魚類DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用進展

陳信忠，郭書林，龔艷清

( 廈門出入境檢驗檢疫局，福建 廈門 361026 )

魚類DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用進展

陳信忠，郭書林，龔艷清

( 廈門出入境檢驗檢疫局，福建 廈門 361026 )

魚類；DNA條形碼；物種鑒定；魚類產(chǎn)品標(biāo)識；進展

基于DNA序列進行物種鑒定的DNA條形碼技術(shù)自2003年問世以來，經(jīng)過十幾年的快速發(fā)展，不僅在各種動植物的物種鑒定方面取得巨大成就，而且在動植物區(qū)系、生態(tài)和物種保護、生物安全、食品安全等方面得到越來越多的應(yīng)用，并取得一系列成果。魚類是最具多樣性的脊椎動物，全球預(yù)計有多達40000種魚類[1]。由于在發(fā)展過程中具有高度的多樣性，傳統(tǒng)的魚類物種鑒定方法存在很多問題。DNA條形碼在魚類物種鑒定中最早獲得應(yīng)用。2005年開始實施的魚類生命條形碼計劃(FISH-BOL)是一項國際合作計劃，通過采用經(jīng)過權(quán)威的分類鑒定的標(biāo)本，研究魚類線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ亞基(COⅠ)基因，以電子數(shù)據(jù)庫形式構(gòu)建含有DNA條形碼、圖像和地理坐標(biāo)的全球魚類參考標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用DNA條形碼簡化魚類識別工作，重點解決傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法無法鑒別的難題。魚類生命條形碼計劃還特別關(guān)注市場上物種替代和商業(yè)漁業(yè)管理等社會問題[2]。魚類DNA條形碼在瀕危物種保護，防止外來物種入侵等方面也得到越來越多的應(yīng)用。不過，該技術(shù)在魚類近緣物種以及亞種水平的鑒定方面還有一定的局限性。我國的魚類DNA條形碼研究相對較少，目前主要在少數(shù)魚類鑒別以及小流域魚類區(qū)系方面取得一些進展，在其他領(lǐng)域的應(yīng)用還很少，尚未建立系統(tǒng)、完善的數(shù)據(jù)庫。但我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖和漁業(yè)大國，也是觀賞魚主要生產(chǎn)國和出口國。我國每年引進大量的魚類物種進行人工繁育和種質(zhì)資源改良。另一方面，我國有眾多不同的水域環(huán)境和魚類區(qū)系。因此，應(yīng)用最新的魚類鑒別和分類技術(shù)，對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展以及魚類資源和生態(tài)環(huán)境的保護等方面均具有重要指導(dǎo)意義。

1 魚類DNA條形碼的應(yīng)用

1.1 DNA條形碼在魚類分類中的應(yīng)用

魚類DNA條形碼最重要的作用就是對魚類進行準(zhǔn)確鑒別，彌補傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法的不足，發(fā)現(xiàn)或糾正傳統(tǒng)分類學(xué)中隱含的錯誤，明確全球主要水域的魚類的種類、發(fā)展歷史以及與生態(tài)環(huán)境的相互作用，為有效利用魚類資源，保護魚類多樣性提供科學(xué)依據(jù)。DNA條形碼技術(shù)與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法相結(jié)合，不僅可以快速、準(zhǔn)確的對物種進行鑒定和分類，還可能發(fā)現(xiàn)許多潛在的物種。以DNA條形碼為主要技術(shù)的魚類生命條形碼系統(tǒng)為魚類學(xué)學(xué)科理解各種魚類的自然史和生態(tài)相互作用提供了一個有力的工具。

理想的DNA條形碼首先要求具備適宜的序列變異水平，可以區(qū)分不同物種而且種內(nèi)變異較小；其次，要求變異區(qū)域兩端具有高度保守的序列，可以設(shè)計通用的擴增引物；第三，還要求較短的擴增序列。根據(jù)已有研究，COⅠ基因是魚類分類與鑒別的理想DNA條形碼[3]。魚類生命條形碼計劃已對已知的31 000種魚類中的8000種魚類的COⅠ基因條形碼進行了測定，這些魚類涵蓋了全球絕大多數(shù)重要的商業(yè)物種?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，應(yīng)用COⅠ條形碼可以有效區(qū)分約98%的海洋魚類和93%的淡水魚類[1]。除了COⅠ基因，其他可用于魚類DNA條形碼的基因包括細胞色素B(Cyt B)、NADH脫氫酶亞單位2(ND2)和蘭尼定受體3(RYR3)等[4]。但由于COⅠ基因比其他基因更適合作為魚類鑒別的基因條形碼，可以鑒別絕大多數(shù)魚類，因此至今針對其他基因條形碼的研究還很少。

1.2 DNA條形碼在魚類區(qū)系研究中的應(yīng)用

DNA條形碼技術(shù)對構(gòu)建不同國家和地區(qū)的江河湖海等流域的魚類區(qū)系數(shù)據(jù)庫具有重要價值。全球魚類種群和數(shù)量最豐富的地區(qū)包括南美洲、非洲和亞洲等地區(qū)。近年來南美地區(qū)魚類區(qū)系的研究報告相對較多。Decru等[5]比較了DNA條形碼和傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)鑒定剛果東北流域的魚類區(qū)系的差異。比較了206種通過形態(tài)學(xué)識別的物種及其821例COⅠ序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有26.1%的樣品種內(nèi)遺傳距離小于1，表明依據(jù)形態(tài)學(xué)分類可能存在錯誤，發(fā)現(xiàn)了4個可能的同物異名。有6科10屬的物種，通過COⅠ序列確定的物種數(shù)量超過了使用形態(tài)特征推斷的物種數(shù)量，提示存在潛在物種。巴西東南部新熱帶區(qū)估計存在約110種本土或非本土物種，其中有很多當(dāng)?shù)氐奶赜蟹N，需要優(yōu)先開展保護。Pugedo等[6]綜合利用DNA條碼技術(shù)和傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法，對該地區(qū)采集的260條魚的DNA條碼進行鑒別，結(jié)果顯示這些魚類屬于35屬52種，其中包括瀕危物種如巴西雷氏鲇(Rhamdiajequitinhonha)和油鲇(Steindachneridionamblyurum)。有5種魚類種內(nèi)遺傳變異大于 2%，最大的達到11.43%，提示存在潛在的新物種。Gomes等[7]應(yīng)用DNA條形碼鑒定了巴西穆庫里河流域的37種魚類，涵蓋該地區(qū)75%的魚類。在吉伯特駝背脂鯉(Cyphocharaxgilbert)和大頭麗脂鯉(Astyanaxbimaculatus)中發(fā)現(xiàn)了兩種潛在的物種。Díaz等[8]對南美洲巴拉那河79種淡水魚進行鑒別，成功率為97.8%，部分魚類種內(nèi)距離達7.59%，可能存在潛在物種。Rosso等[9]發(fā)現(xiàn)阿根廷潘帕平原的黃金河虎(Salminusbrasiliensis)的種內(nèi)差異高達6%，而且在形態(tài)上也存在明顯差別，因此可能存在潛在的物種。該地區(qū)代表性的魚類黃金河虎、克林雷氏鲇(R.quelen)等7種魚類與其在南美洲其他地區(qū)采集的同種個體的遺傳距離相差超過3%，表明這些魚類的COⅠ序列組成具有顯著的地域性。

雖然魚類是研究最深入的海洋生物類群之一，但應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)仍有新的物種被發(fā)現(xiàn)。Osterhage等[14]在澳大利亞北部，通過形態(tài)學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)了一種新的海蛾魚(Pegasussp.)。新物種與已知的該海域的另一種海蛾魚(P.volitans)的一些重要特征存在明顯差異。進一步的COⅠ和16S基因條形碼證據(jù)也證明兩者為兩個獨立的物種。

1.3 DNA條形碼在魚類幼體和卵鑒定中的應(yīng)用

由于很多魚類的卵和幼體的形態(tài)十分相似，通過形態(tài)學(xué)很難準(zhǔn)確鑒定物種，而DNA條形碼技術(shù)在此發(fā)揮了獨特的作用。Steinke等[19]在南非獲得了2526例魚類幼體和浮性卵的COⅠ基因序列，另外從946種魚類的3215條成魚中也獲得了COⅠ序列。利用BOLD基于成魚的COⅠ序列，89%的卵和幼體可準(zhǔn)確鑒定到物種水平，涵蓋450種魚類。大多數(shù)不確定的序列也可以鑒定到屬、科或目，只有92例無法鑒定。這些魚類有1006種，占南非水域所有已知魚類的43%。還發(fā)現(xiàn)了此前南非未被記錄的189種魚類。證明了FishBoL建立的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫鑒定魚類的能力和完整性。Frantine-Silva等[20]對巴西南部的293種魚卵和243種幼魚的COⅠ基因進行測序，并提交BOLD-IDS進行相似性比較，在設(shè)定閾值為1.3%時，可以鑒定出99.25%的物種，其中23.8%的魚類為該地區(qū)的新記錄。證明DNA條形碼在鑒別魚類幼體的有效性，可以為制訂新熱帶地區(qū)內(nèi)陸水域養(yǎng)護和管理計劃提供有價值的信息。Becker等[21]使用傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)和DNA條形碼兩種方法鑒別來自兩個新熱帶區(qū)的魚類幼體。形態(tài)學(xué)方法鑒定正確率只有25%，而DNA條形碼技術(shù)可以進行準(zhǔn)確鑒定。

1.4 DNA條形碼在漁業(yè)管理方面的應(yīng)用

隨著全球水產(chǎn)品需求量的快速增長，全球漁業(yè)年產(chǎn)值估計已達2000億美元。由于捕撈技術(shù)的持續(xù)改進，魚類自然資源面臨著嚴(yán)峻的考驗。尤其是人類對魚類自然生境的影響和破壞，使得全球漁業(yè)資源受到嚴(yán)重影響。為了漁業(yè)資源的可持續(xù)發(fā)展，各國都在采取各種措施，加強漁業(yè)管理。漁業(yè)管理需要依賴堅實的分類基礎(chǔ)。應(yīng)用魚類DNA條形碼，可以明確本地區(qū)擁有的魚類物種種類和分布，了解每種魚類的多樣性或瀕危度，并發(fā)現(xiàn)一些新物種和外來物種，為制定有效的管理和保護措施提供科學(xué)依據(jù)。

目前這方面的研究報告還不多。非洲坦噶尼喀湖擁有全球最豐富的魚類資源，尤其是慈鯛科魚類十分豐富，而且每年都能發(fā)現(xiàn)新的慈鯛。但因缺乏有效的監(jiān)管措施，該湖的魚類資源因為無節(jié)制的捕撈而遭受嚴(yán)重破壞。Breman等[22]對該湖的96 種形態(tài)種慈鯛的398個COⅠ條形碼進行分析，采用通用混合Yule溯祖模型(GMYC)分析提示可能有70個物種，而自動條碼間隙發(fā)現(xiàn)方法(ABGD)發(fā)現(xiàn)了115種物種。顯然，該湖擁有更多潛在的慈鯛物種。雖然自動條碼間隙發(fā)現(xiàn)方法有劃分過細的傾向，但在物種分類方面優(yōu)于混合Yule溯祖模型。坦噶尼喀湖慈鯛有復(fù)雜的演化歷史，包括地理變異、雜交、基因滲入和快速的物種形成等。因此，DNA條形碼具有發(fā)現(xiàn)慈鯛新物種的潛力，可以為制定相關(guān)保護措施提供參考。

巽他古陸已報告的淡水魚類有899種，近50%為當(dāng)?shù)靥赜蟹N。但由于人類活動與生態(tài)的改變，導(dǎo)致魚類種群數(shù)量顯著下降。Dahruddin等[23]建立了爪哇和巴厘島魚類的DNA條碼數(shù)據(jù)庫，涵蓋159種魚類。與歷史上的物種名錄相比，根據(jù)DNA條形碼得到的物種數(shù)量大幅減少，爪哇和巴厘島分別只有77種和24種。主要原因可能是滅絕、同物異名，也有一些可能是之前形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果有誤。這些數(shù)據(jù)可以為該區(qū)域的漁業(yè)資源管理提供指導(dǎo)。

1.5 DNA條形碼在魚類產(chǎn)品標(biāo)識中的應(yīng)用

近年來市場上鱈魚、三文魚、石斑魚等高檔魚類產(chǎn)品被誤貼或錯貼標(biāo)識，已成為公眾關(guān)注的議題。為了獲得經(jīng)濟利益，一些不法商人以低價值物種替代高價值物種，以次充好，嚴(yán)重損害了消費者的利益。更為嚴(yán)重的是，一些水產(chǎn)制品加工原料中混入有毒魚種而導(dǎo)致食物中毒。還有一些魚類含有對人體健康有危害的有毒物質(zhì)。因此，水產(chǎn)品物種鑒別不僅關(guān)系到經(jīng)濟利益和商業(yè)誠信，而且關(guān)系到食品安全，也是對食品行業(yè)和監(jiān)管機構(gòu)的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。對水產(chǎn)制品生產(chǎn)用原料，尤其是對失去形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的魚類，包括有毒魚種進行準(zhǔn)確鑒定是食品安全、國際貿(mào)易和商業(yè)零售業(yè)亟待解決的問題。DNA條形碼技術(shù)，為水產(chǎn)品尤其是深度加工的水產(chǎn)品物種鑒定和甄別提供了先進手段。可以作為科學(xué)名稱與市場名稱、以及監(jiān)管機構(gòu)授權(quán)執(zhí)行標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)的橋梁。DNA條形碼已經(jīng)被美國食品藥品管理局等政府機構(gòu)用于水產(chǎn)品鑒定。

金槍魚是一種高價值的食用魚類，深受消費者的喜愛。但一些大眼金槍魚(Thunnusobesus)和藍鰭金槍魚(T.maccoyii)體內(nèi)的汞含量可能超過或接近加拿大、歐盟、日本、美國和世界衛(wèi)生組織的允許水平。這些汞可能對人類的神經(jīng)系統(tǒng)、感覺運動和心血管功能帶來損害。Lowenstein等[24]應(yīng)用DNA條形碼對用于汞含量測定的金槍魚壽司樣本進行分析，確認(rèn)樣本的種類和來源，為監(jiān)管機構(gòu)更準(zhǔn)確地評估消費者的食用風(fēng)險，制定更好的健康保護政策提供依據(jù)。

很多國家都存在魚類加工產(chǎn)品錯貼標(biāo)識的現(xiàn)象。Di Pinto等[25]采用DNA條形碼檢測了意大利市場上銷售的鱈魚和鰈魚產(chǎn)品，結(jié)果120個樣品中有6個不符合。標(biāo)稱為“面包鰈魚”的樣本含有巖鰈(Lepidopsettapolyxystra)和智利無須鱈(Merlucciusgayi)。Helyar等[26]使用DNA條碼和實時PCR探針兩種方法對英國大型連鎖超市銷售的386份大西洋鱈(Gadusmorhua)和黑線鱈(Melanogrammusaeglefinus)進行檢測。盡管還有相當(dāng)一部分產(chǎn)品被誤貼標(biāo)簽，但總體的正確標(biāo)記率達到94.34%。Cawthorn等[27]對南非的餐館和零售商收集的149個魚類進行鑒定，結(jié)果餐館和零售商的樣品標(biāo)簽誤貼率分別為18%和19%。Hanner等[28]從加拿大大都市地區(qū)眾多的零售機構(gòu)采集了254份海鮮樣品進行DNA條形碼分析，并與加拿大食品檢驗署的“魚類列表”進行對照，發(fā)現(xiàn)有41%的樣品被誤貼標(biāo)簽。

國際貿(mào)易中也常常發(fā)生魚類貼錯標(biāo)簽的問題。進口魚類產(chǎn)品時常常不使用規(guī)范的學(xué)名，或者不同產(chǎn)品使用相似的名稱。Yan等[29]對我國進口的標(biāo)稱為短體羽鰓鮐(Rastrelligerbrachysoma)的魚類進行鑒定。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和COⅠ基因序列分析，該批魚屬于細尾副葉鲹(Alepesapercna)而非短體羽鰓鮐。DNA條形碼提供了一種實用的防止國際貿(mào)易欺詐的方法。

在DNA條形碼技術(shù)的改進方面也取得了一些進展。Tagliavia等[30]針對海鮮產(chǎn)品開發(fā)了一種快速DNA提取方法，可以對任何海鮮產(chǎn)品進行快速處理，并通過PCR方法進行海鮮成分的鑒定。Shokralla等[31]依據(jù)COⅠ基因片段設(shè)計了6對微型條形碼引物，建立了一種微型DNA條形碼系統(tǒng)，用于檢測北美洲所有常見的魚類加工產(chǎn)品。應(yīng)用該微型條碼引物對測試了44種有代表性的魚產(chǎn)品，有41種可以在物種或?qū)俚乃竭M行鑒定。單個引物對微型條形碼最大的鑒定成功率為88.6%，相比之下，全長DNA條形碼引物對的鑒定成功率只有20.5%。

隨著消費者對水產(chǎn)品需求的增加和對海洋健康的關(guān)注，已經(jīng)越來越強調(diào)貿(mào)易措施以防止非法來源的魚和魚產(chǎn)品進入國際市場。歐盟要求在整個分銷鏈上對捕獲的魚和魚產(chǎn)品的物種名稱進行明確標(biāo)示，確保消費者能做出有意識的選擇。

1.6 DNA條形碼在瀕危魚類物種保護中的應(yīng)用

生物保護規(guī)劃首先需要明確當(dāng)?shù)氐奈锓N資源，而且必須對過去和現(xiàn)有的物種進行統(tǒng)計和分析，即需要有完整的生物多樣性知識。通過建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，可以了解物種的瀕危程度，進而確定需要優(yōu)先保護的候選物種。Geiger等[32]對地中海的淡水魚區(qū)系DNA條碼庫(526種)進行了分析，覆蓋498種，占現(xiàn)存種類的98%。為建立一個物種保護的識別系統(tǒng)，對3165例分類學(xué)家確定的物種的DNA條碼進行了聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)遺傳形態(tài)的不連續(xù)性，表明可能有64個以前未確認(rèn)的潛在物種。通過計算物種的瀕危分值確定了需要優(yōu)先保護的候選物種。

非法貿(mào)易極大地影響了魚類種群，降低了世界范圍內(nèi)的魚類多樣性。盡管已經(jīng)有許多水生物種被列入監(jiān)管和保護名錄，但仍然有一些干燥或加工的水產(chǎn)品，如魚翅等因為缺乏關(guān)鍵的形態(tài)特征而通過國際貿(mào)易進行非法交易。還有一些觀賞魚類或魚類幼體等，因為難以依據(jù)形態(tài)準(zhǔn)確確認(rèn)物種名稱而被非法貿(mào)易。因此，DNA條形碼的應(yīng)用被認(rèn)為是監(jiān)管和懲處水生動物非法交易，保護瀕危魚種的重要手段。

隨著鯊魚產(chǎn)品消費量的增加，導(dǎo)致某些鯊魚種群的減少。Chuang等[34]對臺灣漁船捕獲的231條鯊魚、零售商店的316例魚翅以及臺灣海關(guān)扣留的113例魚翅等產(chǎn)品進行物種鑒定，結(jié)果分別有23、24和14種鯊魚。超過60%的零售魚翅物種在漁獲鯊魚中也有發(fā)現(xiàn)，表明臺灣市場上魚翅產(chǎn)品大部分來自本土，但也有一定比例的國際貿(mào)易產(chǎn)品，有4種魚翅產(chǎn)品在臺灣水域從未發(fā)現(xiàn)。海關(guān)扣留的樣品中也發(fā)現(xiàn)了一些本土的物種。除了物種鑒定，還發(fā)現(xiàn)了狐形長尾鯊(Alopiasvulpinus)等鯊魚在COⅠ基因的地理分化。該結(jié)果可以讓漁業(yè)當(dāng)局更有效地跟蹤鯊魚的起源，加強這些鯊魚的管理和保護。

由于目前很多觀賞魚都來自野外采集，盡管已出臺許多針對瀕危物種貿(mào)易的監(jiān)管政策，還有很大一部分世界自然保護聯(lián)盟名錄中的物種未得到有效保護，主要原因是難以準(zhǔn)確鑒定物種。因為觀賞魚交易時常常使用多個商品名稱，而不是科學(xué)的學(xué)名。Dhar等[35]在對印度出口的觀賞魚品種進行研究時，發(fā)現(xiàn)51種觀賞魚中，有17種屬于瀕危物種，有14種有多個貿(mào)易名稱。因此，發(fā)展物種的DNA分子標(biāo)記刻不容緩，可以有效管理觀賞魚貿(mào)易，滿足保護瀕危物種的需求。

梅氏食蚊脂鯉(Lignobryconmyersi)是分布于巴西東北部的一種瀕危淡水魚。盡管巴西法律禁止捕撈，但因為當(dāng)?shù)厝朔浅Ｏ矚g，偶爾可以在街頭市場發(fā)現(xiàn)該魚。Rodrigues等[36]通過準(zhǔn)確測定不同地區(qū)的梅氏食蚊脂鯉COⅠ序列，并與市場上容易混淆的石斧脂鯉(Triportheussp.)和斑條麗脂鯉(Astyanaxfasciatus)等相關(guān)魚類進行比較?？梢源_認(rèn)市場上梅氏食蚊脂鯉的原產(chǎn)地，從而為查處非法交易和保護該瀕危魚類提供依據(jù)。

1.7 DNA條形碼在防止外來魚類物種入侵中的應(yīng)用

對水生動物國際貿(mào)易管理不善，可能導(dǎo)致外來物種和外來病原體的入侵，對生物多樣性和經(jīng)濟活動帶來極大風(fēng)險。跟蹤和記錄外來入侵物種，需要強大的鑒定工具來支持。DNA條形碼技術(shù)提供了一種有效的識別入侵物種的方法，使得相關(guān)管理部門有能力識別高風(fēng)險魚類，并加強監(jiān)管措施。但由于目前國際貿(mào)易中很多國家對魚類的物種鑒定沒有引起足夠的重視，加上所使用的商品名稱多而混亂，因此在國際貿(mào)易中開展魚種鑒定的還很少。

鱧魚俗稱黑魚，原產(chǎn)于亞洲和非洲，可能成為很多地區(qū)具有重大威脅的入侵物種。至少有烏鱧(Channaargus)、斑鱧(C.maculata)和眼鱧(C.marulius)等3種黑魚被認(rèn)為已進入北美并建立了種群，但其來源仍然不清楚。Serrao等[37]對25種黑魚的121個組織樣本的DNA條形碼進行研究，并結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫的36種相關(guān)物種的序列進行聚類分析，結(jié)果出現(xiàn)49個分支，提示可能存在潛在的物種多樣性。研究結(jié)果表明，DNA條形碼技術(shù)可以為推斷入侵途徑提供有用的依據(jù)。Knebelsberger等[38]對涵蓋德國列入瀕危動物紅皮書的近80%的魚類的DNA條形碼進行分析。結(jié)果將德國潛在的外來物種數(shù)量從14增至21，為進一步開展區(qū)系調(diào)查打下基礎(chǔ)。

1.8 DNA條形碼在鑒別觀賞魚類物種中的應(yīng)用

隨著生活水平的提高，全球觀賞魚愛好者也越來越多。觀賞魚產(chǎn)業(yè)和國際貿(mào)易飛速發(fā)展。由于觀賞魚種類繁多，經(jīng)濟價值相差巨大，因此對觀賞魚物種的快速鑒定，成為觀賞魚國際貿(mào)易中迫切需要解決的難題。雖然目前約80%的觀賞魚來自人工繁育，但絕大多數(shù)觀賞魚的原產(chǎn)地來自非洲、南美洲以及東南亞部分國家和地區(qū)。近年來觀賞魚類DNA條形碼取得了一些進展，但還有很多觀賞魚尚未建立有效的DNA條形碼。

印度的海洋觀賞魚種類十分豐富，被大量出口到世界各地。因這些魚類在不同發(fā)育階段變化很大，在現(xiàn)場很難準(zhǔn)確識別，DNA條形碼技術(shù)被用來識別物種。Bamaniya等[39]分析了印度31種具有重要商業(yè)價值的海洋觀賞魚類，其種內(nèi)平均遺傳距離為0.446，但來自不同地理位置的同一種觀賞魚的種內(nèi)變異增加了15～20倍。因此，該地區(qū)可能存在異域品系或潛在的物種。Dhar等[35]對來自印度東北部不同出口商的128種出口觀賞魚樣品進行DNA條形碼和形態(tài)學(xué)研究。其中84個樣品被直接鑒定為35種，有44個樣品僅僅基于COⅠ條形碼很難區(qū)分。但通過形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，可以確認(rèn)這些樣品屬于16種。Kowasupat等[40]基于COⅠ和ITS1序列，認(rèn)為在泰國除了已發(fā)現(xiàn)的原種泰國斗魚(Bettasplendens)等5種斗魚以外，至少還有3種潛在的斗魚。

鉛筆魚是觀賞魚市場上常見的觀賞魚。國際貿(mào)易中常見的鉛筆魚有20種，絕大部分來自亞馬遜河流域，鉛筆魚的分類仍然存在很多問題。Benzaquem等[41]對14種鉛筆魚的COⅠ基因進行分析，標(biāo)稱為二線鉛筆(Nannostomusdigrammus)、三線鉛筆(N.trifasciatus)、單線鉛筆(N.unifasciatus)和騎士鉛筆(N.eques)的樣品存在很大的聚類差異，提示可能存在潛在的鉛筆魚物種。尤其是二線鉛筆和三線鉛筆的分歧值很高，其同種地位值得懷疑。

DNA條碼可以對形態(tài)學(xué)上有爭議的物種進行準(zhǔn)確分類。線紋脂鯉屬(Nematocharax)是一個有爭議的單種屬，是一種雌雄異型的熱帶魚，存在遺傳和形態(tài)的多樣性。Barreto等[42]通過對巴西7個種群的維納斯線紋脂鯉(N.venustus)的COⅠ序列和形態(tài)分析，認(rèn)為這些種群至少已經(jīng)分化為5種獨立的線紋脂鯉。這些遺傳分化種存在顯著的形態(tài)差異。表明線紋脂鯉屬已經(jīng)不是一個單種屬。因此建議在巴西東北部受影響最多的沿海盆地應(yīng)優(yōu)先建立保護計劃。

1.9 DNA條形碼在其他方面的應(yīng)用

生態(tài)監(jiān)測有助于對復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)功能的理解。魚類食譜反映了其周圍環(huán)境和棲息地的狀態(tài)，因此可以作為環(huán)境狀況的有用的指標(biāo)。但由于消化作用，通常難以在的物種水平視覺識別腸道內(nèi)容物。Jo等[46]采用COⅠ DNA條形碼技術(shù)對塔斯馬尼亞湖褐鱒(Salmotrutta)的腸道內(nèi)容物的物種身份進行鑒定，獲得了44個獨特的分類群(OTU)。與肉眼識別相比，DNA分析方法具有更高的精度，還可以分辨出比肉眼識別方法多1.4倍的分類群。研究結(jié)果表明，魚類食譜的DNA條形碼是發(fā)現(xiàn)潛在的生物多樣性的一個有益的補充。

海洋魚類在其發(fā)育過程中表現(xiàn)出顯著的表型改變，其早期幼體因為缺乏明顯的形態(tài)特征而很難在物種水平進行鑒別。但魚類幼體的生態(tài)學(xué)特征，對珊瑚礁魚類的保護計劃十分重要。Hubert等[47]將DNA條形碼應(yīng)用于珊瑚礁魚類的保護計劃中，在莫雷阿島10個站點開放水域收集仔魚，測定了505條仔魚的DNA條形碼，其中373條被鑒定到物種水平。涵蓋106種魚類，有11種為遠洋和深海物種，另外95種可以在鄰近的珊瑚礁發(fā)現(xiàn)對應(yīng)的成年魚。

2 魚類DNA條形碼應(yīng)用存在的主要問題

魚類DNA條形碼對一些近緣種的鑒定能力有待提高。目前魚類DNA條形碼主要依據(jù)COⅠ基因序列，對其他基因的研究還很少，但COⅠ基因?qū)σ恍┙壏N的鑒定方面顯然存在很大的不足。Hanner等[28]對最近確認(rèn)的10種旗魚用DNA條形碼進行鑒定，其中5種旗魚很容易區(qū)分。但條紋馬林魚(Kajikiaaudax)等5種旗魚因COⅠ序列高度相似而難以區(qū)分。Knebelsberger等[38]分析了來自德國各大水系的92種魚類的COⅠ序列，依據(jù)DNA條形碼只有78%的物種可以準(zhǔn)確鑒定。針對這些近緣物種，需要研究進化更快的基因作為DNA條形碼，也可以建立其他的分子生物學(xué)方法。Overdyk等[48]建立了實時PCR方法，可以特異性識別鯡形白鮭(Coregonusclupeaformis)的幼體，并可在現(xiàn)場應(yīng)用。

魚類DNA條形碼對種以上階元的鑒定存在局限性，即對亞種水平的鑒定能力十分有限。魚類表型變異受環(huán)境等因素的影響很大，因此魚類種群的形態(tài)識別有時會被證明非常困難。即使具備一些高度保守的表型變異，但由于其基因序列變異很小而難以選擇合適的DNA標(biāo)記。亞洲龍魚(Scleropagesformosus)屬于骨舌魚科，是原產(chǎn)于東南亞的一種高價值觀賞魚，因體色和斑紋不同而被分為紅龍、金龍和青龍等多個品種，其欣賞價值和經(jīng)濟價值差別巨大，但至今尚未闡明這些品種之間的系統(tǒng)關(guān)系。Mohd-Shamsudin等[49]利用Cyt B和COⅠ基因分析不同品種龍魚的遺傳關(guān)系，結(jié)果表明體色變化與COⅠ或Cyt B基因分化程度沒有關(guān)系，因此無法根據(jù)這兩個基因來確定龍魚的品種。Mu等[50]發(fā)現(xiàn)3個品種的亞洲龍魚的12S rRNA、16S rRNA和COX3基因序列變化范圍分別達到1.66%、2.4%和3.2%，但分子變異主要發(fā)生在品種內(nèi)。表明亞洲龍魚出現(xiàn)了顯著的遺傳分化，但因為遺傳距離較小，不適合品種之間鑒別的分子標(biāo)記。

魚類生命條形碼計劃等數(shù)據(jù)庫的資料還有待補充和完善。雖然經(jīng)過十多年的發(fā)展，BOLD在物種水平已經(jīng)登錄了259 990種動物的5 203 877條COⅠ DNA條形碼序列，但相對于數(shù)量龐大的生物種類來說，該數(shù)據(jù)庫資料還遠未完善。尤其對觀賞魚以及很多外來的人工繁育的生產(chǎn)性魚類，因為完整的DNA條形碼需要提供地理分布等信息，這些魚類的DNA條形碼數(shù)據(jù)還很少，因而影響了條碼的分辨率。Hanner等[28]在鑒別加拿大海鮮產(chǎn)品時發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)樣品很容易確定，但有部分樣品因為條碼的分辨率有限或不完善，結(jié)果無法確定。

3 展 望

魚類DNA條形碼解決了很多傳統(tǒng)分類學(xué)無法解決的難題，推進了魚類分類學(xué)和生態(tài)學(xué)的發(fā)展，在食品安全、生物安全以及魚類資源保護等方面也取得很多應(yīng)用成果。但該技術(shù)的應(yīng)用時間還很短，還存在一些不足或需要解決的問題。雖然傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法有很多局限性，但傳統(tǒng)分類方法和新的分類方法相結(jié)合，對完整理解、評估和保護魚類的多樣性都是必要的。研究表明，生態(tài)學(xué)家、分類學(xué)家、分子生物學(xué)家和地球科學(xué)家等科學(xué)團隊的技術(shù)和研究的結(jié)合，才能從空間、時間和形式等方面解決魚類物種演化的復(fù)雜性[51]。當(dāng)DNA條形碼不能有效識別時，可以通過整合Genbank等相關(guān)數(shù)據(jù)庫的補充信息，進行綜合判定。對一些近緣種或分化很低的物種，可以采用其他進化速度更快的基因，如控制區(qū)基因等進行鑒定。此外，魚類DNA條形碼的應(yīng)用還需要國際間的通力合作，全球規(guī)劃，合理分工，共享科研成果，建立一個全球性的DNA條形碼管理系統(tǒng)，才能解決DNA條形碼面臨的難題。我國的魚類DNA條形碼工作目前還僅限于物種分類以及小范圍的魚類物種和區(qū)系的研究，在其他領(lǐng)域的應(yīng)用研究還很少。今后更需要借助國際合作，充分利用其他國家的先進經(jīng)驗，更好地服務(wù)于水產(chǎn)資源保護，確保食品安全和生物安全。

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ProgressonApplicationofFishDNABarcoding:aReview

CHEN Xinzhong， GUO Shulin， GONG Yanqing

( Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361026, China )

fish; DNA barcoding; species identification; labeling of fish product; progress

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.025

S917

C

1003-1111(2017)06-0834-09

2016-12-26；

2017-02-20.

福建省農(nóng)業(yè)引導(dǎo)性(重點)項目(2015N0015) .

陳信忠(1964-)，男，研究員，博士；研究方向：海洋生物學(xué).E-mail：chenxz@xmciq.gov.cn.