溫度對海捕野生大黃魚精子活力的影響

羅 芬, 黃偉卿,2, 阮少江, 李進壽, 陳小小, 阮俊峰, 周逢芳

( 1.寧德師范學院 生物系，福建 寧德 352100；2.寧德市鼎誠水產有限公司，福建 寧德 352100 )

溫度對海捕野生大黃魚精子活力的影響

羅 芬1, 黃偉卿1,2, 阮少江1, 李進壽1, 陳小小1, 阮俊峰1, 周逢芳1

( 1.寧德師范學院 生物系，福建 寧德 352100；2.寧德市鼎誠水產有限公司，福建 寧德 352100 )

給7尾體質量325～520 g的成熟海捕野生大黃魚人工催產后采精液，在20 ℃(室溫)和4 ℃(冰箱)下保存0、1、3、6、12、24、36 h，以砂濾海水為激活劑，觀察大黃魚精子活力，以精子的激烈運動、搖尾運動、緩慢運動和壽命作為評價指標。試驗結果表明，4 ℃和20 ℃下隨保存時間的延長，精子活力逐漸減弱；4 ℃下保存24 h、20 ℃下保存12 h，精子仍具有激烈運動的能力；4 ℃下保存的3個運動階段和壽命較20 ℃下均有所延長，4 ℃保存大黃魚精子更佳。

野生；大黃魚；精子活力；溫度

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)為我國特有的中下層暖溫性近海集群洄游魚類，主要分布于南海、東海和黃海南部，曾是傳統(tǒng)“四大海產”(大黃魚、小黃魚、帶魚、烏賊)之一[1-2]。大黃魚自人工繁育技術突破今，經過30多年養(yǎng)殖發(fā)展，2015年全國產量達1.48×105t ,產值逾120億元，已成為我國最大規(guī)模的海水網箱養(yǎng)殖魚類和八大優(yōu)勢出口養(yǎng)殖水產品之一[3]。隨著大黃魚養(yǎng)殖的快速發(fā)展，也出現(xiàn)了累代近親繁殖導致的生長性能和抗逆性降低等問題[4-6]。而海捕野生大黃魚群體的遺傳特性、營養(yǎng)結構、形態(tài)特征、抗逆性能等均優(yōu)于養(yǎng)殖大黃魚群體，對大黃魚群體的遺傳性狀改良和良種選育具有現(xiàn)實意義[7-10]。但海捕野生大黃魚成活率低，直接或培育至親本用于種質改良難度大，如能及時有效保存海捕野生大黃魚的精液，保存精子活力，對改良大黃魚種質資源具有重要意義。

溫度主要通過控制三磷酸腺苷來影響精子的活動強度及壽命[11]。羅芬[12]研究表明，4 ℃下保存的長鰭吻(Rhinogobioventralis)精子3個運動階段和壽命均較20 ℃下長；李加兒等[13]報道，將平鯛(Rhabdosargussarba)精子保藏在3～5 ℃的冰箱中,壽命較室溫條件下延長；韓英等[14]發(fā)現(xiàn)，黑龍江茴魚(Thymallusarcticusgrubei)的精液隨保存時間的延長，精子的激活率、快速運動時間和壽命均顯著下降。朱東發(fā)[15]報道了環(huán)境因子對養(yǎng)殖大黃魚精子激活率和活動時間的影響，而關于保存溫度對海捕野生大黃魚精子活力的影響尚未見報道。本試驗研究了溫度對海捕野生大黃魚精子活力的影響，旨在補充大黃魚精子的生理特性資料，探尋適宜的保存溫度，以延長大黃魚精子的保存時間，提高精子的授精能力。

1 材料與方法

1.1 精液的采集與保存

給體長26.5～35.4 cm、體質量325～520 g的體質健壯、外表無損傷及病害的7尾成熟海捕野生大黃魚雄魚注射促黃體素釋放激素類似物(LRH-A)，劑量為5 μg/kg，暫養(yǎng)24 h后用干毛巾擦干生殖孔周圍及體表的水分，用手輕壓魚腹部兩側，使精液流出，用干凈的膠頭滴管從生殖孔吸取沒有受到污染的精液，盛放于小培養(yǎng)皿中并加蓋，快速放進4 ℃低溫中保存，定期取出少許精液待檢，待檢精液無水、無尿、無血，遇水迅速散開。經顯微鏡檢查，精子活力在90%以上者用于試驗。

1.2 精液在20 ℃和4 ℃下保存與激活

將所取精液分成兩等份，置于20 ℃(室溫)和4 ℃(冰箱)下保存，0、1、3、6、12、24、36 h定時取樣觀察，以砂濾海水為激活劑。

1.3 精子活力的觀察

采用平板載玻片法觀察精子活力。滴一滴試驗液于干燥潔凈的載玻片上，用消毒的解剖針蘸取少許精液，使其均勻分散，在10×40倍的顯微鏡下觀察，精液與試驗液接觸的瞬間立即啟動秒表計時，記錄精子活動情況[16]。觀察以1個視野為準，每個樣品重復3～5次。

根據精子在水中的運動狀態(tài)分為激烈運動、緩慢運動和搖尾運動3個連續(xù)階段。這3個階段時間的總和為總運動時間，即精子的壽命。各階段的具體劃分標準參照文獻[17]。

1.4 數(shù)據處理

試驗數(shù)據以平均值±標準差表示。顯著性差異采用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析法處理相關數(shù)據。

2 結 果

4 ℃下保存36 h，精子失去了激烈運動能力，僅緩慢運動和搖尾運動，緩慢運動、搖尾運動和壽命均顯著減少(P<0.05)；保存1 h與0 h相比精子活力差異不顯著(P>0.05)；保存3、6、12、24 h與0 h相比，精子運動時間和壽命均存在顯著差異(P<0.05)(表1)。

20 ℃下保存24 h，精子就已喪失激烈運動的能力，緩慢運動和搖尾運動也顯著減少(P<0.05)；保存1 h精子活力顯著低于0 h(P<0.05)；保存3、6、12 h精子運動時間和壽命顯著縮短(P<0.05)；36 h后精子僅有搖尾運動，且搖尾運動和壽命顯著減少(P< 0.05)(表2)。

表1 4 ℃下保存不同時間時海捕野生大黃魚精子的活力 s

注：同列中上標不同字母的平均值間差異顯著(P<0.05)，下同.

表2 20 ℃下保存不同時間時海捕野生大黃魚精子的活力 s

*表示相關顯著(P<0.05)，**表示相關極顯著(P<0.01)，下同.

圖2 4 ℃和20 ℃下保存不同時間時黃魚精子的壽命

4 ℃下3 h和6 h時精子激烈運動時間顯著長于20 ℃(P<0.05)；4 ℃下24 h時，精子激烈運動時間極顯著長于20 ℃(P<0.01)(圖1)。4 ℃下3 h和24 h時，精子壽命顯著高于20 ℃(P<0.05)；12 h時，4 ℃下精子壽命極顯著高于20 ℃(P<0.01)(圖2)。

海捕野生大黃魚精子的運動時間和壽命隨保存時間的延長而下降。4 ℃下保存的3個運動階段和壽命較20 ℃下有所延長；4 ℃下保存24 h、20 ℃下保存12 h精子仍具有激烈運動能力，4 ℃下保存精子活力明顯提高。

3 討 論

精子靠尾部鞭毛的擺動來運動。外界因子通過干預cAMP-ATP-Mg2+系統(tǒng)來影響鞭毛的活動而制約魚類精子的活力[17]。本試驗表明，保存溫度和時間影響海捕野生大黃魚精子的活力。4 ℃低溫保存的海捕野生大黃魚精子活力激烈運動時間、壽命及保存時間均比20 ℃時更長，這與長鰭吻、黑龍江茴魚、鞍帶石斑魚(Epinepheluslanceolatus)、石鰈(Kareiusbicoloratus)和褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)的研究結果相似[12-14,18-19]。不同保存溫度對精子活力的影響不同。溫度在魚類精子激活生理中的作用可能主要是參與代謝酶活性的調節(jié)[14]，低溫減少了精子對三磷酸腺苷的消耗，延長了精子的運動時間[20]。魚類精子的原生質含量極少，蘊藏的能量十分有限，低溫抑制了精子新陳代謝的速度，能量消耗減緩，精子壽命延長；低溫條件下精子運動頻率明顯降低，激烈運動時間及壽命延長；低溫還抑制了細菌的滋生，這也是精子在低溫下延長運動時間和壽命的重要原因。瓣結魚[Tor(Folifer)brevifilis]精子在4 ℃下保存24 h仍活力正常[21]；鞍帶石斑魚精液在0～4 ℃冰箱中保存6 h活力未顯著降低[18]；褐牙鲆精子在4 ℃下保存24 h、石鰈精子在4 ℃下保存6 h仍具較強活力[19]。長鰭吻精子在4 ℃下保存36 h仍具激烈運動能力，但在20 ℃下僅能保存12 h；4 ℃下保存不同時間3個運動階段和壽命均較20 ℃下延長[12]。海捕野生大黃魚精子活力較強，在4 ℃下保存24 h可以維持激烈運動時間(31.20±6.39) s、壽命長達(164.00±23.14) s；而20 ℃下保存24 h已喪失激烈運動能力，壽命縮短，僅(69.46±3.31) s。林丹軍等[22]將養(yǎng)殖大黃魚精液置于4 ℃冰箱中24 h后用海水激活，精子活力仍可達到60%以上。在人工繁殖中，低溫保存對精子激活及提高受精率具有重要應用意義。不過低溫條件下只是抑制了精子的新陳代謝，耗能仍在繼續(xù)，精子活力隨時間延長而下降，精液保存的時間有限。因此，在人工授精過程中應縮短海捕野生大黃魚精液保存時間，取得精液后保存于低溫(4 ℃)并盡早使用，可以有效延長精子活動時間，尤其是延長激烈運動的時間，增加了精卵接觸機會，能夠提高受精率，確保人工授精成功。

[1] 黃振遠,蘇永全,張建設,等.閩粵群和岱衢群養(yǎng)殖大黃魚(Pseudosciaenacrocea)及其雜交子代遺傳差異的SSR分析[J].海洋與湖沼,2011,42(4):592-596.

[2] 王娟,封永輝,蔡立勝,等.來自大黃魚(Pseudosciaenacrocea)腸道的弧菌拮抗菌的篩選與鑒定[J].海洋與湖沼, 2010,41(5):707-713.

[3] 黃偉卿,張藝,柯巧珍,等.大黃魚選育子二代生長性狀研究[J].南方水產科學, 2013,9(3):14-19.

[4] 丁詩華,黃麗英,張海琪,等.大黃魚(Pseudosciaenacrocea)岱衢洋選育群體和官井洋養(yǎng)殖群體的遺傳差異分析[J].海洋與湖沼,2006,37(1):41-46.

[5] 王軍,全成干,蘇永全,等.官井洋大黃魚遺傳多樣性的RAPD分析[J].海洋學報,2001,23(3):87-91.

[6] 黃偉卿,劉招坤,鄭昇陽,等.2個大黃魚群體選育世代F2生長性狀研究[J].水生態(tài)學雜志,2014,35(2):80-84.

[7] 劉必謙,董文琦,王亞軍,等.岱衢族大黃魚種質的AFLP分析[J].水生生物學報,2005,29(4):413-416.

[8] 徐繼林,嚴小軍,羅瑜萍,等.岱衢族野生大黃魚與養(yǎng)殖大黃魚肌肉脂類和脂肪酸組成的比較研究[J].中國食品學報, 2008,8(1):108-114.

[9] 陳慧,陳武,林國文,等.官井洋種群網箱養(yǎng)殖大黃魚的形態(tài)特征與生長式型[J].海洋漁業(yè),2007,29(4): 331 -336.

[10] 苗亮,李明云,陳炯,等.快長、耐低溫大黃魚新品種東海1號的選育[J].農業(yè)生物技術學報,2014,10(4):1314 -1320.

[11] Perchec G, Jeulin C, Cosson J, et al. Relationship between sperm ATP content and motility of carp spermatozoa [J]. J Cell Sci,1995,108(2):747-753.

[12] 羅芬.長鰭吻鮈精子活力的觀察[J].泉州師范學院學報, 2011,29(6):26-27.

[13] 李加兒,區(qū)又君,江世貴. 環(huán)境因子變化對平鯛精子活力的影響[J].動物學雜志,1996, 31(3):6-9.

[14] 韓英,張瀾瀾,徐革峰,等.黑龍江茴魚(Thymallusarcticusgrubei) 精子活力的觀察[J].水產學雜志,2008, 21(1):9-13.

[15] 朱冬發(fā).環(huán)境因子對大黃魚精子活力的影響[J]. 水產科學, 2005, 24(12):4-6.

[16] 羅芬. 氯化鈉濃度對寬口光唇魚精子活力的影響[J]. 四川動物, 1999, 18(2):70-72.

[17] 鄧岳松. 魚類精子活力研究進展[J]. 生命科學研究, 1999, 3(4):271-278.

[18] 梁偉峰, 張海發(fā), 王云新,等. 幾種因子對鞍帶石斑魚精子活力的影響[J].廣東海洋大學學報,2009,29(3):29-32.

[19] 王華,牛從從,邵明瑜,等.幾種鲆鰈魚類精子超微結構及生理特性的比較研究[J].海洋科學,2008,32(10):17-23.

[20] Billard R, Cosson M P. Some problems related to the assessment of sperm motility in freshwater fish[J]. J Exp Zool,1992(261):122-131.

[21] 謝恩義,何學福.瓣結魚的繁殖習性以及精子的活力與壽命[J]. 動物學雜志, 1999, 34(2):5-8.

[22] 林丹軍,尤永隆,陳炳英.大黃魚精子冷凍復蘇后活力和超微結構的變化[J].福建師范大學學報：自然科學版,2006, 22(3):71-76.

EffectsofTemperatureonSpermMotilityofWildLargeYellowCroakerPseudosciaenacrocea

LUO Fen1，HUANG Weiqing1,2，RUAN Shaojiang1，LI Jinshou1，CHEN Xiaoxiao1，RUAN Junfeng1， ZHOU Fengfang1

( 1.Department of Bioengineering,Ningde Normal University, Ningde 352100, China; 2.Ningde Dingcheng Fishery Company Limited, Ningde 352100, China )

The activation and motility of spermatozoa collected from captured wild male large yellow croaker (Pseudosciaenacrocea) with body weight of 325-520 g were investigated under the different preservation time (0, 1, 3, 6, 12, 24 h and 36 h) at the temperature of 4 ℃ and 20 ℃. The strenuous movement, wagging movement, slow movement and life time of sperm were taken as an index to evaluate sperm activity. The results showed that the sperm had gradually weak motility over time at the temperature of 4 ℃ and 20 ℃, being still strenuous movement when the sperm was preserved at 4 ℃ for 24 h or 20 ℃ for 12 h. However, there were longer movement in the three stages of life at 4 ℃ than at 20 ℃, with stronger motility at 4 ℃ than at 20 ℃.

wild;Pseudosciaenacrocea; sperm motility; temperature

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.022

S965.322

A

1003-1111(2017)06-0814-04

2016-09-01；

2016-12-12.

福建省科技計劃項目(2017N0027)；寧德師范學院創(chuàng)新團隊建設項目(2015T10).

羅芬(1963-)，女，教授；研究方向：魚類生理學及水產保護學.E-mail:luofen1999@163.com.