辛伐他汀增強(qiáng)阿司匹林對膠原誘導(dǎo)的血小板活化抑制作用的研究

都虹 郝杰 呼海娟 魯靜朝 楊秀春 崔煒 劉凡

辛伐他汀增強(qiáng)阿司匹林對膠原誘導(dǎo)的血小板活化抑制作用的研究

都虹 郝杰 呼海娟 魯靜朝 楊秀春 崔煒 劉凡

目的 探討他汀類藥物聯(lián)合阿司匹林體外孵育對膠原誘導(dǎo)的血小板活化的影響。方法 采集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院門診健康成人志愿者外周靜脈血，制備血小板懸液，應(yīng)用全血阻抗法、流式細(xì)胞術(shù)、Elisa等方法測定不同濃度辛伐他汀或普伐他汀單獨(dú)或聯(lián)合阿司匹林共同孵育對血小板聚集及活化的影響。結(jié)果 辛伐他汀體外孵育可降低膠原誘導(dǎo)的血小板聚集率，聯(lián)合阿司匹林，可進(jìn)一步降低膠原誘導(dǎo)的血小板活化標(biāo)志物表達(dá)及血栓素TXB2合成。結(jié)論 辛伐他汀體外孵育可抑制膠原誘導(dǎo)的血小板活化，與阿司匹林聯(lián)合，可進(jìn)一步增強(qiáng)后者對血小板聚集的抑制作用。

辛伐他汀；普伐他汀；膠原；血小板聚集；血小板活化

羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑（簡稱他汀類藥物）是臨床常用的調(diào)脂類藥物。目前研究證實，他汀類藥物具有多種療效顯著的抗動脈粥樣硬化作用，稱之為他汀類藥物的“多效性”，其中包括抗血小板作用。已有研究表明，血脂水平特別是低密度脂蛋白水平增高與血小板活化密切相關(guān)，因此，高脂血癥患者處于易栓狀態(tài)，其血栓發(fā)生概率明顯增加[1]。他汀類藥物可通過降低膽固醇水平抑制血小板活化，此外還可通過直接作用抑制血小板功能[2]，然而，所涉及的相關(guān)機(jī)制尚不十分明確。

阿司匹林是傳統(tǒng)的抗血小板藥物，可通過抑制環(huán)氧化酶而減少血栓素A2（TXA2）的產(chǎn)生從而發(fā)揮抗血小板作用。目前阿司匹林作為抗血小板的一線用藥，廣泛應(yīng)用于臨床。本研究通過探討辛伐他汀或普伐他汀聯(lián)合阿司匹林體外孵育對膠原誘導(dǎo)的血小板活化的作用及對血栓素生成的影響，力求從新的角度闡述此類藥物對血小板功能的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品儀器 辛伐他?。⊿imvastatin）、普伐他?。≒ravastatin）及阿司匹林（Asprin）購自 Sigma公司，全血血小板聚集儀（MODEL-590）及膠原購自CHRONO-LOG公司，單克隆抗體anti-CD61/Per-CP、anti-CD62/PE及PAC-1/FITC購自美國Becton Dickinson 公司，血栓素 B2（TXB2）Elisa試劑盒購自上海凱博生化試劑有限公司，血細(xì)胞計數(shù)儀（MEK-2-7226）購自日本SYSMEX公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購自上海燦溪經(jīng)貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血小板懸液制備 采集60例健康志愿者（男性37例，女性23例，平均年齡32.4歲）空腹外周靜脈血10 ml，置于3.8%枸櫞酸鈉抗凝管（靜脈血與抗凝劑體積比9∶1），輕輕顛倒1～2次混勻。于室溫下以150×g離心10 min，收集上層富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）。余下血液再以 800×g離心10 min獲得貧血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）。用MEK-2-7226血細(xì)胞計數(shù)儀以PPP調(diào)整PRP濃度為3.0×108/ml制備成血小板懸液。

1.2.2 實驗分組 采用兩種不同種類他汀進(jìn)行實驗，其中辛伐他汀為脂溶性、普伐他汀為水溶性。將制備的血小板懸液與等量不同種類、不同濃度他汀類藥物在37℃孵育10 min，再聯(lián)合或不聯(lián)合阿司匹林（50 μM/L）37 ℃孵育 5 min，隨后測定膠原（2 μg/ml）誘導(dǎo)的血小板聚集、血小板活化標(biāo)志物表達(dá)（CD62P 和 PAC-1）及血栓素 B2（TXB2）的合成。具體實驗分組如下：①空白對照組，無他汀類藥物及阿司匹林干預(yù)；②無阿司匹林組，血小板與不同種類、不同濃度他汀類藥物孵育10 min，再加入等量對照孵育5 min；③阿司匹林處理組，血小板與不同種類、不同濃度他汀類藥物孵育10 min，再加入阿司匹林孵育5 min。

1.2.3 血小板聚集率 取血小板懸液500 μl分別與10 μl不同濃度辛伐他汀、普伐他?。舛确秶?～30 μM/L）37 ℃孵育 10 min，再加入 10 μl PBS或阿司匹林（50 μM/L）37℃孵育5 min。采用血小板聚集儀，利用全血阻抗法測定膠原（2 μg/ml）誘導(dǎo)的血小板聚集率，設(shè)定磁棒轉(zhuǎn)速為1200 r/min，反應(yīng)時間＞15 min。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 在流式上樣管中加入待測血小板懸液 5 μl，按 1∶10 比例用超濾 PBS 稀釋（PBS 50 μl），再加入PerCP標(biāo)記的抗CD61單抗5 μl（標(biāo)記血小板），以及PE標(biāo)記的抗CD62P單抗5 μl和FITC標(biāo)記的抗PAC-1單抗5 μl，輕輕搖動混勻，室溫避光孵育20 min，同時做空白對照及同種型陰性對照。加入預(yù)冷的1%多聚甲醛200 μl避光固定，4℃放置2 h，用FACS-Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.5 TXB2的測定 用酶聯(lián)免疫試劑盒測定各組血小板懸液的血栓素B2（TXB2）水平，過程嚴(yán)格按照說明書操作。由于TXA2可迅速降解為TXB2，目前公認(rèn)的可通過測定后者水平，反映TXA2的生成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有資料應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行分析。用±s表示，采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀和普伐他汀對血小板聚集的影響 5 μM/L、15 μM/L、30 μM/L 辛伐他汀體外孵育后膠原誘導(dǎo)的血小板聚集率分別為（57.20±6.01）%、（40.00±5.65）%和（32.00±7.98）%，較無他汀組（65.00±7.46）%明顯降低并呈劑量依賴關(guān)系（P＜0.05）。相同劑量普伐他汀體外恒溫孵育后膠原誘導(dǎo)的血小板聚集率分別為（66.00±8.11）%、（64.00±7.54）%和（61.80±6.98）%，與無他汀組比較無顯著差異（P＞0.05）。聯(lián)合 5 μM/L、15 μM/L、30 μM/L辛伐他汀及阿司匹林（50 μM/L）共同孵育血小板后膠原誘導(dǎo)的血小板聚集率分別為（41.10±6.22）%、（32.40±6.65）%和（29.20±7.28）%，其中15 μM/L、30 μM/L 辛伐他汀聯(lián)合阿司匹林組較單純阿司匹林［（45.00±6.46）%］組血小板聚集率顯著降低（P＜0.05），而相同劑量普伐他汀與阿司匹林共同孵育血小板后膠原誘導(dǎo)的血小板聚集率分別為（43.30±8.11）%、（47.40±7.25）%和（41.20±7.88）%，較單純阿司匹林組血小板聚集率未見明顯下降（P＞0.05）。見圖1。

2.2 辛伐他汀和普伐他汀對血小板活化標(biāo)志物的影響 膠原可引起血小板表面P-選擇素（CD62P）及 PAC-1 表達(dá)增高 ［（82.20±2.77）%和（92.00±3.44）%比陰性對照組（6.45±0.97）%和（7.00±1.12）%，P＜0.05］，阿司匹林（50 μM/L）體外恒溫孵育可降低膠原誘導(dǎo)的血小板表面CD62P及PAC-1表達(dá)［（62.30±2.78）%和（63.30±3.44）%比（82.20±2.77）%和（92.00±3.44）%，P＜0.05］，聯(lián)合 10 μM/L和30 μM/L辛伐他汀及阿司匹林共同孵育血小板，可進(jìn)一步降低膠原誘導(dǎo)的血小板CD62P及PAC-1 表達(dá)［（53.20±3.47）%比（45.10±2.35）%比（62.30±2.78）%；（50.40±4.23）%比（42.20±3.47）%比（63.30±3.44）%，P＜0.05］，相同劑量普伐他汀聯(lián)合阿司匹林共同孵育對CD62P及PAC-1表達(dá)無明顯 影 響 ［（60.40 ±2.35）% 比（63.20 ±3.26）% 比（62.30±2.78）%；（60.10±4.22）%比（58.50±2.79）%比（63.30±3.44）%，P＞0.05］。見圖2。

2.3 辛伐他汀和普伐他汀對血栓素TXB2合成的影響 辛伐他汀體外孵育可降低膠原誘導(dǎo)的TXB2合成 ［（69.7±8.9）ng/ml比陰性對照組（96.4±10.5）ng/ml，P＜0.05］。而相同劑量普伐他汀對膠原誘導(dǎo)的血小板內(nèi)TXB2合成無明顯影響［（98.5±9.1）ng/ml 比陰性 對照組（96.4±10.5）ng/ml，P＞0.05］。阿司匹林體外孵育血小板可降低膠原誘導(dǎo)的 TXB2 合成 ［（74.9±11.2）ng/ml比陰性對照組（96.4±10.5）ng/ml，P＜0.05］，辛伐他汀聯(lián)合阿司匹林共同孵育血小板可進(jìn)一步降低TXB2水平［（58.4±10.3）ng/ml比阿司匹林組（74.9±11.2）ng/ml，P＜0.05］，而普伐他汀聯(lián)合阿司匹林共同孵育未觀察到類似作用［（72.7±12.4）ng/ml比阿司匹林組（74.9±11.2）ng/ml，P＞0.05］。見表1。

表1 他汀聯(lián)合或非聯(lián)合阿司匹林體外孵育對膠原誘導(dǎo)的血小板 TXB2 合成的影響（±s）

表1 他汀聯(lián)合或非聯(lián)合阿司匹林體外孵育對膠原誘導(dǎo)的血小板 TXB2 合成的影響（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與無阿司匹林組比較，bP＜0.05

組別 血栓素 TXB2 水平（ng/ml）無阿司匹林 阿司匹林對照組 96.4±10.5 74.9±11.2普伐他?。?0 μM/L）組 98.5±9.1 72.7±12.4辛伐他?。?0 μM/L）組 69.7±8.9a 58.4±10.3b

3 討論

他汀類藥物是目前臨床治療血脂異常及冠心病等疾病的常用藥物。它可以通過抑制脂質(zhì)合成限速步驟中的β-羥基-β-甲基戊二酰輔酶A（HMGCoA）還原酶，減少甲基戊酸的合成，從而發(fā)揮降低膽固醇的作用[3]。目前越來越多的研究證實，他汀類藥物除具有調(diào)脂作用外，還具有多種抗動脈粥樣硬化作用，即所謂他汀類藥物的多效性。其中引起廣泛關(guān)注的，包括近年來發(fā)現(xiàn)的他汀類藥物具有顯著地體內(nèi)體外抑制血小板活化的作用[4,5]。一方面，他汀類藥物可通過調(diào)控血小板膜脂質(zhì)構(gòu)成影響血小板功能[6]；另一方面，他汀類藥物應(yīng)用早期即可對血栓及凝血過程產(chǎn)生影響[7]。因此目前認(rèn)為，他汀類藥物藥物具有獨(dú)立于降脂作用之外的抗血小板作用。

圖1 他汀聯(lián)合或非聯(lián)合阿司匹林體外孵育對膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的影響

圖2 他汀聯(lián)合阿司匹林體外孵育對膠原誘導(dǎo)的血小板活化標(biāo)志物表達(dá)的影響

膠原是目前公認(rèn)的血小板聚集誘導(dǎo)劑，當(dāng)內(nèi)皮損傷時，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白膠原暴露，可通過激活血小板表面膠原受體，最終引起血小板活化，因此在血管損傷局部血小板聚集過程中具有重要作用。通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀與普伐他汀相比，能夠顯著抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，這與之前報道的脂溶性他汀具有抗血小板作用一致[8]。并且，通過對血小板活化標(biāo)志物的測定發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀與阿司匹林共同孵育可在一定程度上降低膠原誘導(dǎo)的血小板P-選擇素（CD62P）表達(dá)及血小板PAC-1的水平。血小板活化后，引起脫顆粒反應(yīng)，使其表面P-選擇素表達(dá)增高，同時引起GPⅡb/Ⅲa構(gòu)象改變，進(jìn)而促進(jìn)血小板聚集，PAC-1單克隆抗體可直接結(jié)合活化血小板中GPⅡb/Ⅲa構(gòu)象變化所暴露出的纖維蛋白原結(jié)合位點[9]，因此，P-選擇素及PAC-1表達(dá)水平反映血小板活化程度。進(jìn)一步，通過對血小板TXB2水平測定也證實，辛伐他汀可增強(qiáng)阿司匹林對血小板血栓素B2生成的抑制作用，而后者反映血小板血栓素A2的合成。相關(guān)臨床研究也有類似報道。Santos等[10]報道，接受阿托伐他汀聯(lián)合阿司匹林治療的患者較單用阿司匹林治療者，膠原誘導(dǎo)的血小板聚集及血栓素A2合成明顯降低。結(jié)合我們的研究發(fā)現(xiàn)，脂溶性他汀可通過直接作用影響血小板功能。

此外我們還發(fā)現(xiàn)，不同種類他汀對血小板功能可產(chǎn)生不同影響。普伐他汀與辛伐他汀的一個重要區(qū)別是，普伐他汀的化學(xué)結(jié)構(gòu)中羥基與疏水基相連，從而具有高度親水性。通過我們的實驗發(fā)現(xiàn)，普伐他汀體外孵育對血小板聚集無顯著抑制作用。此外，普伐他汀與阿司匹林共同孵育也未觀察到對膠原誘導(dǎo)的血小板表面活化標(biāo)志物及TXB2水平的影響。文獻(xiàn)報道[11,12]，脂溶性他汀，如辛伐他汀及阿托伐他汀等，可通過主動或被動轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，而水溶性他汀無法通過被動轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞。因此，不同種類他汀對血小板功能的不同作用，可能與其分子結(jié)構(gòu)及具有不同的細(xì)胞膜滲透性有關(guān)，相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀體外孵育可抑制膠原誘導(dǎo)的血小板活化，聯(lián)合阿司匹林共同孵育，可增強(qiáng)后者對血小板活化的抑制作用。其機(jī)制涉及進(jìn)一步降低血小板表面活化標(biāo)志物表達(dá)及降低血小板血栓素A2的合成。這從一個新的角度闡述了脂溶性他汀對血小板功能的影響，為了解他汀類藥物的多效性提供了理論依據(jù)。他汀類藥物與阿司匹林聯(lián)合治療，是否最終通過影響血小板功能使患者臨床獲益，以及所涉及的具體機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。

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Simvastatin improves Aspirin-mediated in vitro blood platelet inhibition

DU Hong，HAO Jie，HU Hai-juan，et al.Department of Cardiology，Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China

HAO Jie，E-mail：haojiemed@163.com

ObjectiveTo examine the effects of Simvastatin and Pravastatin on the platelet aggregation stimulated by collagen under in vitro conditions，and analyze the influence of statins on Aspirin-mediated platelet inhibition under such conditions.MethodsBlood samples were donated from healthy volunteers in order to prepare human platelet suspensions.The effects of statins on collagen-induced platelet aggregation，the expression of platelet activation landmarks and the activity of thromboxane B2 were measured by impedance aggregometry，flow cytometric analysis and Elisa.ResultsSimvastatin inhibited the platelet aggregation induced by collagen in vitro conditions.Additionally，Simvastatin improved the inhibition of Aspirin on platelet aggregation，the expression of platelet activation landmarks and the activity of thromboxane B2.ConclusionSimvastatin inhibits the platelet aggregation induced by collagen and improves in vitro Aspirin-mediated platelet inhibition.

Simvastatin；Pravastatin；Collagen；Platelet aggregation；Platelet activation

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題（項目編號：20130195）

050000 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科

郝杰，E-mail：haojiemed@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.11.021

R54

A

1672-5301（2017）11-1040-04

2017-07-07）