiáng)，侯彥強(qiáng)，王曉紅，等.結(jié)核桿菌低分子多肽抗原再次刺激其活化的T細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)γδΤ細(xì)胞CD69分子再次表達(dá)的影響[J]. 國(guó)際免疫學(xué)雜志,2014,37 (4)：333-336.

[10] 王克強(qiáng)，侯彥強(qiáng)，王曉紅，等.三種方式刺激γδT細(xì)胞活化分子CD69表達(dá)的動(dòng)力學(xué)觀察[J]. 中華血液學(xué)雜志，2014，35(8)：753-754.

[11] Keqiang Wang, Yanqiang Hou, Qinghua Li, et al.Inhibitory effect of LY294002 on CD3mAb-activated T cells and Mtb-Ag-activated γδT cells via TCR signal transduction pathway[J]. Int J Clin Exp Pathol,2017,10(5):5538-5544.

[12] Keqiang Wang, Yanqiang Hou, Chenxing Gu, et al. Inhibitory effect of the mitogen activated protein kinase specifc inhibitor PD98059 on Mtb-Ag-activated γδT cells[J]. Int J Clin Exp Pathol,2017,10(6):6640-6645.

A method for detecting intracellular CD69 molecules in CD3+T cells

WANGJing1WANGYi-ren2WANGKe-qiang1

(1.Dept.ofClinicalLaboratory,TaianHospitalofTraditonalChineseMedicine，Taian271000,China； 2.MedicalLaboratoryClass,Grade2016，MedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266000，China)

Objective: To establish a method for detecting intracellular CD69 in human peripheral blood CD3+T cells. Methods： Healthy human PBMC was isolated, PBMC were stimulated by PMA and IM. Protein transport inhibitors (Brefeldin A, BFA) were used to block the secretion of cytokines. Saponin was used to destruct cell membrane. In order to find the best time of membrane destruction, we used flow cytometry to detect the positive rate of CD69 in CD3+T cells. Results： The best time of membrane destruction was 15 minutes. The positive rate of CD69 in CD3+T cells was higher, even up to 87.82%. Conclusion： Flow cytometry is a good method for the detection of intracellular CD69 in CD3+T cells, and flow cytometry also make a methodological foundation for the detection of other cytokines in CD3+T cells.

CD3+T cells;CD69 molecules;PMA+IM；flow cytometry

山東省保健科技協(xié)會(huì)科學(xué)技術(shù)課題(2016BJ0012)。

王靜(1964—)，女，山東陽(yáng)谷人，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷工作。

王克強(qiáng)，E-mail：wkqsd@163.com。

R446.6

A

1004-7115(2017)12-1337-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.006

2017-09-18)