雞海馬結構傳入纖維的腦干及小腦起始核—HRP逆行示蹤法

張集祥，孔 雪，王 軍，王政富，陳 芳，趙海全，劉為民

(佛山科學技術學院，廣東佛山 528231)

雞海馬結構傳入纖維的腦干及小腦起始核—HRP逆行示蹤法

張集祥，孔 雪，王 軍，王政富，陳 芳，趙海全，劉為民*

(佛山科學技術學院，廣東佛山 528231)

研究雞海馬結構的傳入纖維在腦干及小腦內的起始核。將40%辣根過氧化物酶(HRP)水溶液注入雞左端腦海馬結構，逆行追蹤投射到海馬結構的纖維在腦干和小腦內的起始核。結果在腦干的淺小細胞核(SPC)、圓下核(SRt)、蔡氏區(qū)(AVT)和小腦的第Ⅰ～Ⅹ葉浦肯野細胞層內均出現被標記的神經元。初步表明上述部位為端腦海馬結構的起始核。

雞；海馬結構；辣根過氧化物酶；逆行追蹤；起始核

傳統(tǒng)觀念認為，海馬結構作為邊緣系統(tǒng)的一部分，在學習、記憶、情緒、內臟活動中扮演著重要角色。O'Keefe J在1978年發(fā)表了其代表作“Hippocampal place unites in the freely moving rat:Why they fire where they fire”，標志著人們對海馬結構的認識有了突破性進展，從而認識到海馬結構在動物體的空間認知和空間記憶方面發(fā)揮著重要作用[1]。繼O'Keefe J在海馬發(fā)現“位置細胞”后，人們又相繼發(fā)現“網絡細胞”和“邊緣細胞”，它們都存在于海馬結構內，在動物行為中發(fā)揮著定位系統(tǒng)的作用[2]。

在禽類，已經有較多的報道表明海馬結構在功能、細胞構筑、纖維聯系、神經遞質和神經調節(jié)諸方面與哺乳動物有許多相似之處，特別是在空間導航和空間記憶方面[3-4]。幾十年來，學者們對禽類海馬結構的纖維聯系的研究較多的是在鴿子和斑雀上進行的，對雞的研究仍待補充。本實驗室前期曾采用DiI注射海馬結構，結果發(fā)現在端腦的副高紋狀體、內側隔核、古紋狀體、帶核和后背外側區(qū)出現標記神經元，但除了在端腦內發(fā)現標記神經元外，腦干和小腦等均未發(fā)現標記神經元[5]。為此，本試驗應用辣根過氧化物酶(HRP)逆行追蹤法進一步示蹤腦干和小腦的起始核，以便全面了解雞海馬結構的傳入聯系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 2月齡～3月齡粵禽黃雞20只，雌雄不拘，體重約1.0 kg～1.5 kg，均購自佛山種雞場。

1.1.2 主要試劑 多聚甲醛購自天津百世化工有限公司；戊二醛購自天津大茂化學試劑廠；水合氯醛(分析純)購自天津科密歐化學試劑有限公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP,RZ=3,SigmaⅣ型)、硝普鈉(亞硝基鐵氰化鈉,sodium nitroferricyanide)、四甲基聯苯胺(3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺,TMB)均購自Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 主要儀器 江灣Ⅰ型C小動物腦立體定位儀，上海奧爾科特生物科技有限公司產品；KD-500型推拉式三用切片機，KD-Ⅳ電腦快速制冷器，浙江科迪儀器設備有限公司產品；1 μL微量進樣器，上海光正醫(yī)療儀器有限公司產品；Tiger顯微圖像分析系統(tǒng)，暨南大學組織與胚胎學教研室研制。

1.2 方法

HRP逆行追蹤，按2 mL/kg經腹腔注射10%水合氯醛溶液進行全麻，將動物固定于江灣Ⅰ型C小動物腦立體定位儀，外科方法開顱，將已吸取40% HRP水溶液的玻璃微針(內徑20 μm～40 μm)固定于立體定位儀的電極夾持器上，在正中矢狀面(以矢狀竇判定)稍偏左側的部位向端腦海馬進針[6]，注射量0.6 μL，留針15 min后縫合創(chuàng)口。術后存活3 d，按Mesulam(1982)[7]方法灌注固定，取端腦兩半球、小腦和腦干，翌日制冰凍連續(xù)切片，片厚40 μm。切片經TMB成色，自然干燥后中性紅復染，脫水、透明、中性樹脂封片后顯微鏡觀察，拍照。

2 結果

2.1 注射點位置

德國學者Redies C[8]和西班牙學者Suárez J[9]將雞的海馬結構劃分為6個部分，分別為海馬(hippocampus,Hp)、旁海馬內側區(qū)(medial subdivision of parahippocampus,APHm)、旁海馬中間內側區(qū)(medial part of the intermediate subdivision of parahoppocampus,APHim)、旁海馬中間外側區(qū)(lateral part of the intermediate subdivision of parahoppocampus,APHil)、旁海馬外側區(qū)(lateral part of parahippocampus,APHl)以及后背外側區(qū)(area corticoidea dorsolateralis,CDL)。本試驗將HRP注射左側海馬結構，注射點選擇在旁海馬中間區(qū)(intermediate subdivision of parahoppocampus,APHi)和內側區(qū)之間，以往進針點的數據為：在雞左腦離原點左0.5 mm，前后4 mm～8 mm處注射，注射角度為向正中矢狀面傾斜3°，進針1.5 mm左右。本試驗的注射點較為理想，注射點位于在APHi與APHm之間(圖1)。

距“0”點向前8.8 mm，黑色箭頭示注射方向及深度。Hp為海馬；APHm為旁海馬內側區(qū)；APHi為旁海馬中間區(qū)；APHl為旁海馬外側區(qū)；VL為側腦室

At the level of 8.8 mm anterior to the zero point,the black arrowhead showed the injection direction and depth.Hp is hippocampus; APHm is medial subdivision of parahippocampus; APHi is intermediate subdivision of parahippocampus; APHl is lateral part of parahippocampus; VL is lateral ventrical

圖1左側端腦海馬結構內HRP注射點(中性紅染色，40×)

Fig.1 The injection site of HRP in the left telencephalon
(Stained with neutral red,40×)

2.2 間腦內標記神經元

腦干內雙側淺小細胞核可見少量標記神經元，胞內標記顆粒較大且密集(圖2C)；注射側圓下核可見大量標記神經元，胞內分布大量細小的標記顆粒(圖2D)；注射側蔡氏區(qū)可見少數標記細胞，胞內標記顆粒分布稀疏且細小(圖2E)。

2.3 小腦內標記神經元

雞小腦內Ⅰ～Ⅹ葉皮質的浦肯野細胞層中均發(fā)現被逆行標記的浦肯野細胞，其中Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ葉的標記細胞最多，標記細胞以對側較多，細胞內標記顆粒針點狀密集分布(圖3)。

3 討論

3.1 海馬結構與腦干的纖維聯系

已知哺乳類海馬結構可從5個感覺系統(tǒng)(嗅覺、視覺、聽覺、體感和三叉神經感覺)接收間接信息，其中間腦是主要的傳入途徑之一。在腦干中，海馬結構接收來自淺小細胞核(nucleus superficialis parvicellularis,SPC)、外側下丘腦區(qū)(regio lateralis hypothalami,LHy)、后線核(nucleus lineariscaudalis,LC)和乳頭體區(qū)的傳入[10]，同時也接收源自藍斑核(locus ceruleus,LoC)和蔡氏區(qū)(area ventralis,Tsai,AVT)的兒茶酚胺能傳入纖維，來自LC的傳入纖維屬于5-羥色胺能。另外，丘腦旁正中內核(nucleus paramedianus internus thalami,PMI)和圓下核(nucleus subrotundus,SRt)的纖維也可投射到旁海馬。在本試驗在雞的間腦SPC、AVT和SRt均可觀察到逆標神經元，說明海馬結構接收來自這些區(qū)域的投射，而AVT和SRt同是高階的內臟感覺系統(tǒng)的一部分，這佐證了禽類海馬結構與哺乳動物的海馬結構一樣屬于邊緣系統(tǒng)的一部分，與內臟活動有密切的聯系。然而，雖然國外學者Casini在鴿子的海馬結構注射HRP也在SPC上發(fā)現標記神經元，但他在以往的研究中認為SPC僅僅向副高紋狀體投射而已，其通過纖維聯系將體表感覺傳入副高紋狀體中，而SPC與海馬結構的聯系未見其闡明原因。在研究小腦與海馬結構的聯系時發(fā)現，小腦有向丘腦背中前腹核(nucleus dorsalisintermedius ventralis anterior，DIVA)的直接投射，但是DIVA卻向副高紋狀體投射而非海馬結構。而DIVA正好位于SPC腹側，兩個核團相距較近，是否存在DIVA向SPC的投射，值得探討。如果是，則小腦就有了向海馬投射的清晰的神經通路，其通路可能為“小腦→DIVA→SPC→海馬結構”，但這仍需通過試驗進一步證明。

3.2 海馬結構與小腦的纖維聯系

通常認為小腦向端腦的投射是間接的，即由浦氏細胞發(fā)出纖維到達小腦深核，換元后投向丘腦腹前核或腹外側核(VA/VL)，再換元后投射到大腦皮質的運動區(qū)和運動前區(qū)，全程經過了三級神經元。袁文菊等[11]曾在小腦注射HRP逆行追蹤海馬結構向小腦的直接投射，在端腦海馬結構出現標記細胞，而本試驗將HRP注射海馬結構后在小腦浦肯野細胞層可發(fā)現大量的逆標細胞，說明不僅僅有小腦向海馬的直接投射，而且存在海馬向小腦的直接投射，形成小腦與海馬結構的投射環(huán)路。傳統(tǒng)的觀點認為正常成年哺乳動物端腦與小腦之間不存在直接投射，僅存在間接投射，但若試驗性地去除某些小腦的傳入纖維的起始核，則可出現端腦向小腦的直接投射。這表明在小腦傳入投射的靶核上存在著某種競爭機制，且隨著發(fā)育而逐漸穩(wěn)定下來。在動物的幼年時期，中樞神經系統(tǒng)尚未完善，存在不同來源神經投射的相互競爭[12]。朱寧等[13]研究表明海馬結構的神經聯系在發(fā)育過程中不斷地清除出生后大量的異常的神經聯系，從而達到神經系統(tǒng)的高效性，避免冗余和錯誤建設。本試驗采用2月齡～3月齡的小雞發(fā)現小腦浦氏細胞直接投射到海馬結構，表明可能是一種幼年期的現象，至于在成年動物中是否仍然存在這種投射，有待進一步研究。

A.腦干內標記神經元(黑點)出現的區(qū)域，距“0”點向前6.0 mm；B.腦干內標記神經元(黑點)出現的區(qū)域，距“0”點向前3.6 mm；C.淺小細胞亞核內標記神經元(中性紅染色，400×)；D.圓下核內標記神經元(中性紅染色，400×)；E.蔡氏區(qū)內標記神經元(中性紅染色，400×)。黑色箭頭示標記神經元；SPC為淺小細胞亞核；SRt為圓下核；AVT為蔡氏區(qū)；Ru為紅核；NⅢ為動眼神經

A.The labeled neurons (dots) in different regions in the brainstem,at the level of 6.0 mm anterior to the zero point; B.The labeled neurons (dots) in different regions in the brainstem,at the level of 3.6 mm anterior to the zero point; C.The labeled neurons in the nucleus superficialis parvicellularis(Stained with neutral red,400×); D.The labeled neurons in the nucleus subrotundus(Stained with neutral red,400×); E.The labeled neurons in the area ventralis(Stained with neutral red,400×).The black arrowhead showed the labeled neurons; SPC.Nucleus superficialis parvicellularis; SRt.Nucleus subrotundus; AVT.Area ventralis(Tsai); Ru.Nucleus ruber; NⅢ.Nervus oculomtorius

圖2 HRP注射左端海馬結構后腦干內標記神經元

Fig.2 The labeled neurons in the brainstem after injection of HRP in the left horseradish peroxidase

A.小腦內標記神經元(黑點)出現的區(qū)域；B.小腦內被標記的浦肯野細胞(中性紅染色，400×)；C.高倍鏡(油鏡)下的被標記的浦肯野細胞(中性紅染色，1 000×)。黑色箭頭示被標記的浦肯野細胞

A.The labeled neurons(dots)in different regions in the cerebellum; B.The labeled purkinje cells in the cerebellum(stained with neutral red,400×); C.The higher magnification(oil immersion objective)of the labeled Purkinje cells in the cerebellum(stained with neutral red,1 000×).The black arrowhead showed the labeled Purkinje cells

圖3 HRP注射左端海馬結構后小腦內標記神經元

Fig.3 The labeled neurons in the cerebellum after injection of HRP in the left horseradish peroxidase

本實驗室前期曾采用DiI注射海馬結構，結果發(fā)現除了在端腦內發(fā)現標記神經元外，腦干和小腦等均無標記神經元出現[5]。采用DiI作為逆行示蹤劑，能夠靈敏地在活體試驗中短距離內示蹤出中樞內的傳入神經元，但其卻不擅長在活體試驗中進行長距離的逆行標記[14]。本文采取HRP作為逆行示蹤劑，能有效地避免這個問題。雖然通過將HRP注射到海馬結構初步了解其傳入纖維在腦干和小腦中的起始核，但其具體的傳入路徑仍有待研究，而且研究禽類的神經投射在某些方面也對哺乳動物的研究起一定的推進作用，尤其在小腦與海馬結構上，本實驗室還將進一步研究禽類的海馬結構與小腦的神經纖維聯系及其路徑。

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BrainstemandCerebellarOriginsofAfferentFiberstoHippocampalFormationinChicken:byRetrogradeTracingwithHRP

ZHANG Ji-xiang,KONG Xue,WANG Jun,WANG Zheng-fu,CHEN Fang,ZHAO Hai-quan,LIU Wei-min

(FoshanUniversity,Foshan,Guangdong,528231,China)

To clarify the brainstem and cerebellum original nuclei of afferent fibers to the hippocampal formation in chicken,40% horseradish peroxidase (HRP) was injected into the hippocampal formation of the left telencephalon in chickens for retrograde tracing the origins of afferent fibers from the brainstem and cerebellum to the hippocampal formation.The labeled neurons appeared in nucleus superficialis parvicellularis (SPC),nucleus subrotundus (SRt) and area ventralis of Tsai (AVT) of the brainstem and Purkinje cells in the cerebellar cortex of the foliumⅠ-Ⅹ of the cerebellum.It indicated that all the parts mentioned above are the original nuclei to the hippocampal formation in chicken.

chicken; hippocampal formation; HRP; retrograde tracing; original nuclei

2017-03-06

國家自然科學基金項目(31372389)

張集祥(1991-)，男，廣東潮州人，碩士研究生，主要從事基礎獸醫(yī)學研究。*

S852.16

A

1007-5038(2017)11-0033-04