利用電穿孔法對狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株病毒的拯救及鑒定

毛麗萍，魏玉圓，王 偉，翟少華，程 瑤，文兆海，簡子健

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

利用電穿孔法對狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株病毒的拯救及鑒定

毛麗萍△，魏玉圓△，王 偉，翟少華，程 瑤，文兆海，簡子健*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

探討電穿孔轉(zhuǎn)染法對SRV9 Ψ區(qū)缺失株重組病毒的拯救及鑒定。利用電穿孔細胞轉(zhuǎn)染法，將純化的Ψ區(qū)缺失株pcDNA-NPMG-L全長質(zhì)粒和pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-M、pcDNA-G和pcDNA-L輔助表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中，并進行盲傳，借助RT-PCR、間接免疫熒光試驗、Western-blot及透射電子顯微鏡對重組病毒進行鑒定。結(jié)果顯示，重組病毒能夠產(chǎn)生綠色熒光，透射電子顯微鏡觀察可見典型的彈狀病毒，對重組毒株與親本毒株G蛋白進行Western-blot驗證，可獲得相應(yīng)目的條帶。結(jié)果表明，通過電穿孔細胞轉(zhuǎn)染法，能成功拯救出重組病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株，為病毒的拯救提供新的轉(zhuǎn)染方法，并能有效提高轉(zhuǎn)染效率，為研發(fā)新型狂犬病疫苗提供參考。

狂犬病病毒；電穿孔轉(zhuǎn)染法； SRV9 Ψ區(qū)缺失株；拯救

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒引起的一種人畜共患的中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病，病死率高達100%[1]。該病毒為彈狀病毒科狂犬病毒屬的單股負鏈RNA病毒?；蚪M全長約12kb，由5個結(jié)構(gòu)基因構(gòu)成，從3′到5′端依次為N、P、M、G、L基因，各個基因間含有非編碼的間隔序列。在G-L基因之間存在423個核苷酸構(gòu)成的間隔序列為一段高度保守的區(qū)域，被稱偽基因(簡稱Ψ區(qū))。研究表明，缺失Ψ區(qū)域不會影響病毒在宿主細胞內(nèi)的擴增，并證實Ψ區(qū)域具有表達外源基因的潛在能力[2]。

狂犬病病毒的拯救過程，需將重組全長cDNA和輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，獲得具有感染性并能夠穩(wěn)定遺傳的RNA病毒。電穿孔細胞轉(zhuǎn)染是利用瞬間產(chǎn)生高強度電場產(chǎn)生的電脈沖改變細胞膜的通透性，將外源基因?qū)爰毎麅?nèi)的方法[3]。該方法簡單、易行[4]，且安全性好、轉(zhuǎn)化效率高，但對細胞具有一定的損傷性[5-6]。

本研究利用已構(gòu)建的狂犬病SRV9 Ψ區(qū)缺失株感染性cDNA，采用電轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，拯救獲得缺失Ψ區(qū)的狂犬病病毒SRV9株病毒，利用間接免疫熒光、RT-PCR、缺失株病毒液的透射電子顯微鏡觀察等進行鑒定，為深入研究新型狂犬病疫苗提供新的思路與試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和質(zhì)粒 敘利亞幼倉鼠腎細胞(BHK-21)；表達綠色熒光蛋白質(zhì)粒pMAX(德國，Lonza公司)；狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株感染性cDNA(pCDNA-NPMG-L )全長質(zhì)粒，pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-M、pcDNA-G和pcDNA-L輔助表達質(zhì)粒均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院病理實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2 主要試劑 DNA標準DL 2 000、Prime STAR?Max DNA Polymerase購自TaKaRa公司；InvitrogenTMM-MLV Reverse Transcriptase購自Thermo Fisher Scientific公司；美國Hyclone胎牛(FBS)、MEM高糖培養(yǎng)基購自寶生物工程(大連)有限公司；狂犬病的鼠源性陽性血清購于長春軍事獸醫(yī)研究所；鼠抗RV GP高免血清、FITC標記山羊抗小鼠的熒光抗體和辣根過氧化物標記山羊抗小鼠的抗體均購北京博奧森公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)布的SRV9株基因組序列(登錄號：AF499686.2)，利用Oligo 6.0軟件設(shè)計檢測SRV9 Ψ區(qū)缺失株感染性cDNA的鑒定引物，GLF：5′-GCAGACCCGTCTACCG TTTT-3′；GLR：5′-GACAATGGGGGTTCCTCTGG-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.2 SRV9 Ψ區(qū)缺失株電轉(zhuǎn)染及擴增 待BHK-21細胞生長密度約為80% 時，消化收集并將細胞調(diào)至1.8×106個細胞，100 μL電轉(zhuǎn)液懸浮(S1∶S2=1∶50)，轉(zhuǎn)入pMAX質(zhì)粒(陽性對照)、重組缺失株全長質(zhì)粒pcDNA-NPMG-L和輔助質(zhì)粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-M、pcDNA-G、pcDNA-L用量分別為1.0、2.5、1.5、0.8、0.5、0.6、0.5 μg。將電擊杯放置于電轉(zhuǎn)槽中，運行EN-138電轉(zhuǎn)程序，室溫靜置10 min，置于37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h后換液，37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)，48 h后將培養(yǎng)皿置于熒光倒置顯微鏡下進行觀測。待細胞單層鋪滿培養(yǎng)皿，盲傳并反復(fù)凍融，離心收集上清，收獲缺失株病毒液。

1.2.3 SRV9 Ψ區(qū)缺失株病毒的RT-PCR檢測 取缺失毒株和標準毒株的病毒液提取總RNA，參照InvitrogenTMM-MLV Reverse Transcriptase試劑操作指南，進行cDNA第一鏈的合成。根據(jù)狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株基因特點，設(shè)計用于對所拯救的狂犬病病毒SRV9缺失ψ區(qū)株病毒進行鑒定的引物GLF、GLR，以cDNA為模板，進行PCR擴增，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。

1.2.4 SRV9 Ψ區(qū)缺失株病毒的間接免疫熒光檢測 按1.8×106個/mL細胞密度傳至6孔板。同步接種缺失株病毒液(70 μL/孔)及親本毒株(陽性對照)與正常細胞(陰性對照)，并加入維持液。37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h；棄去上清，預(yù)冷的800 mL/L丙酮，4℃固定12 h；1∶2 000稀釋的狂犬病陽性血清為一抗，37℃感作2 h，在暗室中加入1∶200稀釋的FITC標記山羊抗鼠為二抗，37℃感作30 min。在共聚焦顯微下觀察，對缺失株病毒進行檢測。

1.2.5 SRV9 Ψ區(qū)缺失株病毒G蛋白的Western-blot檢測 在缺失株的病毒液、原毒株病毒液及空白細胞體中加入150 μL蛋白抽提試劑(RIPA：蛋白抑制劑=100∶1)，冰上孵育30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，滴加裂解液100 μL至相應(yīng)的管中，分別加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液。PCR儀控溫99℃ 8 min。12%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，膜封閉液4 ℃封閉過夜；1∶5 000稀釋的鼠抗RV GP高免血清4 ℃過夜；1∶7 000 稀釋的辣根過氧化物標記的山羊抗鼠二抗4 ℃過夜；洗膜加入ECL顯色劑，在蛋白印跡掃描成像系統(tǒng)下記錄試驗結(jié)果。

1.2.6 SRV9 Ψ區(qū)缺失株病毒液的透射電子顯微鏡檢測 將缺失株原毒株病毒液分別與狂犬病抗體反應(yīng)后，吸取少量病毒液滴于附有Formvar膜的銅網(wǎng)上，靜置2 min，用濾紙吸去多余液體，懸滴2%磷鎢酸，靜置2 min，用濾紙吸去染液，自然干燥后進行透射電子顯微鏡觀察。

1.2.7 狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株病毒感染細胞的透射級電子顯微鏡檢測 分別取過濾缺失株病毒液、原SRV9株的病毒液，采用同步接毒法，將兩種病毒分別感染BHK-21細胞。待細胞長滿，消化收集置于1.5 mL離心管中，加1 mL的2.5%戊二醛，4℃固定24 h；PBS洗滌3次，30 min/次；將細胞樣品包埋于40 g/L瓊脂中，加入10 mL/L鋨酸，4℃固定2 h；PBS洗滌3次，30 min/次；在30%、50%、70%、80%、90%、100%逐級脫水，每個濃度15 min；用無水丙酮對樣品內(nèi)的脫水劑進行置換；用包埋劑進行滲透，將包埋樣品放入聚合器中進行聚合，溫度和時間按照37℃ 12 h，45℃ 24 h，60℃ 48 h依次進行；聚合后，對制備包埋塊進行修塊制備超薄切片。切片用醋酸鈾染色，自然干燥后在透射電子顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率

電轉(zhuǎn)染48 h后，通過熒光倒置顯微鏡下對轉(zhuǎn)染的pMAX質(zhì)粒的BHK-21細胞進行觀察，產(chǎn)生大量綠色熒光(圖1 B)，表明陽性pMAX質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染效率較高；而未經(jīng)轉(zhuǎn)染pMAX質(zhì)粒的對照組中BHK-21細胞未產(chǎn)生綠色熒光(圖1 C)。

2.2 RT-PCR 檢測

采用引物GLF、GLR，以重組全長cDNA質(zhì)粒做陽性對照，取親本SRV9病毒作平行對照，通過電轉(zhuǎn)染拯救的狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株進行RT-PCR檢測。標準毒株片段為845 bp，缺失株目的片段為422 bp，大小趨于一致(圖2)。

2.3 間接免疫熒光檢測

將重組病毒進行間接免疫熒光檢測。設(shè)置親本SRV9毒株做陽性對照、未感染病毒的正常細胞做陰性對照、轉(zhuǎn)染所有輔助質(zhì)粒組的細胞及僅轉(zhuǎn)染全長質(zhì)粒組做平行對照。通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常BHK-21細胞、僅轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染全長基因表達質(zhì)粒組均未見任何熒光(圖3B-D)。轉(zhuǎn)染的重組全長質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒組與陽性對照的親本毒株組，均產(chǎn)生大量綠色熒光(圖3E-F)。由此說明已成功拯救出狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株。

A.正常BHK-21細胞 B.轉(zhuǎn)染pMAX熒光圖 C.未轉(zhuǎn)染pMAX熒光圖A.Normal BHK-21 cells; B.Images of fluorescence with transfection pMAX; C.Images of fluorescence without transfection pMAX

M.DNA 標準 DL 2 000；1.陰性對照；2.全長質(zhì)粒陽性對照(422 bp)；3.重組病毒RT-PCR檢測(422 bp)；4.親本毒株RT-PCR 檢測(845 bp)；5.轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒；6.轉(zhuǎn)染全長質(zhì)粒；7.轉(zhuǎn)染空白細胞

M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2.Positive control for plasmids of entire length(422 bp); 3.Detection of recombinant virus by RT-PCR(422 bp); 4.Detection of parent strain by RT-PCR; 5.Auxiliary plasmid transfection; 6.Transfection of entire length plasmid; 7.Transfection of blank cells

圖2重組病毒的RT-PCR檢測

Fig.2 Deteciont of recombinant virus by RT-PCR

2.4 Western blot檢測

取狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株病毒液、親本SRV9株的病毒液與空白細胞體，進行G蛋白的Western blot檢測。結(jié)果顯示，拯救毒株與親本毒株能產(chǎn)生大小相近的G蛋白條帶，而空白對照均無任何條帶(圖4)。

2.5 病毒液的電鏡檢測

將狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株病毒液和親本SRV9株的病毒液分別與狂犬病陽性血清反應(yīng)形成免疫復(fù)合物。負染制樣后透射顯微鏡下觀察，在8萬倍下可觀察到子彈狀的典型狂犬病病毒粒子(圖5)。

2.6 病毒顆粒電鏡檢測

將狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株病毒液和親本SRV9株的病毒液同步接毒去感染細胞，收集細胞制樣后，在3萬倍和5萬倍透射電子顯微鏡下可見大量聚集彈狀的狂犬病病毒形態(tài)的顆粒(圖6)。

3 討論

狂犬病病毒SRV9株是SAD株在BHK-21細胞系上通過空斑和動物腦內(nèi)接種得到的弱毒疫苗株，具有較好免疫原性，并且對多種動物無致病性，對機體的保護率可達100%，優(yōu)于SAD株[7-9]?？袢〔《净蚪M中，位于G-L基因之間的間隔區(qū)是一個高度保守的特征性匿名區(qū)域[10]。據(jù)研究報道Ψ區(qū)的缺失不會對狂犬病病毒的擴散和致病性等生命活動造成影響，同時也證實該區(qū)域有在神經(jīng)細胞定位和表達外源基因的能力[2]。本研究通過缺失Ψ區(qū)進行病毒的拯救及鑒定，為后續(xù)的研究工作提供了理論依據(jù)。

狂犬病病毒為單股負鏈RNA病毒，在復(fù)制表達的過程中不需要DNA階段，只在構(gòu)建狂犬病病毒基因組感染性cDNA時，對其進行分子水平的操作[11]。裸露的狂犬病病毒基因組RNA無感染性，感染性狂犬病病毒的必須與N蛋白形成復(fù)合物，以保護RNA自身不被降解，同時還需要L蛋白與P蛋白配合充當RNA聚合酶的功能，共同構(gòu)成具有活性的RNA復(fù)合物后，才可進行狂犬病病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[10]。因此，狂犬病病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，不僅需要病毒的全長基因組的參與，同時也需要N、P和L蛋白的協(xié)同。雖然G蛋白不是病毒拯救過程中必要組成成分，但已有相關(guān)研究認定若增加G蛋白可不同程度的提高狂犬病病毒的拯救效率[12-13]。狂犬病病毒的M蛋白可能對病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制起到調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)的程度主要與M蛋白濃度有關(guān)[14]。在狂犬病病毒研究過程中，大量文獻主要是以添加3或4個輔助質(zhì)粒(N、P和L蛋白或G蛋白)進行病毒的拯救[10,15-17]，而本研究在建立狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株反向遺傳操作系統(tǒng)的電穿孔轉(zhuǎn)染細胞部分的試驗中不僅加入病毒全長感染性cDNA，同時加入了N、P、M、G和L各自的輔助表達質(zhì)粒，提高了病毒的復(fù)制水平[18]，進一步提高狂犬病病毒的拯救效率。

A.光學(xué)顯微鏡下正常BHK-21細胞；B.正常BHK-21細胞的陰性對照；C.只轉(zhuǎn)染了輔助質(zhì)粒；D.轉(zhuǎn)染全長基因組表達質(zhì)粒；E.重組病毒感染BHK-21；F.親本毒株感染BHK-21陽性對照

A.Normal BHK-21 cells under light microscope; B:normal BHK-21 cells as negative control;C.Only transfection of auxiliary plasmid; D.Transfection of entire length plasmid; E.Recombinant virus infected BHK-21; F.Parent strain infected BHK-21 as positive control

圖3間接免疫熒光檢測結(jié)果(200×)

Fig.3 Indirect immunofluorescence test results(200×)

1.空白細胞；2.親本毒株病毒液；3.重組毒株病毒液

1.Blank cells; 2.Recombinant virus; 3.Parent strain

圖4 Western-blot檢測G蛋白水平結(jié)果

Fig.4 Detection of G protein levels by Western-blot

Schnell M J等[2]首次成功建立了狂犬病病毒(SADB19株)的反向遺傳操作系統(tǒng)。隨后，Inoue K等[19]在病毒全長基因組感染性cDNA的3′端添加HamRz、5′端添加HdvRz序列。將HEP-Flury株的病毒cDNA插入至真核表達載體pcDNA3.1的CMV啟動子下游，利用真核細胞聚合酶Ⅱ啟動cMV啟動子的高效表達，在不同的細胞系上拯救出HEP-Flury株。本研究將狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株感染性cDNA連接真核表達載體pcDNA3.1的CMV啟動子下游，同時在基因組的兩端分別添HamRz和HdvRz，利用BHK-21細胞，在細胞體內(nèi)完成重組DNA反轉(zhuǎn)錄，成功拯救出具有感染性的缺失Ψ區(qū)狂犬病病毒株。

細胞轉(zhuǎn)染方法有脂質(zhì)體法、電穿孔法、磷酸鈣沉淀法及逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法[20-21]。電穿孔轉(zhuǎn)染細胞法有效的將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎麅?nèi)，操作簡單、安全性好、轉(zhuǎn)染效率高適用性較為廣泛，但由于較大的電壓刺激使得部分細胞經(jīng)電轉(zhuǎn)后死亡[5]。通過多次的電穿孔轉(zhuǎn)染細胞法總結(jié)發(fā)現(xiàn)：①轉(zhuǎn)染時需使用最佳的細胞狀態(tài)，轉(zhuǎn)染成功率會增加。②轉(zhuǎn)染時所用質(zhì)粒一定是去除內(nèi)毒素的高純質(zhì)粒，使用時進行分裝，盡量避免反復(fù)凍融。③轉(zhuǎn)染后拯救的新病毒不穩(wěn)定，不要直接凍融收毒，在擴大培養(yǎng)五代以上后，待病毒穩(wěn)定后，再進行后續(xù)試驗。采用此方法能有效地提高大片段載體轉(zhuǎn)染效率，本研究利用電穿孔轉(zhuǎn)染細胞法進行病毒拯救，有效地提高了細胞轉(zhuǎn)染效率。

本研究采用間接免疫熒光、RT-PCR、Western-blot和透射電子顯微鏡進行拯救毒株的鑒定，結(jié)果證實利用電穿孔轉(zhuǎn)染法成功拯救出狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株，驗證了缺失Ψ區(qū)的病毒株并不影響G蛋白的表達。通過對親本毒株與拯救毒株電子顯微鏡的形態(tài)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失Ψ區(qū)后狂犬病病毒的形態(tài)仍保持原有彈狀形態(tài)，說明缺失Ψ對狂犬病病毒的形態(tài)影響較小。

本研究成功建立了狂犬病病毒SRV9 Ψ區(qū)缺失株的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，利用電轉(zhuǎn)染法能夠提高轉(zhuǎn)染效率，為進一步研究狂犬病病毒SRV9株基因組的結(jié)構(gòu)功能間的關(guān)系及后續(xù)開展狂犬病相關(guān)新型疫苗研究等奠定了基礎(chǔ)。

A.親本SRV9株的病毒液負染后透射電鏡觀察；B.重組病毒液負染后透射電鏡觀察

A.Negative staining parent strain SRV9 observed by electron microscope; B.Negative staining recombinant virus observed by electron microscope

圖5透射電子顯微鏡觀察結(jié)果

Fig.5 Transmission electron microscopy images

A.親本SRV9株的病毒顆粒電鏡觀察；B.拯救病毒顆粒電鏡觀察

A.Viral particles of parent strain SRV9 observed by electron microscope; B.Rescued recombinant viral particles observed by electron microscope

圖6透射電子顯微鏡觀察結(jié)果

Fig.6 Transmission electron microscopy images

[1] 扈榮良,張守峰,劉 曄.我國狂犬病預(yù)防和控制建議[J].中國人獸共患病學(xué)報,2012,28(5):487-491.

[2] Schnell M J.Infectious rabies viruses from cloned cDNA.[J].Embo J,1994,13(13):4195-4203.

[3] 劉曉娟,趙曉飛,曾貝妮,等.電穿孔法轉(zhuǎn)染293T細胞條件的優(yōu)化[J].生物學(xué)通報,2014,49(11):52-54.

[4] 張禾璇,單可人,何 燕,等.脂質(zhì)體法與電穿孔法轉(zhuǎn)染兩種細胞效率的比較[J].重慶醫(yī)學(xué),2014(33):4432-4433.

[5] Takei H,Baba Y,Hisatsune A,et al.Glycyrrhizin inhibits interleukin-8 production and nuclear factor-kappaB activity in lung epithelial cells,but not through glucocorticoid receptors.[J].J Pharmacol Sci,2008,106(3):460-468.

[6] 盧 莎,譚文杰,張 玲,等.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與電轉(zhuǎn)染法在丙型肝炎病毒RNA 轉(zhuǎn)染人肝癌細胞中的應(yīng)用效果比較[J].山東醫(yī)藥,2016,56(19):15-18.

[7] 李 茂.動物狂犬病弱毒疫苗生產(chǎn)工藝的建立及免疫試驗研究[D].吉林大學(xué),2007.

[8] 侯世寬,岳軍明.狂犬病口服疫苗株的篩選、鑒定和實驗免疫研究[C]:全國狂犬病、布氏菌病、弓形蟲實驗診斷新技術(shù)討論會,1995.

[9] 錢愛東,侯世寬.狂犬病無毒疫苗株SRV9G基因主要功能區(qū)的序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,1997(6):20-23.

[10] 薛向紅.狂犬病病毒CVS-11株感染性cDNA克隆的構(gòu)建及其應(yīng)用[D].吉林吉林：吉林大學(xué),2014.

[11] Conzelmann K K.Reverse genetics of mononegavirales:The rabies virus paradigm[M].Springer Japan,2013.

[12] Sato S,Ohara S,Tsutsui K,et al.Effects of G-gene deletion and replacement on rabies virus vector gene expression[J].PLoS One,2015,10(5):e128020.

[13] Morimoto K,Foley H D,Mcgettigan J P,et al.Reinvestigation of the role of the rabies virus glycoprotein in viral pathogenesis using a reverse genetics approach.[J].J Neurovirol,2009,6(5):373-381.

[14] Finke S,Conzelmann K K.Dissociation of rabies virus matrix protein functions in fegulation of viral RNA synthesis and virus assembly[J].J Virol,2003,77(22):12074-12082.

[15] Huang Y,Tang Q D S,Zhang S,et al.Development of a reverse genetics system for a human rabies virus vaccine strain employed in China[J].Virus Res,2010,149(1):28-35.

[16] Wu X,Rupprecht C E.Glycoprotein gene relocation in rabies virus[J].Virus Res,2008,131(1):95-99.

[17] 劉 瀾,李士成,陳小云,等.重組表達3G蛋白狂犬病病毒株的構(gòu)建及重組病毒相關(guān)特性的研究[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2016(3):326-331.

[18] Mebatsion T,Weiland F,Conzelmann K K.Matrix protein of rabies virus is responsible for the assembly and budding of bullet-shaped particles and interacts with the transmembrane spike glycoprotein G[J].J Virol,1999,73(1):242-250.

[19] Inoue K,Shoji Y,Kurane I,et al.An improved method for recovering rabies virus from cloned cDNA.[J].J Viro Meth,2003,107(2):229-236.

[20] 李 進,洪光祥,王發(fā)斌,等.Lipofectamine介導(dǎo)轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞的研究[J].中華實驗外科雜志,2005,22(3):357-358.

[21] 趙 宇,陸應(yīng)麟,喬 群,等.綠色熒光蛋白基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細胞及表達的研究[J].中華實驗外科雜志,2004,21(1):24-25.

RescueandIdentificationofRabiesVirusSRV9ΨAeraDelectionstrainbyElectroporationTransfection

MAO Li-ping,WEI Yu-yuan,WANG Wei,ZHAI Shao-hua,CHENG Yao,WEN Zhao-hai,JIAN Zi-jian

(CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China)

The aim of the study was to investigate the rescue and identification of recombinant virus of SRV9 without pseudo gene Ψ region via electroporation transfection.The purified deleted pseudo gene Ψ region pCDNA-NPMG-L and the helper plasmids pcDNA-N，pcDNA-P，pcDNA-M，pcDNA-G and pcDNA-L were co-transfected into BHK-21 cells via electroporation transfection for virus rescue，and the BHK21 cells were used for blind passages of the recombinant rabies virus.The recombinant rabies virus SRV9 deleted pseudo gene Ψ region was identified by RT-PCR,indirect immunofluorescence,Western-blot and electron microscopy.The results showed that the recombinant virus could produce green fluorescence in the indirect immunofluorescence assay,the typical rhabdovirus was observed by transmission electron microscopy.The recombinant strain and the parent strain G protein were subjected to Western-blot to obtain the corresponding target band.The above results showed that transfection through electroporation cells in this experiment was able to rescue its recombinant virus SRV9 ψ region deletion strain.This study provided a new transfection method for rescue of virus,and can effectively improve the transfection efficiency,and provide effective theoretical basis and practical basis for the development of new rabies virus vaccine.

Rabies virus; electroporation transfection; SRV9 deleted pseudo gene Ψ region; rescue

2017-04-02

國家自然科學(xué)基金項目(31360623)；研究生科研創(chuàng)新項目(XJAUGRI2015017)

毛麗萍(1989-)，女，安徽碭山人，碩士研究生，主要從事動物分子與免疫病理學(xué)研究?！魍蓉暙I作者。

*

S852.659.6

A

1007-5038(2017)11-0022-06