米曲霉形態(tài)與曲酸生產(chǎn)的關(guān)系

華 珊，楊海泉，鄒 偉，陳獻(xiàn)忠，沈 微*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000）

米曲霉形態(tài)與曲酸生產(chǎn)的關(guān)系

華 珊1，楊海泉1，鄒 偉2，陳獻(xiàn)忠1，沈 微*1

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000）

以米曲霉為出發(fā)菌株生產(chǎn)曲酸，通過改變培養(yǎng)基濃度和孢子接種量來研究曲酸生產(chǎn)關(guān)鍵因素對A.oryzae菌體形態(tài)的影響，進(jìn)一步通過不同形態(tài)菌體發(fā)酵分析菌體形態(tài)與曲酸生產(chǎn)的關(guān)系。培養(yǎng)基中的碳氮比對A.oryzae菌球的直徑的大小具有較大影響。當(dāng)孢子濃度為109個/mL時，A.oryzae主要呈菌絲形態(tài)；但當(dāng)孢子濃度為107～108個/mL時，菌體形態(tài)呈現(xiàn)為球狀，并隨著孢子濃度的增大菌球直徑減少。A.oryzae發(fā)酵生產(chǎn)曲酸的最佳形態(tài)為菌球，并且菌球直徑與曲酸合成能力關(guān)系密切，菌球直徑為0.25～0.35 mm時，單位細(xì)胞曲酸積累量最高。

曲酸；米曲霉；形態(tài)；菌球

曲酸是一種與葡萄糖結(jié)構(gòu)相似的有機(jī)酸，是由好氧微生物利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于酒類、醬油及豆瓣醬等釀造產(chǎn)品中。目前，國內(nèi)外主要利用米曲霉（Aspergillus oryzae）及不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉（A.flavus）發(fā)酵生產(chǎn)曲酸。由于具有抑菌能力、抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性、與金屬離子螯合等性質(zhì)，曲酸常用作防腐劑、保鮮劑、殺蟲劑、抗菌劑等，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品及化妝品等各個行業(yè)[1]。國內(nèi)外對曲酸的生產(chǎn)進(jìn)行了許多研究，主要集中在高產(chǎn)菌株的篩選、培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)條件及過程的優(yōu)化等方面[2]。

曲霉作為典型的絲狀真菌，液態(tài)深層發(fā)酵與其他單細(xì)胞微生物相比，一個顯著的特征是個體形態(tài)具有明顯的變化，易形成多種形態(tài)，使其發(fā)酵過程變得復(fù)雜與難以控制。絲狀真菌在液態(tài)發(fā)酵過程中菌體形態(tài)主要分為絲狀、球狀、團(tuán)狀，這主要由自身的遺傳特性與環(huán)境因素共同影響。菌體的形態(tài)受多個基因調(diào)控，影響曲霉屬菌體形態(tài)發(fā)育的基因主要有hypA/podA、hypC、swoF和sepA等。通過這些基因編碼的蛋白質(zhì)維持菌絲極性、控制細(xì)胞大小或細(xì)胞間隔膜的間距、組織肌動蛋白微絲和促進(jìn)菌絲尖端生長等來改變菌體形態(tài)[3]。影響菌體形態(tài)的環(huán)境因素主要包括培養(yǎng)基組成 （如碳氮源的種類及濃度、磷酸鹽的水平、金屬離子的添加等）、環(huán)境條件（如溫度、pH、溶解氧及二氧化碳水平、機(jī)械剪切力、通氣量等）、接種量、孢子形狀、表面活性劑的種類、補料方式等[4-6]。

對于絲狀真菌而言，菌體的外觀和微觀上的變化與酶、代謝產(chǎn)物的合成及分泌有著密切的關(guān)系，也會導(dǎo)致整個發(fā)酵過程參數(shù)（如流變性等）截然不同，對目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率有重要影響。發(fā)酵不同產(chǎn)物達(dá)到最高發(fā)酵強(qiáng)度的菌體最佳形態(tài)也不相同。例如，里氏木霉（Trichoderma reesei）合成組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）時菌體以松散的菌絲體形態(tài)生長有利于t-PA的合成；德氏根霉（Rhizopus delemar）發(fā)酵生產(chǎn)延胡索酸的最佳形態(tài)為菌球[7-8]。作者通過考察環(huán)境因素對米曲霉菌體形態(tài)的影響，并由此調(diào)控A.oryzae深層培養(yǎng)過程中的菌絲形態(tài)來研究菌體形態(tài)與曲酸生產(chǎn)之間的關(guān)系，獲得曲酸高產(chǎn)的最適菌體形態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 A.oryzae （CCTCC NO：M2014436）保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 試劑 曲酸標(biāo)準(zhǔn)樣品：Aladdin公司產(chǎn)品；葡萄糖：山東西王生化科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖50，玉米淀粉 10，酵母提取物 5，KH2PO45，MgSO4·7H2O 2.5，瓊脂20，pH 6.0；種子培養(yǎng)基 （g/L）：葡萄糖 （60～160），玉米淀粉 10，酵母提取物（2.5～15），KH2PO45，MgSO4·7H2O 2.5，pH 6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 120，酵母提取物 3，豆餅粉 5，KH2PO42，MgSO4·7H2O 0.5，pH 6.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 生孢培養(yǎng)：從-70℃的甘油保藏管中取一環(huán)孢子懸液接種于斜面培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d；種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)5 d的成熟孢子用無菌生理鹽水洗下，經(jīng)玻璃珠打散后過濾制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)。將孢子懸浮液轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200 r/min，在30℃下恒溫?fù)u床培養(yǎng)30 h；發(fā)酵培養(yǎng)：按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量，將液體種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為250 mL三角瓶中裝入30 mL培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速200 r/min，30℃下恒溫?fù)u床培養(yǎng)4 d。

1.2.2 分析方法 曲酸測定：采用三氯化鐵比色法測定[9]；生物量測定：采用干質(zhì)量法，將發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后用蒸餾水洗滌，置于干燥箱中65℃烘干至恒重，用稱重法測定其生物量；菌體形態(tài)測定：光學(xué)顯微鏡觀察并拍攝，菌球直徑用顯微鏡標(biāo)尺測量；粘度測定：取30 mL發(fā)酵液用Brookfield DV-S數(shù)顯粘度計進(jìn)行測定，選用轉(zhuǎn)子型號為4#，轉(zhuǎn)速為60%。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基關(guān)鍵組分對菌球形成的影響

培養(yǎng)基成分及濃度對絲狀真菌菌體生長代謝至關(guān)重要，能顯著影響菌體的形態(tài)。將制成的孢子濃度為107～108個/mL的懸浮液分別接種到含不同碳氮比的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 h，其對菌球大小與生物量的影響見圖1。

圖1 種子培養(yǎng)基底物濃度對菌球直徑與生物量的影響Fig.1 Effect of glucose and yeast extract concentrations on pellet sizeand DCWduring preculture

結(jié)果表明，培養(yǎng)基組分中不同碳氮比對米曲霉菌球大小與生物量有顯著的影響。當(dāng)酵母提取物質(zhì)量濃度為10 g/L保持不變時，隨著碳氮比的不斷增加，A.oryzae菌球直徑從0.230 mm逐漸增大到0.463 mm，生物量也表現(xiàn)出隨著碳氮比的增加而增大的規(guī)律。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L時，改變酵母提取物濃度，使碳氮比值從40∶1降低至10∶1時，A.oryzae菌球直徑從0.521 mm降低到0.265 mm。之后，隨著碳氮繼續(xù)減小，菌球直徑也增大。但隨碳氮比減小，A.oryzae的生物量變化趨勢先增加后降低。在碳氮為 10∶1時，生物量最大 （8.5 g/L）。Papagianni等[10]研究A.niger產(chǎn)檸檬酸時也得到相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度較低時可促進(jìn)菌絲分支，菌球直徑也較小。Bai等[11]在研究米根霉（Rhizopus oryzae）產(chǎn)乳酸的過程中發(fā)現(xiàn)NH4NO3能促進(jìn)R.oryzae形成菌球，且隨著NH4NO3濃度的升高，菌球直徑變大，生物量也逐漸增多。蔣雪薇等[12]研究發(fā)現(xiàn)（NH4）2SO4濃度過大時R.oryzae菌體容易形成菌絲團(tuán)塊。Du等[13]研究發(fā)現(xiàn)不同的氮源可能導(dǎo)致華根霉（R.chinensis）形成不同的菌體形態(tài)。因此培養(yǎng)基底物組分及其濃度對菌體的形態(tài)有著明顯的影響。

2.2 孢子濃度對菌球形成的影響

在液體發(fā)酵過程中，孢子懸浮液濃度能夠直接影響孢子的聚集特性，對菌體形態(tài)有著至關(guān)重要的影響，作者測定分析了孢子懸浮液濃度對A.oryzae菌體形態(tài)的影響。

圖2 孢子濃度對菌體形態(tài)及菌球直徑的影響Fig.2 Effects of spores concentration on fungal morphology and pellet size during preculture

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)孢子懸浮液濃度為107～108個/mL時，A.oryzae 主要形成菌球（圖 2（a）），且在一定范圍內(nèi)菌球直徑與孢子濃度呈負(fù)相關(guān)，即孢子懸浮液濃度越高，菌球直徑越小，接種孢子濃度為2×107個/mL的菌球直徑為是孢子濃度為1.2×108個/mL的 3.61 倍（圖 2（b））。 張一竹等[5]和 Bai等[11]研究也發(fā)現(xiàn)在一定孢子濃度范圍內(nèi)隨著孢子接種量增加形成的菌球直徑逐漸變小。這可能是由于培養(yǎng)液中孢子懸浮液濃度偏高時，孢子碰撞接觸機(jī)會多，從而孢子聚集形成的初始晶核和生成的菌絲較多。菌球之間存在競爭生長空間，因而形成數(shù)量較多但較小的菌球。當(dāng)孢子懸浮液濃度增大至109個/mL時，A.oryzae主要呈菌絲形態(tài)（圖2（a））。據(jù)報道，孢子接種量對A.niger菌體形態(tài)的影響也存在類似的規(guī)律，當(dāng)孢子接種量為104～105個/mL時，A.niger菌體形態(tài)主要為菌球；當(dāng)孢子接種量為108～109個/mL時，菌體主要呈松散的菌絲狀[14]。Teng等[15]研究接種量對R.chinensis形態(tài)影響時發(fā)現(xiàn)孢子接種量為106～107個/30 mL時，呈塊狀菌絲體，接種量為108個/30 mL時卻為松散菌絲體。

2.3 轉(zhuǎn)速對菌球形成的影響

米曲霉是好氧絲狀真菌，溶氧水平對菌體生長及形態(tài)有重要影響。溶氧與轉(zhuǎn)速/攪拌具有密切關(guān)系。同時，不同轉(zhuǎn)速/攪拌帶來的流體流動與剪切力也會顯著影響菌體的形態(tài)。Park等考察了攪拌強(qiáng)度對蛹蟲草（Cordyceps militaris）菌體形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min時，菌球直徑小并且光滑，但當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為50 r/min時，菌球大而松散[16]。因此，研究中考察了培養(yǎng)過程中搖瓶轉(zhuǎn)速對菌球形成的影響。如圖3所示，當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時，A.oryzae菌球直徑為0.624 mm；轉(zhuǎn)速為200 r/min時，菌球直徑明顯減小，僅為0.263 mm。進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)速至250 r/min，菌球直徑較200 r/min時略有減小。結(jié)果表明，提高轉(zhuǎn)速有利于菌球直徑的減小。在高轉(zhuǎn)速條件下，液體流動快、剪切力大，形成的菌球直徑小。喬雙逵[17]研究100、150、200 r/min 3種轉(zhuǎn)速對靈芝菌體形態(tài)的影響時，也發(fā)現(xiàn)增加轉(zhuǎn)速有利于中小型菌球的形成，轉(zhuǎn)速越高，剪切力越大，小型菌球比例增大及菌球平均直徑減小。

圖3 轉(zhuǎn)速對菌球直徑的影響Fig.3 Effects ofrotation rate on pellet size during preculture

2.4 基于形態(tài)的曲酸發(fā)酵優(yōu)化

在液體發(fā)酵過程中，菌體的形態(tài)會影響發(fā)酵液的粘度、溶解氧等因素，進(jìn)而影響目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。作者中分析了不同A.oryzae菌體形態(tài)對發(fā)酵液粘度、曲酸產(chǎn)量、菌體干重等影響。實驗過程中，首先分析了在對數(shù)生長中期 （24 h）、對數(shù)生長末期（48 h）和發(fā)酵結(jié)束（96 h）時，不同菌體形態(tài)與發(fā)酵液流變性之間的相關(guān)性。由圖4可見，發(fā)酵液的表觀粘度從對數(shù)生長中期到發(fā)酵結(jié)束整個過程中都有明顯的增加。這可能是由于前期菌體的生長和后期代謝產(chǎn)物的分泌使發(fā)酵液變得更加粘稠。在發(fā)酵過程中菌體形態(tài)為菌絲時的發(fā)酵液表觀粘度是菌球時的數(shù)倍。松散菌絲體在液態(tài)發(fā)酵過程中互相纏繞，導(dǎo)致發(fā)酵液粘度大、流動性低，相比而言，菌體為菌球時表面較光滑，發(fā)酵液粘度更低，流動性更好。

圖4 菌體形態(tài)與發(fā)酵液表觀粘度的關(guān)系Fig.4 Relationships between fungal morphology and apparent viscosity in different periods of time

研究中進(jìn)一步分析了菌體形態(tài)對A.oryzae生產(chǎn)曲酸的影響。與菌絲相比，菌體形態(tài)為菌球時，A.oryzae的產(chǎn)酸能力較高，此時其曲酸積累量達(dá)到15.11 g/L。菌球狀態(tài)下A.oryzae的單位細(xì)胞合成曲酸的能力是菌絲狀態(tài)下的1.35倍，A.oryzae發(fā)酵生產(chǎn)曲酸的最佳形態(tài)為菌球。這與高倩等[18]的研究結(jié)果相似，土曲霉（A.terreus）為菌球時衣康酸產(chǎn)量明顯比菌絲時高。當(dāng)菌體為松散菌絲體時，發(fā)酵液表現(xiàn)出明顯的非牛頓型流體，粘度大，流動指數(shù)低，從而使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物傳遞不均勻，溶氧水平下降，熱量不能及時擴(kuò)散，嚴(yán)重阻礙菌體利用糖類等底物和氧氣[15]，從而導(dǎo)致細(xì)胞代謝速度偏慢，致使曲酸產(chǎn)量下降。對于球狀菌體，發(fā)酵液流體雖然也是假塑性流體，但相對菌絲而言發(fā)酵液表觀粘度較低，利于傳質(zhì)、傳氧及溶氧[19]。

2.5 菌球直徑對曲酸產(chǎn)量的影響

菌球直徑與細(xì)胞代謝關(guān)系密切，合適的菌球直徑有利于目標(biāo)產(chǎn)物的積累。將不同大小的菌球接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌球直徑與曲酸合成能力的關(guān)系：y=15.197x3-21.559x2+8.604 5x-0.274 3，R2=0.975 1（圖5）。最佳菌球直徑范圍為0.25～0.35 mm，此時單位細(xì)胞合成曲酸能力最強(qiáng)（0.778 g/g），最有利于發(fā)酵生產(chǎn)曲酸。當(dāng)菌球直徑大于0.3 mm時，單位細(xì)胞曲酸積累量隨菌球直徑的增加而降低。菌球直徑越大，對菌球內(nèi)部溶氧及物質(zhì)傳遞的阻礙作用越大。因此，菌球較大時，傳質(zhì)、傳氧速度慢，對營養(yǎng)的利用及細(xì)胞代謝減慢，曲酸產(chǎn)量較低。喬雙逵等在研究靈芝合成胞外多糖時，也發(fā)現(xiàn)中小型菌球比例較高時有利于靈芝合成胞外多糖[20]。當(dāng)菌球直徑小于0.3 mm時，單位細(xì)胞合成曲酸產(chǎn)量不隨菌球直徑的降低而增加。這主要是因為當(dāng)菌體量相同時，菌球直徑過小則數(shù)量較多，使發(fā)酵液粘度增加，同樣不利于營養(yǎng)物質(zhì)及O2的傳遞與利用，從而導(dǎo)致曲酸產(chǎn)量的降低。

圖5 菌球直徑與單位細(xì)胞合成曲酸能力的關(guān)系Fig.5 Relationships between the pellet diameter and yield of kojic acid on DCW

3 結(jié)語

A.oryzae菌球的直徑隨著葡萄糖濃度提高而增大，隨著酵母提取物濃度提高菌球直徑先減小后增大。當(dāng)孢子濃度為109個/mL時，A.oryzae主要呈菌絲形態(tài)，但在107～108個/mL時為菌球，并隨著孢子濃度的增大菌球直徑減少。

菌體形態(tài)為菌球時有利于A.oryzae生產(chǎn)曲酸，且菌球直徑與單位細(xì)胞合成曲酸能力關(guān)系密切。菌球直徑為0.25～0.35 mm時，單位細(xì)胞曲酸積累量最高，可達(dá)0.778 g/g。

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Relationship between Morphology and Kojic Acid Production by Aspergillus oryzae

HUA Shan1，YANG Haiquan1，ZOU Wei2，CHEN Xianzhong1，SHEN Wei*1
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.College of Bioengineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，China）

To investigate the relationship between morphology and kojic acid production.Methods：Using Aspergillus oryzae to producekojic acid，the effect of critical factors on morphologies was studied by manipulating the concentrationof culture mediumand inoculum level，andfermented by different forms of cellto obtain the relationship between morphology and kojic acid production.Carbon/nitrogen ratio （C/N）of medium has great influence on pellet diameter size of A.oryzae.Dispersed mycelia wereformed with 109spores mL-1inoculum，but pellets were obtained under the condition of less spore number107to 108spores mL-1，and with the increasing of spores inoculation pellet diameterdecreased.Furthermore，the yield of kojic acid was closely correlated with pellet size，and the optimal pellet diameter range for higher yield of kojic acid on DCW was 0.25 to 0.35 mm.

kojic aid，Aspergillus oryzae，morphology，pellet

TS 261

A

1673—1689（2017）10—1090—06

2015-10-16

工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室（江南大學(xué)）開放課題基金（KLIB-KF201301）；四川省教育廳自然科學(xué)基金項目（15ZB0204）。

*通信作者：沈 微（1968—），男，江蘇無錫人，工學(xué)博士，副教授，主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail：shenwei_micro@163.com

華珊，楊海泉，鄒偉，等.米曲霉形態(tài)與曲酸生產(chǎn)的關(guān)系[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（10）：1090-1095.