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    蠅蛆蛋白對中華鱉血清生化指標(biāo)及非特異性免疫功能的影響

    2017-12-18 02:49:13程逍妹黃啟成王方海李廣宏
    水產(chǎn)科學(xué) 2017年6期
    關(guān)鍵詞:蠅蛆磷酸酶生化

    程逍妹,黃啟成,王方海,李廣宏

    ( 1.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510275; 2.廣東綠卡現(xiàn)代農(nóng)業(yè)集團(tuán)公司,廣東 東莞 523912 )

    蠅蛆蛋白對中華鱉血清生化指標(biāo)及非特異性免疫功能的影響

    程逍妹1,黃啟成2,王方海1,李廣宏1

    ( 1.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510275; 2.廣東綠卡現(xiàn)代農(nóng)業(yè)集團(tuán)公司,廣東 東莞 523912 )

    在室內(nèi)、外養(yǎng)殖試驗中將家蠅蛆磨成蠅漿,按一定比例配以卵磷脂、幾丁寡糖和多種維生素制成蠅蛆蛋白,研究其對中華鱉血液生化指標(biāo)及非特異性免疫功能的影響。在水溫(25±1) ℃的室內(nèi)養(yǎng)殖試驗中,將36只體質(zhì)量(248.15±17.10) g的中華鱉,隨機(jī)分成3組(重復(fù)3次,每重復(fù)4只)飼養(yǎng)在120 cm×60 cm×55 cm水族箱中,分別投喂基礎(chǔ)飼料、15%蠅蛆蛋白+基礎(chǔ)飼料、30%蠅蛆蛋白+基礎(chǔ)飼料,養(yǎng)殖180 d。室外養(yǎng)殖池面積為0.5 hm2,鱉體質(zhì)量(294.05±12.265) g,每口池塘放雄鱉7200只,投喂基礎(chǔ)飼料和15%蠅蛆蛋白+基礎(chǔ)飼料,養(yǎng)殖120 d。試驗結(jié)果表明,室內(nèi)養(yǎng)殖的中華鱉攝食添加15%和30%蠅蛆蛋白時,血清總蛋白、總膽汁酸、甘油三酯含量及堿性磷酸酶、酸性磷酸酶及溶菌酶活性均顯著高于對照組;15%添加組中華鱉的血清生化指標(biāo)除血清總蛋白顯著低于30%添加組外,總膽汁酸和甘油三酯含量與30%添加組差異不顯著;雖然15%添加組的堿性磷酸酶活性顯著低于30%添加組,但酸性磷酸酶和溶菌酶活性則顯著高于30%添加組。室外養(yǎng)殖試驗結(jié)果表明,投喂添加15%蠅蛆蛋白飼料組的中華鱉血清總蛋白、總膽汁酸、甘油三酯含量、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶及溶菌酶活性均顯著高于投喂基礎(chǔ)飼料組。攻毒試驗結(jié)果表明,投喂15%蠅蛆蛋白的中華鱉累積死亡率(26.67%)顯著低于對照組(83.33%),相對保護(hù)率為67.99%。室內(nèi)外養(yǎng)殖結(jié)果證明,在飼料中添加15%蠅蛆蛋白能增強(qiáng)中華鱉的非特異性免疫功能。

    蠅蛆蛋白;中華鱉;血清;生化指標(biāo);非特異性免疫

    高密度集約化養(yǎng)殖的發(fā)展常導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境的惡化,中華鱉(Trionyxsinensis)的病害流行日趨嚴(yán)重,造成了巨大損失[1]??股仉m能有效預(yù)治各種疾病,但一系列副作用同樣給養(yǎng)殖帶來了災(zāi)難。應(yīng)用免疫增強(qiáng)劑來提高中華鱉非特異性免疫能力以預(yù)防疾病,是一種極為有效的方法。

    家蠅(Muscadomestica)幼蟲(俗稱蠅蛆)營養(yǎng)豐富,蛋白質(zhì)含量高,還含有抗細(xì)菌、真菌、病毒的生物活性肽、凝集素和溶菌酶等。這些抗菌物質(zhì)效力極高,只要萬分之一用量便可殺死多種病菌,遠(yuǎn)高于目前人類已發(fā)現(xiàn)的任何抗菌素。研究表明,蠅蛆蛋白可以增強(qiáng)對蝦[2-4]、魚類[5-8]、海參[9]和雞[10]等的免疫力,是一種既能為養(yǎng)殖動物提供優(yōu)質(zhì)蛋白,又可增強(qiáng)機(jī)體抗病力的天然免疫增強(qiáng)劑。有關(guān)蠅蛆粉替代魚粉對中華鱉日本品系生長、免疫力、抗病力及肌肉品質(zhì)的影響已有報道。如用蠅蛆粉替代飼料中50%的魚粉能顯著增強(qiáng)中華鱉血清中酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性,但對抗氧化指標(biāo)和溶菌酶活性無顯著影響[11]。而有關(guān)蠅蛆活性蛋白對中華鱉血液生化指標(biāo)及非特異性免疫的影響迄今尚未見報道。為此,筆者研究了蠅蛆活性蛋白對中華鱉血清生化指標(biāo)及非特異性免疫的影響,旨在為中華鱉免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)和利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    血清檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。其余同《蠅蛆蛋白對中華鱉生長性能及營養(yǎng)品質(zhì)的影響》。

    1.2 方法

    將蠅蛆磨成漿、提取及濃縮,再按一定比例配以卵磷脂、殼寡糖和多種維生素等制成蠅蛆蛋白。

    1.2. 1 室內(nèi)飼養(yǎng)試驗

    試驗方法同《蠅蛆蛋白對中華鱉生長性能及營養(yǎng)品質(zhì)的影響》。試驗結(jié)束時取鱉血測定血液生化與免疫指標(biāo)。

    1.2.2 室外飼養(yǎng)試驗

    試驗方法同《蠅蛆蛋白對中華鱉生長性能及營養(yǎng)品質(zhì)的影響》。試驗結(jié)束時取鱉血測定血液生化與免疫指標(biāo)。

    1.2.3 指標(biāo)測定

    試驗結(jié)束時,室內(nèi)、外飼養(yǎng)試驗的每個處理分別隨機(jī)取3只和30只,用乙醚麻醉,酒精消毒中華鱉腹甲中間區(qū)域后,切開消毒部位體壁,小心剝除血管表面黏膜露出3條大血管,然后用一次性采血針從左體動脈弓取血5 mL,室溫放置1 h,4 ℃,3000 r/min離心15 min,取血清,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    測定血清中總蛋白、甘油三脂、總膽汁酸含量。血清生化指標(biāo)采用全自動生化分析儀(OLYMPUS-AU600)測定。

    血清中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和溶菌酶活性用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

    中華鱉的抗菌力按下列方法測定:從室外養(yǎng)殖90 d的試驗組和對照組隨機(jī)撈取中華鱉各30只,分別腹腔注射嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)菌液,密度為5.0×109cfu/mL,每只注射0.2 mL,于120 cm×60 cm×55 cm水族箱中養(yǎng)殖,水深15 cm,水溫(25±1) ℃,每個水族箱放養(yǎng)5只。每日觀察死亡情況,連續(xù)觀察15 d,計算死亡率和相對免疫保護(hù)率。

    相對免疫保護(hù)率/%=[1-(免疫組死亡率/對照組死亡率)]×100%

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析,用Duncan′s多重比較法分析試驗結(jié)果的差異顯著性(P<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蠅蛆蛋白對中華鱉血液生化指標(biāo)的影響

    2.1.1 蠅蛆蛋白對室內(nèi)養(yǎng)殖中華鱉血液生化指標(biāo)的影響

    室內(nèi)養(yǎng)殖中,各添加不同蠅蛆蛋白的中華鱉血清總蛋白含量均隨蠅蛆蛋白添加量的增加而顯著高于對照組;各添加組鱉血清總膽汁酸和甘油三酯含量均顯著低于對照組,但添加組間差異不明顯。從血液生化指標(biāo)考慮,在中華鱉飼料中添加30%蠅蛆蛋白比添加15%的效果更佳,但從經(jīng)濟(jì)角度考慮,添加15%的蠅蛆蛋白較為適宜(表1)。

    2.1.2 蠅蛆蛋白對室外養(yǎng)殖中華鱉血液生化指標(biāo)的影響

    室外養(yǎng)殖中華鱉攝食添加蠅蛆蛋白飼料時,血清總蛋白含量顯著高于對照組,而總膽汁酸和甘油三酯含量則顯著低于對照組(表2)。

    2.2 蠅蛆蛋白對中華鱉免疫指標(biāo)的影響

    2.2.1 蠅蛆蛋白對室內(nèi)養(yǎng)殖中華鱉免疫指標(biāo)的影響

    室內(nèi)養(yǎng)殖的各試驗組中華鱉血清中堿性磷酸酶的活性依次為添加30%蠅蛆蛋白組>添加15%蠅蛆蛋白組>對照組,各組間差異顯著;酸性磷酸酶和溶菌酶的活性均為添加15%蠅蛆蛋白組>添加30%蠅蛆蛋白組>對照組,各組間也差異顯著,以添加15%蠅蛆蛋白最佳(表3)。

    表1 室內(nèi)養(yǎng)殖中華鱉攝食添加蠅蛆蛋白飼料時血液生化指標(biāo)的變化

    注:同列數(shù)據(jù)后不同英文字母表示差異顯著(P<0.05),下同.

    表2 室外養(yǎng)殖中華鱉攝食添加蠅蛆蛋白飼料時血液生化指標(biāo)的變化

    表3 室內(nèi)養(yǎng)殖中華鱉攝食添加蠅蛆蛋白飼料時血液免疫指標(biāo)的變化

    2.2.2 蠅蛆蛋白對室外養(yǎng)殖中華鱉免疫指標(biāo)的影響

    室外養(yǎng)殖的中華鱉攝食含15%蠅蛆蛋白的飼料時,堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶活性均顯著高于對照組(表4)。

    2.3 蠅蛆蛋白對中華鱉抗感染能力的影響

    攝食添加15%蠅蛆蛋白飼料的中華鱉注射嗜水氣單胞菌菌液15 d的累積死亡率顯著低于對照組,相對保護(hù)率為67.99%(表5)。

    表4 室外養(yǎng)殖中華鱉攝食添加蠅蛆蛋白飼料時血液免疫指標(biāo)的變化

    表5 蠅蛆蛋白對中華鱉抗感染能力的影響

    3 討 論

    3.1 蠅蛆蛋白對中華鱉血液生化指標(biāo)的影響

    血清蛋白成分及其含量變化與機(jī)體健康、營養(yǎng)和疾病等狀況密切相關(guān),是衡量免疫功能及機(jī)體狀態(tài)的指標(biāo),良好的營養(yǎng)狀況可使血清蛋白維持在較高的水平[12-13];膽汁酸是膽固醇經(jīng)過肝臟合成的有機(jī)酸,是肝臟清除膽固醇的主要形式,其生成和代謝與肝臟器官的功能緊密相關(guān)。當(dāng)肝細(xì)胞受損時,血漿總膽汁酸含量就升高,因此總膽汁酸是反映肝細(xì)胞分泌、合成、肝細(xì)胞損傷狀態(tài)的重要指標(biāo)[14];三酰甘油是反應(yīng)體內(nèi)脂肪代謝水平的重要生理指標(biāo),三酰甘油的含量升高,表明肝中堆積的脂肪較多,易導(dǎo)致脂肪肝和肝肥大等癥狀[13]。本試驗結(jié)果表明,在中華鱉飼料中添加蠅蛆蛋白可顯著提高中華鱉血清總蛋白,降低總膽汁酸和甘油三酯,說明添加蠅蛆蛋白可促進(jìn)中華鱉對飼料中蛋白質(zhì)的吸收與利用,保肝護(hù)肝,有效防止脂肪肝的發(fā)生,其中以添加15%蠅蛆蛋白最為適宜。這與用鮮蠅蛆、蠅蛆抗菌肽或蠅蛆粉增加了雞血清總蛋白含量的結(jié)果一致[15-17],也與蠅蛆抗菌肽可降低雞血清總脂的結(jié)果一致[16],而與在飼料中添加蠅蛆粉對肉雞血清總蛋白和總膽固醇含量無顯著影響的結(jié)果不符[18],其中的原因有待進(jìn)一步查明。

    3.2 蠅蛆蛋白對中華鱉免疫指標(biāo)的影響

    堿性磷酸酶普遍存在于動植物體內(nèi),是一種對底物專一性要求較低的磷酸單脂水解酶和解毒系統(tǒng),在堿性條件下,可使磷酸單脂水解生成乙醇和磷酸,與一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)[19];酸性磷酸酶是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶,也是巨噬細(xì)胞內(nèi)最有代表性的水解酶。吞噬是巨噬細(xì)胞的典型功能之一,巨噬細(xì)胞吞噬異物顆粒形成吞噬體,然后用包括酸性磷酸酶在內(nèi)的溶解酶消化異物顆粒,酸性磷酸酶的活性代表著吞噬細(xì)胞清除異物的能力,也就是非特異性免疫能力[20];溶菌酶能破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵,使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽而導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂,逸出內(nèi)容物,使細(xì)菌溶解,是體液免疫的主要參與者[21]。堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶是3種重要的非特異性免疫酶,在中華鱉體液免疫和抗病過程中具有重要作用。這些酶活力的高低常被用作評價中華鱉免疫機(jī)能狀態(tài)的重要指標(biāo)。本試驗發(fā)現(xiàn),在飼料中添加15%或30%的蠅蛆蛋白可顯著提高中華鱉血清堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶的活性,表明基礎(chǔ)飼料中添加15%或30%蠅蛆蛋白顯著增強(qiáng)了中華鱉非特異性免疫。這一結(jié)果與青魚(Mylopharyngodonpiceus)[5]、仿刺參(Apostichopusjaponicus)[9]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[22]、黃鱔(Monopterusalbus)[7]及泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[8]的研究結(jié)果一致;也與蠅蛆粉提高中華鱉堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的結(jié)果一致[11],但與蠅蛆粉對中華鱉日本品系的溶菌酶活性沒有影響的結(jié)果不同[11],推測可能與產(chǎn)品的加工方式有關(guān),因為不同的加工工藝會導(dǎo)致蠅蛆活性物質(zhì)喪失。分析蠅蛆蛋白對中華鱉血液生化指標(biāo)及相關(guān)免疫酶活性的影響發(fā)現(xiàn),蠅蛆蛋白不僅具有調(diào)節(jié)中華鱉免疫的功能,還具有調(diào)節(jié)中華鱉代謝的作用,但機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

    3.3 蠅蛆蛋白對中華鱉抗感染能力的影響

    攻毒試驗可以客觀評價生物體對于外界病原菌的抵抗能力,直觀反映機(jī)體免疫能力強(qiáng)弱。明建華等[23]通過嗜水氣單胞菌攻毒試驗發(fā)現(xiàn),攝食含有蠅蛆粉飼料的青魚存活率顯著高于對照組。陳乃松等[4]分別用含有蠅蛆粉和β-葡聚糖的飼料喂凡納濱對蝦一段時間后,再用溶藻膠弧菌進(jìn)行攻毒,結(jié)果蠅蛆粉組和β-葡聚糖組的對蝦抵抗力均顯著高于對照組,其中又以蠅蛆粉組抵抗力最強(qiáng)。在凡納濱對蝦飼料中添加0.3%家蠅抗菌肽,飼養(yǎng)8周后進(jìn)行白斑病病毒攻毒試驗[22],結(jié)果表明,抗菌肽組72 h內(nèi)的累計死亡率與對照組相比顯著降低。本研究中,各試驗組中華鱉經(jīng)嗜水氣單胞菌攻毒表明,投喂蠅蛆蛋白組中華鱉的死亡率明顯低于對照組。該結(jié)果與蠅蛆粉及家蠅抗菌肽的試驗一致,但由于本研究使用的蠅蛆蛋白產(chǎn)品,加工簡單,生產(chǎn)成本低,因此更易于被用戶接受,有利于產(chǎn)品推廣應(yīng)用。大多數(shù)魚類產(chǎn)生特異性抗體需要長期適應(yīng)和產(chǎn)生記憶而形成[23]。本試驗中的中華鱉相對保護(hù)率提高,應(yīng)與蠅蛆蛋白提高了鱉體堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶等非特異性免疫酶的活性有關(guān)。考慮到蠅蛆生產(chǎn)成本,筆者建議在中華鱉飼料中以添加15%蠅蛆蛋白為宜。

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    EffectsofDietaryHouseflyMaggotProteinonSerumBiochemicalIndicesandNonspecificImmunityinSoftShelledTurtleTrionyxsinensis

    CHENG Xiaomei1,HUANG Qicheng2,WANG Fanghai1,LI Guanghong1

    ( 1. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China; 2. Guangdong Luka Modern Agriculture Group Co., LTD, Dongguan 523912, China )

    Two feeding trials were conducted to investigate the effects of housefly maggot (Muscadomestica) protein supplemented with lecithin, chitosan and vitamins on serum biochemical indices and nonspecific immunity of soft shelled turtleTrionyxsinensis. Thirty-six individuals of soft shelled turtle with body weight of (248.15 ±17.10) g were reared in a 120 cm×60 cm×55 cm tank and fed on one of the experimental diets supplemented with 0%,15% and 30% housefly maggot protein in a laboratory at water temperature of (25±1) ℃ for 180 d with triplication. Soft shelled turtle with body weight of(294.05±12.265) g were stocked into an outdoor tank with 0.5 hm2at a density of 7200 individuals and fed on one of the experimental diets supplemented with 0% and 15% housefly maggot protein for 120 d. Results showed that the levels of serum protein, total bile acid, and triglyceride, and activities of alkaline phosphatase, acid phosphatase and lysozyme were significantly higher in soft shelled turtle fed the diets containing 15% and 30% housefly maggot protein than those in the soft shelled turtle in the control group. The soft shelled turtle fed the diet containing 15% housefly maggot protein had lower serum biochemical indices than the turtle fed the diet containing 30% housefly maggot protein did, without significant differences in levels of total bile acid and triglyceride in both groups. The soft shelled turtle in 15% housefly maggot protein group had lower alkaline phosphatase activity and higher acid phosphatase and lysozyme activities than the soft shelled turtle in 30% housefly maggot protein group. Considering the housefly maggot production cost, it is suggested that supplementation with 15% housefly maggot protein was optimal for soft shelled turtle culture. The toxic challenge test revealed that there was significantly lower mortality (26.67%) in the turtle fed the diet containing 15% housefly maggot protein than that in control group (83.33%), indicating that the housefly maggot protein is a good food source for soft shelled turtle, resulting in significant increase in serum biochemical index and nonspecific immunity.

    housefly maggot protein;Trionyxsinensis;serum;biochemical index;nonspecific immunity

    10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.013

    S966.5

    A

    1003-1111(2017)06-0768-05

    2016-12-06;

    2017-03-23.

    廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(A201301F02);廣東省漁業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化專項(2013);清遠(yuǎn)市科技計劃項目(2013C008).

    程逍妹(1990—),女,碩士研究生;研究方向:動物營養(yǎng)與免疫. E-mail:cxm0929@126.com. 通訊作者:李廣宏(1964—),男,副教授,碩士生導(dǎo)師;研究方向:動物營養(yǎng)與生理. E-mail:lsslgh@mail.sysu.edu.cn.

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