益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫功能及腸道菌群的影響

孟霄鵬，孟 陽(yáng)，王 悅，楊 碩，袁春營(yíng)，崔青曼

( 天津科技大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院，天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457 )

益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫功能及腸道菌群的影響

孟霄鵬，孟 陽(yáng)，王 悅，楊 碩，袁春營(yíng)，崔青曼

( 天津科技大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院，天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457 )

以類芽孢桿菌和雙歧桿菌為益生菌，添加到凡納濱對(duì)蝦(平均體質(zhì)量3.45 g)的飼料中，飼養(yǎng)28 d(水溫25～27 ℃，鹽度25～26，pH 7.8～8.1，溶解氧>6 mg/L)，采用南京建成試劑盒和變性梯度凝膠電泳技術(shù)，研究益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫功能及腸道菌群的影響。結(jié)果表明，益生菌能夠顯著提高對(duì)蝦血清過(guò)氧化物酶(對(duì)照組43.22 U/mL，試驗(yàn)組76.33 U/mL)、超氧化物歧化酶(對(duì)照組60.61 U/mL，試驗(yàn)組101.18 U/mL)、一氧化氮合酶(對(duì)照組7.54 U/mL，試驗(yàn)組12.44 U/mL)、酸性磷酸酶(對(duì)照組0.0446 U/mL，試驗(yàn)組0.0574 U/mL)和堿性磷酸酶(對(duì)照組0.0183 U/mL，試驗(yàn)組0.0236 U/mL)的活性 (P<0.01)，明顯改善對(duì)蝦腸道的菌群組成，從而提高對(duì)蝦抵抗疾病的能力。

類芽孢桿菌；雙歧桿菌；凡納濱對(duì)蝦；免疫學(xué)指標(biāo)；腸道菌群

近年來(lái)，隨著凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)集約化養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，水環(huán)境惡化和種質(zhì)退化導(dǎo)致病害頻發(fā)，抗生素及其他違禁藥物引起的細(xì)菌抗藥性及藥物殘留等問(wèn)題，影響了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。為了解決養(yǎng)殖病害和食品安全等諸多矛盾，尋找綠色環(huán)保的抗生素替代品成為研究的熱點(diǎn)[1-2]。

益生菌是一類能定殖于宿主腸道內(nèi)、能產(chǎn)生健康功效，改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱。目前微生態(tài)活菌制劑在對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中大多應(yīng)用于水質(zhì)調(diào)控，作為對(duì)蝦飼料添加劑以能耐高溫高壓的芽孢桿菌屬為主[3-6]。對(duì)蝦獨(dú)有的免疫系統(tǒng)，只能通過(guò)提高機(jī)體免疫力抵抗外界病害的侵襲。本研究從對(duì)蝦腸道中分離類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)，與雙歧桿菌(Bifidobacteriussp.)配伍制備益生菌，應(yīng)用于凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖，探討益生菌對(duì)對(duì)蝦生長(zhǎng)、機(jī)體免疫力和腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用益生菌為自行研制，成分組成：類芽孢桿菌和雙歧桿菌(比例為1∶1，菌體數(shù)2.2×109cfu/mL)，其中類芽孢桿菌由養(yǎng)殖對(duì)蝦腸道分離純化得到，雙歧桿菌由天津海河乳業(yè)的酸奶中分離得到。試驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦蝦苗由天津鑫永豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供。試驗(yàn)飼料為廣東海大集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)。

主要儀器：立式蒸汽滅菌器(上海迅博業(yè)實(shí)有限公司)，超凈工作臺(tái)(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，T100TMPCR儀(美國(guó)熱電公司)，ChemiDoc XRS凝膠成像儀(美國(guó)熱電公司)，DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

本試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)試驗(yàn)組(每千克飼料中加入0.1 mL益生菌)和1個(gè)對(duì)照組(未添加益生菌)。每組設(shè)3個(gè)平行，共計(jì)6個(gè)處理組。正式試驗(yàn)前，對(duì)蝦放于室內(nèi)海水循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)，并以試驗(yàn)對(duì)照飼料飽食投喂。暫養(yǎng)8 d后進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)，每個(gè)水族箱中投放蝦30尾。

28 d飼養(yǎng)試驗(yàn)，每日6:00、11:00、18:00和23:00按對(duì)蝦體質(zhì)量的5%～6%投喂，且根據(jù)對(duì)蝦的攝食情況適當(dāng)調(diào)整。各時(shí)間點(diǎn)投喂量占日總投餌量的比值分別為30%、20%、30%和20%。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，水溫25～27 ℃，鹽度25～26，pH 7.8～8.1，溶解氧>6 mg/L。

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，分別對(duì)每個(gè)重復(fù)對(duì)蝦進(jìn)行計(jì)數(shù)，稱量質(zhì)量，計(jì)算對(duì)蝦的存活率及特定生長(zhǎng)率：

成活率/%=Nt/N0×100%

特定生長(zhǎng)率/%·d-1= (lnmt——lnm0)/t×100%

式中，N0和Nt分別為每個(gè)重復(fù)對(duì)蝦初始尾數(shù)和終末尾數(shù)，m0和mt分別為初始體質(zhì)量和終末體質(zhì)量(g)，t為試驗(yàn)天數(shù)(d)。

1.2.1 對(duì)蝦血淋巴免疫學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

1.2.1.1 抗凝血的制備

從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取出5～6尾蝦，自腹竇取血，血淋巴與抗凝劑的比例為1∶2，離心10 min(3000 r/min，4 ℃)，所得上清液用于測(cè)定免疫指標(biāo)。

1.2.1.2 對(duì)蝦血清中過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性的測(cè)定

過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶的活性均采用南京建成試劑盒測(cè)定。

過(guò)氧化物酶的活性定義為：以37 ℃條件下，每毫升血清(血漿)每分鐘催化1 μg底物的酶量定義為1個(gè)酶活力單位 (U)。

以每毫升血清中超氧化物歧化酶抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的超氧化物歧化酶量為1個(gè)超氧化物歧化酶活力單位(U)。

以每毫升血清每分鐘生成1 nmol 一氧化氮為1個(gè)一氧化氮合酶活力單位(U)。

以1 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用30 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)酸性磷酸酶活力單位(U)。

以1 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用15 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)堿性磷酸酶活力單位(U)。

1.2.2 腸道菌群的變性梯度凝膠電泳分析

1.2.2.1 樣品的采集與處理

75%乙醇體表消毒，活體解剖，用鑷子擠壓腸道，將內(nèi)含物擠出，同時(shí)將腸道剪碎，一并放置于預(yù)冷的磷酸緩沖液中，4 ℃靜置2～4 h，3000 r/min離心10 min，將上清液放置于50 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集沉淀用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2.2 總DNA的提取與純化

采用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒(愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)，提取總DNA。DNA純化采用天根公司生產(chǎn)的通用型DNA純化回收試劑盒。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增

采用16S rDNA V3高變區(qū)序列的通用引物，進(jìn)行總DNA的PCR擴(kuò)增。引物：341F(5′段連接GC夾)：5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′，534R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。

采用降落 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 1 min，65 ℃，45 s，72 ℃，45 s，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1 ℃，當(dāng)退火溫度降至55 ℃ 后，再以該溫度擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃補(bǔ)平10 min[7]。PCR 產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2.4 變性梯度凝膠電泳

純化后的PCR產(chǎn)物上樣進(jìn)行8%的變性梯度凝膠電泳(變性梯度35%～55%)，溫度60 ℃，恒壓150 V，電泳6 h，溴化乙錠染液染色30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，進(jìn)行切膠。切完后放進(jìn)2 mL離心管內(nèi)，加入1 mL無(wú)菌水沖洗2次，沖洗完畢后加入30 μL超純水，-20 ℃冷藏過(guò)夜后，將離心管12 000 r/min離心10 min，取上清液作為變性梯度凝膠電泳條帶回收后的模板再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送至北京奧科鼎盛生物公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果通過(guò)Blast進(jìn)行比對(duì)分析，選取與PCR序列相似度最高的一個(gè)GenBank收錄序列，對(duì)比分析對(duì)照組和試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦腸道菌群。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)及存活率的影響

試驗(yàn)組的對(duì)蝦存活率和特定生長(zhǎng)率均高于對(duì)照組，說(shuō)明添加益生菌降低了凡納濱對(duì)蝦的死亡率，提高其特定生長(zhǎng)率(表1)。

表1 試驗(yàn)凡納濱對(duì)蝦存活率和特定生長(zhǎng)率

2.2 益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦5項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)的影響

添加益生菌組的凡納濱對(duì)蝦血清的過(guò)氧化物酶、超氧化物岐化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)(圖1～圖5)，其中試驗(yàn)組對(duì)蝦過(guò)氧化物酶、超氧化物岐化酶、一氧化氮合酶的活性均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，14 d以后升高緩慢，試驗(yàn)組對(duì)蝦的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性在14 d時(shí)均最高，28 d時(shí)略微下降，說(shuō)明該益生菌可以明顯提高凡納濱對(duì)蝦血清的非特異性免疫指標(biāo)，提高對(duì)蝦機(jī)體的免疫力。

圖1 益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清過(guò)氧化物酶活性的影響與對(duì)照組相比較，*P < 0.05, **P < 0.01.下同.

圖2 益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清超氧化物岐化酶活性的影響

圖3 益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清一氧化氮合酶活性的影響

圖4 益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清酸性磷酸酶活性的影響

圖5 益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清堿性磷酸酶活性的影響

2.3 益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響

對(duì)照組和試驗(yàn)組對(duì)蝦腸道細(xì)菌基因組圖譜見(jiàn)圖6，對(duì)蝦腸道菌群的16S rDNA電泳圖譜見(jiàn)圖7，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分析，結(jié)果見(jiàn)圖8、表2和表3。從圖譜中亮度和位置可看出二者不同的優(yōu)勢(shì)菌群的差異。對(duì)照組對(duì)蝦腸道的優(yōu)勢(shì)菌群主要是玫瑰桿菌(Rosebacter)和弧菌(Vibrio)，而試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦腸道中優(yōu)勢(shì)菌群主要是類芽孢桿菌、雙歧桿菌和弧菌等。對(duì)照組對(duì)蝦腸道的細(xì)菌種類主要屬于變形菌門，試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦腸道中的細(xì)菌種類屬于厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和變形菌門，微生物種類明顯增加，且益生菌占居優(yōu)勢(shì)地位。

圖6 試驗(yàn)凡納濱對(duì)蝦腸道細(xì)菌基因組圖譜1為對(duì)照組，2為試驗(yàn)組.

圖7 試驗(yàn)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的16S rDNA電泳圖譜1、2、3為對(duì)照組，4、5、6為試驗(yàn)組.

圖8 試驗(yàn)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的變性梯度凝膠電泳圖譜左側(cè)為對(duì)照組，右側(cè)為試驗(yàn)組.

編號(hào)比對(duì)相似度/%親緣關(guān)系CT1假交替單胞菌(Pseudoalteromonasnigrifaciens)(AB793704．1)89變形菌門CT2未能培養(yǎng)的γ?變形菌克隆(JX966218．1)95γ?變形菌門CT3弧菌(FR821229．1)98變形菌門CT4發(fā)光弧菌(KP319180．1)94變形菌門CT5未能培養(yǎng)的α?變形菌(JQ974826．1)92α?變形菌門CT6弧菌(JQ665318．1)94變形菌門CT7未能培養(yǎng)的細(xì)菌克隆(KF799155．1)98未知細(xì)菌CT8玫瑰桿菌(DQ479380．1)100變形菌門CT9未能培養(yǎng)的紅環(huán)菌科細(xì)菌克隆(GQ324225．1)94變形菌門CT10克雷伯菌屬(Klebsiella)(FJ823022．1)92γ?變形菌門CT11玫瑰桿菌(DQ479380．1)94變形菌門CT12未能培養(yǎng)的細(xì)菌克隆(KC884574．1)92未知細(xì)菌CT13未能培養(yǎng)的細(xì)菌克隆(JQ197251．1)90未知細(xì)菌CT14弧菌(FR821230．1)95變形菌門

表3 試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦腸道微生物16S rDNA-V3的序列分析

3 討 論

3.1 益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫功能的作用

益生菌為抗生素的替代品，應(yīng)用發(fā)展迅速[1,8-9]。在飼料中添加益生菌，不同程度提高了凡納濱對(duì)蝦的血清酚氧化酶活力、溶菌酶活力和總抗氧化力等免疫指標(biāo)[10-11]及淀粉酶、脂肪酶等消化酶活性[12]；在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中投入微生態(tài)制劑，明顯增強(qiáng)對(duì)蝦血清的酚氧化酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、抗菌活力和溶菌活力[13]。溫俊等[14]在飼料中添加合生素，研究了其對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群和免疫機(jī)能的影響，證實(shí)合生素能顯著提高凡納濱對(duì)蝦酚氧化酶活力和堿性磷酸酶活力。郝凱[15]分析了健康凡納濱對(duì)蝦的腸道微生物菌群，通過(guò)溶血試驗(yàn)、產(chǎn)酶試驗(yàn)、拮抗試驗(yàn)和安全性評(píng)價(jià)，篩選獲得3株潛在益生菌，分別為鮑魚(yú)希瓦氏菌(Shewanellahaliotis)、臘樣芽孢桿菌(B.cereus)和雙殼氣單胞菌(Aeromouasbivalvium)，通過(guò)在飼料中添加單一菌體和按一定比例混合的菌體，研究其對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫機(jī)能、生長(zhǎng)性能和抗病力的影響，結(jié)果表明，雙殼氣單胞菌能夠顯著性提高呼吸爆發(fā)活性、酸性磷酸酶活性和溶菌酶活力，混合菌組能夠顯著提高呼吸爆發(fā)活性和酸性磷酸酶活力，鮑魚(yú)希瓦氏菌和雙殼氣單胞菌能夠顯著上調(diào)proPO和LGBP基因的表達(dá)，混合菌能夠顯著上調(diào)PE-3a基因的表達(dá)，雙殼氣單胞菌和混合菌能夠顯著提高凡納濱對(duì)蝦的抗病力，不同處理組的凡納濱對(duì)蝦質(zhì)量增加顯著，其中混合菌的質(zhì)量增加效果最好。本研究也得到了類似的結(jié)果，益生菌能夠明顯增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦血清的過(guò)氧化物酶、超氧化物岐化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性，提高了對(duì)蝦的防病能力和成活率。

3.2 益生菌改善凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的作用

變性梯度凝膠電泳技術(shù)有無(wú)需培養(yǎng)、分辨率高、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、檢測(cè)速度快、同時(shí)檢測(cè)多種微生物等優(yōu)點(diǎn)，已成為微生物分子生態(tài)學(xué)研究的主要方法之一，廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，包括土壤、植物根系、海洋、溫泉、人體和動(dòng)物腸道等。王亭芳等[16]采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)分析7—9月凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中微生物的種類，優(yōu)勢(shì)種屬于變形菌門和厚壁菌門。溫俊等[14]研究發(fā)現(xiàn)，合生素能調(diào)節(jié)凡納濱對(duì)蝦腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定腸道的微生態(tài)環(huán)境。在飼料中添加中草藥和芽孢桿菌，投喂56 d后，發(fā)現(xiàn)中草藥和芽孢桿菌促進(jìn)了凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)，且共同添加的效果好于單獨(dú)添加，同時(shí)改變了對(duì)蝦腸道細(xì)菌的數(shù)量和組成[17]。張盛靜等[18]在飼料中添加地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)，研究其對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群、Toll 受體及溶菌酶基因表達(dá)量和抗哈維氏弧菌(V.harveyi)能力的影響，結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌可顯著提高對(duì)蝦抗哈維氏弧菌感染的能力，顯著降低對(duì)蝦腸道內(nèi)弧菌數(shù)量，感染哈維氏弧菌后，試驗(yàn)組溶菌酶mRNA 的相對(duì)表達(dá)量在12、18、24、36、48、72 h 均顯著高于對(duì)照組，試驗(yàn)組感染哈維氏弧菌后在6、12、18、24、36、48、72和7 d 的Toll 受體mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，推測(cè)地衣芽孢桿菌可能是通過(guò)降低對(duì)蝦腸道內(nèi)的弧菌量，并提高抗病相關(guān)基因的表達(dá)量，從而增強(qiáng)對(duì)蝦抗哈維氏弧菌感染的能力。筆者采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦腸道中菌群以變形菌門為主，試驗(yàn)組中對(duì)蝦腸道菌群則為4類菌群，可見(jiàn)外來(lái)微生物可明顯改變對(duì)蝦腸道的菌群組成。

4 結(jié) 論

通過(guò)在飼料中添加益生菌，研究凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、免疫學(xué)指標(biāo)和腸道菌群的變化，證實(shí)益生菌能明顯提高凡納濱對(duì)蝦的特定生長(zhǎng)率和存活率，增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦過(guò)氧化物酶、超氧化物岐化酶、一氧化氮合酶活性、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性，有效改善對(duì)蝦腸道菌群的組成，提高凡納濱對(duì)蝦的特定生長(zhǎng)率和存活率，不失為一種良好的對(duì)蝦用微生態(tài)制劑。

[1] Balcazar J L，Blas I de，Ruiz-Zarzuela I，et al. The role of probiotics in aquaculture [J]. Vet Microbiol，2006，114(3/4)：173-186.

[2] Thompson F L，Abreu P C，Cavalli R. The use of microorganisms as food source forPenaeuspaulensislarvae [J]. Aquaculture，1999，174(1/2):139-153.

[3] Gomez-Gil B，Roque A，Turnbull J F. The use and selection of probiotic bacteria for use in the culture of larval aquatic organisms [J]. Aquaculture，2000，191(1/3)：259-270.

[4] Ziaei-Nejad S，Habibi Rezaei M，Takami G A，et al. The effect ofBacillusspp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity，survival and growth in the Indian white shrimpFenneropenaeusindicus[J].Aquaculture，2006，252(2/4)：516-524.

[5] Rengpipat S，Rukpratanporn S，Piyatiratitivorakul S，et al. Immunity enhancement on black tiger shrimp (Penaeusmonodon) by a probiont bacterium (BacillusS11) [J]. Aquaculture， 2000，191(4)：271-288.

[6] Ochoa-Solano J L，Olmos-Soto J. The functional property ofBacillusfor shrimp feeds [J]. Food Microbiol，2006，23(6)：519-525.

[7] 劉淮德，王雷，王寶杰，等. 應(yīng)用PCR-DGGE分析南美白對(duì)蝦腸道微生物多樣性[J]. 飼料工業(yè)，2008，29(20)：55-58.

[8] 吳雅琨，楊欣，陳麗仙，等.羅非魚(yú)腸道益生菌的篩選、鑒定及其抑菌性能研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2011,30(10):613-618.

[9] 關(guān)曉燕，李麗麗，董穎，等.一株芽孢桿菌的分離、鑒定及其對(duì)仿刺參免疫的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2015，34(9)：565-570.

[10] 胡毅，譚北平，麥康森，等. 飼料中益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、腸道菌群及部分免疫指標(biāo)的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2008，15(2)：244-251.

[11] 劉迪，董曉慧，譚北平，等. 嗜酸乳桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、免疫力和抗病力的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2016,35(1):37-42.

[12] 鄭曉婷，段亞飛，董宏標(biāo)，等. 植物乳酸桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、消化酶活性和腸道組織形態(tài)的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2016,35(1):1-6.

[13] 隋大鵬. 微生態(tài)制劑對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)和非特異性免疫因子影響的研究[D]. 青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2003，44-68.

[14] 溫俊，孫鳴，孫冬巖. 合生素對(duì)南美白對(duì)蝦腸道菌群和免疫機(jī)能的影響[J].飼料研究，2008(10)：53-55.

[15] 郝凱. 南美白對(duì)蝦專用益生菌研究[D]. 西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[16] 王亭芳，金風(fēng)杰，馬士禹，等. DGGE技術(shù)對(duì)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中微生物多樣性的研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2012，28(10)：131-136.

[17] 于明超，李卓佳，林黑著，等. 飼料中添加芽孢桿菌和中草藥制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)及腸道菌群的影響[J]. 熱帶海洋學(xué)報(bào)，2010，29(4)：132-137.

[18] 張盛靜，趙小金，宋曉玲，等. 飼料添加益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群、Toll 受體及溶菌酶基因表達(dá)及抗感染的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2016，23(4)：846-854.

EffectsofProbioticsonImmunologicFunctionsandIntestinalMicroflorainPacificWhiteLegShrimpLitopenaeusvannamei

MENG Xiaopeng, MENG Yang, WANG Yue, YANG Shuo, YUAN Chunying, CUI Qingman

( Tianjin Key Laboratory of Marine Resource and Chemistry, College of Marine & Environment, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China )

In this paper, bacillus and bifidobacteria were added to the feed of Pacific white leg shrimpLitopenaeusvannamei(average body weight of 3.45 g), and fed for 4 weeks, and the effects of probiotics on immunologic functions and intestinal microflora ofL.vannameiwas studied by Nanjing Jiancheng kit and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) technology. The results showed that probiotics led to increase activities of peroxidase (control group, 43.22 U/mL; experimental group, 76.33 U/mL), superoxide dismutase (control group, 60.61 U/mL; experimental group, 101.18 U/mL), nitric oxide synthase (control group, 7.54 U/mL; experimental group, 12.44 U/mL), acid phosphatase (control group, 0.0446 U/mL; experimental group, 0.0574 U/mL) and alkaline phosphatase (control group, 0.0183 U/mL; experimental group, 0.0236 U/mL) in Pacific white leg shrimp, obviously improved intestinal bacterial group composition of the shrimp, and the ability of shrimp to resist disease.

Paenibacillussp.;Bifidobacteriumsp.;Litopenaeusvannamei; immunologic function; intestinal microflora

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.01.010

S968.22

A

1003-1111(2017)01-0060-06

2016-01-21；

2016-04-18.

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2011GA610005).

孟霄鵬(1992—)，男，碩士研究生；研究方向：海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用. E-mail：meng12@mail.tust.cn. 通訊作者：袁春營(yíng)(1965—)，男，副教授；研究方向：海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用. E-mail：ycy201388@163.com.