一株四葉參內(nèi)生真菌抑菌和抗氧化活性研究

張雅婧 黃巧麗 王 楠 張 娜 崔 萌 劉振亮 孫立彥

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

一株四葉參內(nèi)生真菌抑菌和抗氧化活性研究

張雅婧 黃巧麗 王 楠 張 娜 崔 萌 劉振亮 孫立彥

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

目的 研究一株四葉參內(nèi)生真菌SYG6的抑菌和抗氧化活性。方法 采用濾紙片法測(cè)定四葉參內(nèi)生真菌SYG6抑菌活性，采用鐵氰化鉀還原力法和DPPH 法測(cè)定其抗氧化活性。結(jié)果 在供試菌株中，SYG6 僅對(duì)鰻弧菌有抑菌作用，抑菌圈直徑為(6.500±0.017)mm。在測(cè)試濃度0～6.0 mg/ml范圍內(nèi)，SYG6還原力與濃度呈明顯量效關(guān)系，其EC50值為1.6575 mg/ml；在1.5～6.0 mg/ml范圍內(nèi)SYG6對(duì)DPPH自由基清除率隨濃度增大而增大，其IC50值為4.5895 mg/ml。結(jié)論 四葉參內(nèi)生真菌SYG6具有一定抑菌和抗氧化活性，是篩選天然生物活性成分的潛在資源。

四葉參；內(nèi)生真菌；抑菌和抗氧化活性

四葉參Codonopsis lanceolata (Sieb. et Zucc.) Trautv.為桔梗科黨參屬多年生纏繞性草本植物[1]，又名羊乳、山胡蘿卜、羊奶參、輪葉黨參，以根入藥。泰安當(dāng)?shù)厮追Q泰山四葉參，為泰山四大名藥之一[2]。四葉參為藥食兩用植物，在民間采其春季幼苗或根作山珍食用，美味可口，是難得的上好佳肴。傳統(tǒng)上其根入藥，具有清熱解毒、止咳祛痰、補(bǔ)虛通乳、健身補(bǔ)氣等功效，用于肺癰咳嗽、病后虛弱、產(chǎn)后缺乳等癥，與泰山何首烏、黃精、紫草一道被稱為“泰山四大名藥”[3]。

植物內(nèi)生真菌是植物生活史中的部分或全部階段生活在植物組織內(nèi)，但不造成明顯病害癥狀的一類真菌，其代謝產(chǎn)物豐富，是新型藥物的潛在資源[4]。關(guān)于四葉參內(nèi)生真菌僅見徐旭等對(duì)四葉參內(nèi)生真菌SYY1的報(bào)道[5]，本研究對(duì)從四葉參根中分離到的一株SYG6抑菌和抗氧化活性進(jìn)行研究，為四葉參的利用及其野生資源的保護(hù)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料 四葉參內(nèi)生真菌 SYG6乙酸乙酯粗提物；鰻弧菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白色念珠菌 SU5314、白色念珠菌 YEM30(白色念珠菌由泰山醫(yī)學(xué)院趙瑩老師提供，其他菌株由山東師范大學(xué)王海英老師提供)。

1.1.2試劑 DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，Sigma公司)；BHT(2，6-二叔丁基對(duì)甲苯酚，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；Vc(中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所)；鐵氰化鉀(天津市博迪化工有限公司)；磷酸氫二鈉(天津市博迪化工有限公司)；磷酸二氫鈉(天津市博迪化工有限公司)；MH 肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司)；沙堡氏瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)；瓊脂粉(天津市承大化學(xué)試劑研發(fā)中心)；等。

1.1.3主要儀器 SW-CG-RF超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MJX-320多段編程霉菌培養(yǎng)箱，寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司； UV-2550紫外分光光度計(jì)，島津制作所；202-2AB電熱恒溫干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；LDZX-40BI立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；FC-104電子分析天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；XSP-2C生物顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠；XB-K-25血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠；等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品粗提物的制備 制備SYG6種子發(fā)酵液(25 ℃，150 rpm，3 d)，在大米固體培養(yǎng)基上25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)28 d，用乙酸乙酯浸提后真空濃縮得其粗提物，用于抑菌和抗氧化實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2抑菌活性試驗(yàn)

1.2.2.1供試菌株

表1 供試菌株

1.2.2.2培養(yǎng)基的制作

MH肉湯液體培養(yǎng)基：27.0 g肉湯，1 L蒸餾水，121 ℃滅菌25 min。

MH 肉湯固體培養(yǎng)基：27.0 g肉湯， 16.0 g瓊脂，1 L純水，在121 ℃下滅菌25 min。

沙堡氏培養(yǎng)基：67.0 g肉湯，1 L純水，在121 ℃下滅菌25 min。

1.2.2.3抑菌活性測(cè)定[5-6]

將新鮮配置的培養(yǎng)基于121 ℃下滅菌，當(dāng)培養(yǎng)基冷至50～60 ℃時(shí)，倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，待平板冷卻后，每皿中加入300 μl菌懸液(106～108個(gè)/ml)，用三角玻璃涂棒均勻涂成薄板。無菌鑷子夾取已風(fēng)干的無菌濾紙片(直徑6 mm，20 mg/ml的樣品甲醇溶液充分浸泡3 h)放在含菌平板上，每皿放3 片，倒置，37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)抑菌圈直徑，測(cè)3次，取平均值。

1.2.3抗氧化性試驗(yàn)

1.2.3.1鐵氰化鉀還原力試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[5-6]方法進(jìn)行測(cè)定，精確移取1 ml不同甲醇濃度(6 mg/ml，3 mg/ml，1.5 mg/ml，0.75 mg/ml，0.375 mg/ml，0.1875 mg/ml，0.09375 mg/ml)的樣品溶液于10 ml試管中，分別依次加入2.5 ml磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)，2.5 ml鐵氰化鉀溶液(10 g/L)，混勻，50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷卻至室溫，再加入2.5 ml三氯乙酸(100 g/L)，混勻，離心(3000 r/min)10 min，取上清液2.5 ml，加2.5 ml超純水，0.5 ml三氯化鐵(1 g/L)，混勻，室溫反應(yīng)10 min，700 nm測(cè)吸光度。用Vc和BHT作陽(yáng)性對(duì)照，用1 ml甲醇代替樣品溶液作空白對(duì)照。所有測(cè)定平行3次，取平均值。

1.2.3.2DPPH 自由基清除率試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[5][7]方法進(jìn)行測(cè)定，吸取0.5 ml不同甲醇濃度(6 mg/ml，3 mg/ml，1.5 mg/ml，0.75 mg/ml，0.375 mg/ml，0.1875 mg/ml，0.0938 mg/ml)的SYG6樣品溶液，加入3.5 mlDPPH溶液(0.04 mg/ml，無水乙醇為溶劑)，混勻，25 ℃水浴黑暗反應(yīng)30 min，靜置10 min，取上清液，測(cè)定517 nm吸光度As。另取0.5 ml樣品溶劑代替樣品溶液同上操作，測(cè)定吸光度A0。另取0.5 ml不同濃度的樣品溶液于試管中，分別加入無水乙醇3.5 ml，同上操作，測(cè)定吸光度Ab。以Vc、BHT作陽(yáng)性對(duì)照，平行測(cè)定三次，取平均值，以自由基清除率E表示。E(%) =[Ao-( As-Ab) ]/Ao×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1抑菌活性的測(cè)定

依據(jù)1.2.2方法得到四葉參內(nèi)生真菌SYG6 對(duì)5種供試菌株的抑菌圈直徑，結(jié)果見表2。在供試菌株范圍內(nèi)，SYG6僅對(duì)鰻弧菌有抑菌作用，其抑菌圈直徑為(6.500±0.017) mm，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白色念珠菌均無抑菌作用。

表2 SYG6 對(duì)供試菌株的抑菌圈直徑/mm

2.2抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.2.1鐵氰化鉀還原力的測(cè)定 根據(jù)1.2.3.1方法，測(cè)定不同濃度SYG6樣品和陽(yáng)性對(duì)照品(Vc、BHT)在700 nm 處的吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，得到SYG6和陽(yáng)性對(duì)照品還原力曲線，結(jié)果見圖1。從圖1可見，Vc在0～6.0 mg/ml范圍內(nèi)，其吸光值隨濃度增大不斷增大；BHT在 0～1.5 mg/ml 范圍內(nèi)，其吸光值隨濃度增大不斷增大，而在1.5～6.0 mg/ml范圍內(nèi)，BHT吸光值略有下降趨勢(shì)；SYG6在0～6.0 mg/ml范圍內(nèi)，其吸光值與濃度呈一定量效關(guān)系，在最高濃度6.0 mg/ml時(shí)，吸光值最大，還原力最強(qiáng)，但在相同濃度下，其還原力弱于陽(yáng)性對(duì)照Vc和BHT。

圖1 SYG6 、Vc和BHT還原力曲線

依據(jù)圖1，在有效濃度范圍內(nèi)，建立濃度C與吸光度A線性關(guān)系，得線性回歸方程，計(jì)算EC50(A 為 0.5 時(shí)的樣品濃度)，結(jié)果見表3。

表3 SYG6 、Vc和BHT 還原力線性方程及其EC50 值

2.2.2DPPH 自由基清除率 根據(jù)1.2.3.2方法，得到不同濃度SYG6和陽(yáng)性對(duì)照品對(duì)DPPH自由基的清除率E，以濃度C為橫坐標(biāo)，自由基清除率E為縱坐標(biāo)，得到 SYG6和陽(yáng)性對(duì)照對(duì)DPPH自由基的清除效果曲線，結(jié)果見圖2。從圖2可見，在1.5～6.0 mg/ml范圍內(nèi)，SYG6對(duì)DPPH自由基清除率隨濃度的增大而增強(qiáng)。在0.0117～0.0469 mg/ml范圍內(nèi)，Vc對(duì)DPPH自由基清除率隨濃度的增大而增強(qiáng)，在0.0469 mg/ml后基本趨于穩(wěn)定。在0.0117～0.3750 mg/ml范圍內(nèi)，BHT對(duì)DPPH自由基清除率隨濃度的增大而增強(qiáng)，在0.3750 mg/ml后BHT對(duì)DPPH自由基清除率基本趨于穩(wěn)定。陽(yáng)性對(duì)照Vc和BHT對(duì) DPPH 自由基清除率均能達(dá)到80%以上?？梢?，SYG6對(duì)DPPH自由基有一定清除效果，但弱于Vc和BHT對(duì)DPPH自由基的清除效果。

圖2 SYG6、Vc和BHT對(duì)DPPH自由基清除能力曲線

依據(jù)圖2，在有效濃度范圍內(nèi)，建立濃度C與自由基清除率E線性關(guān)系，得回歸方程，計(jì)算 IC50(E為50% 時(shí)的濃度)，結(jié)果見表3。

表3 SYG6、Vc和BHT 清除DPPH線性方程及IC50值

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)用濾紙片法測(cè)定四葉參內(nèi)生真菌SYG6抑菌活性，采用鐵氰化鉀還原力測(cè)定法和DPPH法測(cè)定其抗氧化活性。結(jié)果表明，在供試菌株范圍內(nèi)，四葉參內(nèi)生真菌SYG6僅對(duì)鰻弧菌有抑菌作用，其抑菌圈直徑為(6.500±0.017)mm； SYG6乙酸乙酯粗提物有一定抗氧化活性，其抗氧化性弱于陽(yáng)性對(duì)照Vc和BHT。

本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)四葉參內(nèi)生真菌SYG6的乙酸乙酯粗提物進(jìn)行了抑菌及抗氧化活性初步研究，希望能為四葉參內(nèi)生真菌相關(guān)研究和四葉參資源綜合開發(fā)利用提供一定參考資料。

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Studies on the antibacterial and antioxidant activities of an endophytic fungus from Codonopsis lanceolata

ZHANGYa-jingHUANGQiao-liWANGNanZHANGNaLIUZhen-liangSunLi-yan

(Taishan Medical University, Taian 271016, China)

Objective:To study the antibacterial and antioxidant activities of endophytic fungus SYG6 crude extract from Codonopsis lanceolata. Methods:The filter paper method was used for the determination of antibacterial activity, and potassium ferricyanide reduction force measurement and DPPH method were used for the determination of antioxidant activity．Results:In the tested strains，endophytic fungus SYG6 had inhibitory effect only on Vibrio anguillarum．The antibacterial circle diameter was 6.500±0.017 mm．In the tested concentation range of 0～6 mg/ml，the reducing power of endophytic fungus SYG6 had obvious dose-effect relationship with the concentration, of which the IC50 was 1.6575 mg/ml. In the tested concentation range of 1.5～6 mg/ml, the scavenging DPPH ability increased with increasing concentration of SYG6, of which the IC50 was 4.5895 mg/ml.Conclusions:The crude extract of endophytic fungus SYG6 had certain antibacterial and antioxidant activities, which could be used as the potential resource for screening natural bioactivity constituents．

Codonopsis lanceolata;endophytic fungus;antibacterial and antioxidant activities

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2011CQ011)；泰安市科學(xué)技術(shù)局項(xiàng)目(2015NS2123)；泰醫(yī)高層次培育課題(2015GCC14)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201510439014，201510439083)。

張雅婧(1994—)，女，中藥學(xué)專業(yè)2013級(jí)本科生。黃巧麗，女，生藥學(xué)專業(yè)2016級(jí)碩士生，并列第一作者。

劉振亮，E-mail: zlliu@tsmc.edu.cn。孫立彥，碩士生導(dǎo)師，hhhyyy1982@163.com。

R285

A

1004-7115(2017)12-1321-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.001

2017-10-17)