烏雞低聚肽鐵的分離純化及結構鑒定

劉文穎，谷瑞增，蔡木易，魯 軍

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京100015）

烏雞低聚肽鐵的分離純化及結構鑒定

劉文穎，谷瑞增，蔡木易，魯 軍*

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京100015）

為了考察烏雞低聚肽鐵中肽段的結構，以烏雞為原料，以氯化亞鐵為鐵源制備烏雞低聚肽鐵，對其總蛋白質質量分數(shù)、螯合率、得率進行測定，結果表明烏雞低聚肽鐵總蛋白質質量分數(shù)為（56.79±0.18）%，螯合率為（83.53±0.15）%，得率為（40.86±0.14）%。 然后利用反相高效液相色譜（RP-HPLC）對其進行分離純化，收集4個組分峰，利用四極桿飛行時間串聯(lián)質譜儀（QTOF質譜儀）測定肽序列，分析出1個肽段，氨基酸序列為Thr-Ser-Gly-Met-Pro，相對分子質量為491.56。

烏雞低聚肽；肽鐵螯合物；分離純化；結構鑒定

烏雞俗稱烏骨雞，是我國特有的食藥兩用雞種，含有豐富的營養(yǎng)成分，是優(yōu)質的蛋白質來源[1-4]。

鐵是人體所必需的微量元素之一，缺鐵會導致多種疾病的發(fā)生[5-7]。目前，主要通過服用補鐵劑來防治缺鐵性貧血，補鐵劑主要有無機鐵、有機鐵、氨基酸鐵和生物鐵等。多肽鐵螯合物是一種新型的生物鐵，可直接被腸黏膜細胞吸收，吸收率遠較無機鐵和有機鐵高，并且無消化道刺激，是理想的補鐵劑[8-11]。此外，通過制備烏雞低聚肽鐵還可以協(xié)同烏雞肽的免疫調節(jié)、抗氧化和促進礦物質吸收等功能，多方面強化烏雞補鐵的功效。

目前，國內(nèi)外對烏雞低聚肽鐵的研究主要集中在制備和優(yōu)化水解條件等方面，有關烏雞低聚肽鐵的分離純化、結構鑒定的文章并不多見。作者通過工藝優(yōu)化制備出烏雞低聚肽鐵，并對其穩(wěn)定性進行了研究[12-13]。在對其總蛋白質、螯合率、得率進行分析的基礎上，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）對其進行分離純化，利用四極桿飛行時間串聯(lián)質譜儀（Q-TOF質譜儀）鑒定肽段結構，以期為利用烏雞開發(fā)生物補鐵劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 烏雞：市售；Alcalase 2.4L、木瓜蛋白酶：諾維信（中國）生物技術有限公司產(chǎn)品；乙腈：色譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品；三氟乙酸：分析純，英國Alfa Aesar公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 FE20K型pH計：瑞士METTLER TOLEDO公司產(chǎn)品；YG30噴霧干燥機：無錫市陽光干燥設備有限公司產(chǎn)品；FD-1A-50冷凍干燥機：北京華圣科儀實驗設備有限公司產(chǎn)品；LC-20AD型高效液相色譜儀：日本島津公司產(chǎn)品；Q-TOF2正交加速電噴霧串聯(lián)質譜儀：英國Micromass公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 烏雞低聚肽鐵的制備 將烏雞除去內(nèi)臟后切塊，用絞肉機絞碎→加適量水用勻漿機勻漿→調節(jié)pH值為8.5，溫度為60℃，以3 000 U/g蛋白質的酶量加入Alcalase 2.4L，酶解2 h→調節(jié)pH值為7.0，溫度保持60℃，以2 500 U/g蛋白質的酶量加入木瓜蛋白酶，酶解2 h→升溫至100℃，滅酶10 min→6 000 g離心15 min，取上清液→用截留相對分子質量為2×106的陶瓷膜過濾，取中間清液→用截留相對分子質量為1 000的超濾膜超濾，得到相對分子質量小于1 000的濾過液→噴霧干燥，得到烏雞低聚肽干粉→將8 g烏雞低聚肽干粉，溶解于200 mL蒸餾水中，加入2.0 g抗壞血酸防止亞鐵離子被氧化→調節(jié)pH值為5。加入2.0 g FeCl2·4H2O，50℃下水浴反應60 min，冷卻至室溫→加入4倍體積的無水乙醇，室溫放置1 h→抽濾收集沉淀，干燥后得到烏雞低聚肽鐵干粉→干燥器中保存?zhèn)溆肹13-15]。

1.2.2 烏雞低聚肽鐵指標測定 總蛋白質質量分數(shù)測定采用凱氏定氮法[16]。螯合率和得率的測定參照文獻[12]。采用鄰菲羅啉比色法測定鐵的含量。稱取0.05 g烏雞低聚肽鐵，加入1 mL鹽酸溶解，配制成質量分數(shù)0.1%烏雞低聚肽鐵溶液。稱取1 mL溶液于50 mL容量瓶中，按照標準曲線操作步驟測定其吸光度。

1.2.3 RP-HPLC分離烏雞低聚肽鐵 利用RPHPLC對烏雞低聚肽鐵進行分離純化。色譜條件為：流動相 A：V（水）∶V（三氟乙酸）=100∶0.1；流動相 B：V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=80∶20∶0.1；樣品質量濃度：10 mg/mL； 進樣體積：100 μL； 流量：0.6 mL/min；檢測波長：UV220 nm；柱溫：32℃。梯度洗脫程序：0～20 min，流動相 B：0%～5%；20～30 min，流動相B：5%～5%；30～80min， 流動相 B：5%～25%；80～90 min，流動相B：25%～80%；90～100 min，流動相B：80%～80%。選擇主要的組分峰進行收集，然后用氮吹儀將組分峰中的三氟乙酸、乙腈等有機溶劑除去，利用凍干機進行冷凍干燥，-20℃保存?zhèn)溆肹17-18]。

1.2.4 Q-TOF MS測定相對分子質量及肽序列 利用Q-TOF2正交加速電噴霧串聯(lián)質譜儀對烏雞低聚肽鐵的結構進行鑒定。首先進行一級質譜掃描，得到ESI-MS圖。從ESI-MS圖中選出待測離子，然后進行ESI-MS/MS分析。質譜圖經(jīng)Micromass的MaxEnt 3轉換后，由Peptide Sequencing推導出肽段序列。質譜條件為：離子化方式：納升電噴霧正離子；霧化氣體：N2；碰撞氣體：Ar；錐孔電壓：50 V；TOF加速電壓：9.1 kV；MCP檢測器電壓：2 150 V；毛細管電壓：800 V；源溫：80℃；MS和MS/MS的質量準確度：0.1[19-20]。

2 結果與討論

2.1 烏雞低聚肽鐵的總蛋白質量分數(shù)、螯合率和得率

結果表明，烏雞低聚肽鐵的總蛋白質量分數(shù)為（56.79±0.18）%，螯合率為（83.53±0.15）%，得率為（40.86±0.14）%。表明烏雞低聚肽鐵中蛋白質質量分數(shù)較高，并且具有較高的螯合率和得率。

2.2 烏雞低聚肽鐵的分離純化

分離純化方法主要有超濾、聚丙烯酰胺凝膠電泳、高效液相色譜、離子交換層析、凝膠過濾色譜等手段。其中，反相高效液相色譜（RP-HPLC）法是多肽分離純化時最常用，也是最有效的方法。RPHPLC法是根據(jù)多肽的極性強弱進行分離的，具有很好的分離效果。與其它色譜方法相比，RP-HPLC法具有色譜過程穩(wěn)定、重復性好、分辨率高、操作簡便等優(yōu)勢[21，22]。烏雞低聚肽鐵的RP-HPLC分離色譜圖如圖1所示。烏雞低聚肽鐵經(jīng)RP-HPLC分離后，得到4個主要的組分峰，集中在色譜圖的前10 min。RP-HPLC能夠使得相鄰或相近極性的多肽富集在一起，親水性組分先被洗脫出來，而疏水性組分后被洗脫出來，因此這4個組分峰都是親水性強的組分。將其分別命名為組分1～4，分管收集、冷凍干燥后進行質譜分析。

圖1 烏雞低聚肽鐵的RP-HPLC分離色譜圖Fig.1 RP-HPLC separation chromatogram of BSFP-Fe

2.3 烏雞低聚肽鐵的肽序列測定

利用Q-TOF質譜儀對收集得到的4個組分峰進行分析。該質譜儀采用電噴霧電離源（ESI）和飛行時間檢測器（TOF），通過對各個組分二級質譜的碎片離子的質譜圖進行解譜得到肽段的結構[23，24]。

組分3的一級質譜圖如圖2所示，利用Q-TOF質譜儀從烏雞低聚肽鐵的組分3中分析出1個肽段序列，這說明組分3含有的是單一性成分，肽段的氨基酸序列為Thr-Ser-Gly-Met-Pro（圖3），相對分子質量為491.56。組分3是烏雞低聚肽鐵最大的組分峰，其余3個組分中未檢測出肽段結構，可能是鹽類等物質。Fe2+與多肽是以離子鍵和配位鍵形式結合的，也有一部分是以物理吸附形式沉積在多肽鐵表面，從質譜中未發(fā)現(xiàn)Fe2+峰，這表明Fe2+與小肽結合得較弱，在電離過程中脫落下來，因此未檢測出來。五肽Thr-Ser-Gly-Met-Pro不同的部位均可與Fe2+發(fā)生螯合作用，與Fe2+發(fā)生螯合的位置可能是-NH-、NH2、-COOH和-OH這幾個基團，從而形成不同的螯合物[25]。

圖2 組分3的一級質譜圖Fig.2 MS spectrum of fraction 3

圖3 肽段的二級質譜圖Fig.3 MS spectrum of amino acid sequence of peptide

3 結語

作者以烏雞為原料，以氯化亞鐵為鐵源制備出烏雞低聚肽鐵，其總蛋白質質量分數(shù)為 （56.79±0.18）%，螯合率為（83.53±0.15）%，得率為（40.86±0.14）%。利用RP-HPLC對其進行分離純化，收集4個主要的組分峰，利用Q-TOF質譜儀進行結構測定，從組分3中鑒定出一個肽段，氨基酸序列為Thr-Ser-Gly-Met-Pro，相對分子質量為491.56。作者究明確了烏雞低聚肽鐵的肽段結構，為生物補鐵制劑的開發(fā)利用提供了一定的理論支持，同時拓寬了烏雞的應用領域。

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Separation，Purification and Structural Identification of Iron-Chelating Black-Bone Silky Fowl Oligopeptides

LIU Wenying，GU Ruizeng，CAI Muyi，LU Jun*
（Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

In order to investigate the structure of peptides fromiron-chelating black-bone silky fowloligopeptides（BSFP-Fe），BSFP-Fe wasprepared by using black-bone silky fowl as raw material andiron chloride as iron resource.The total protein content，chelating rate and yield were determined.Results showed that the total protein content，chelating rate and yield were 56.79±0.18%，83.53±0.15%and 40.86±0.14%，respectively.Then，BSFP-Fe was separated and purified by reversed phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC）.A total of4 fractions were collected and subjected to Q-TOF mass spectrometer to identify peptide sequences.One peptide，Thr-Ser-Gly-Met-Pro，was identified and its molecular weight was 491.56 u.This studyconfirmed the structure of peptides from BSFP-Feand provided certain theoretical support for the development of BSFP-Fe as iron supplement food.

black-bone silky fowloligopeptides，iron-chelating peptides，separation and purification，structural identification

TS 201.4

A

1673—1689（2017）10—1036—04

2015-09-15

國家863計劃項目 （2013AA102205-02）；國家 “十二五”科技支撐項目 （2012BAD33B04-02）；北京市科技計劃項目（Z131100003113010）；科技北京百名領軍人才培養(yǎng)工程項目（Z131110000513026）。

劉文穎（1984—），女，河北保定人，工學碩士，工程師，主要從事食源性低聚肽研究。E-mail：wenyingliu888@126.com

*通信作者：魯 軍（1973—），男，安徽六安人，理學博士，高級工程師，主要從事食品營養(yǎng)與生物技術研究。E-mail：johnljsmith@163.com

劉文穎，谷瑞增，蔡木易，等.烏雞低聚肽鐵的分離純化及結構鑒定[J].食品與生物技術學報，2017，36（10）：1036-1039.