白背毛木耳液體發(fā)酵條件優(yōu)化

劉敏　劉鵬冀　趙玉濤　盧紅

摘要：以白背毛木耳為試驗材料，采用液體搖瓶培養(yǎng)法，通過單因素試驗、正交試驗，以菌絲體生物量為主要指標(biāo)，對白背毛木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，白背毛木耳適宜的液體培養(yǎng)基配方為200%馬鈴薯、20%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4；白背毛木耳液體培養(yǎng)適宜的條件：培養(yǎng)溫度為25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 rmin、裝液量為100 mL（250 mL三角瓶）、發(fā)酵終點為4 d。

關(guān)鍵詞：白背毛木耳；液體培養(yǎng)基；發(fā)酵條件；菌絲體鮮質(zhì)量；優(yōu)化

中圖分類號： S646604+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0149-03

收稿日期：2016-09-28

基金項目：河北省科技支撐計劃（編號：16237301D-2-10）。

作者簡介：劉敏（1985—），女，河北石家莊人，碩士，實驗師，從事食藥用真菌研究與開發(fā)工作。E-mail：liumin870115@163com。

白背毛木耳（Auricularia polytricha）隸屬于擔(dān)子菌亞門層菌綱木耳目木耳科木耳屬中的毛木耳種。按照背部絨毛層顏色不同，毛木耳分為白背毛木耳和黃背毛木耳2個商業(yè)化栽培品種。毛木耳口感脆滑，風(fēng)味獨特，膠質(zhì)含量豐富，素有“樹上海蜇皮”之美稱。毛木耳營養(yǎng)豐富，據(jù)分析，100 g毛木耳干品中含有70～91 g粗蛋白質(zhì)、06～ 12 g粗脂肪、646 ～ 692 g碳水化合物、1 2301～1 3347 kJ 熱量、97～143 g粗纖維、21～42 g灰分、001 mg 胡蘿卜素、009～036 mg硫胺素、704～835 mg抗壞血酸以及17～40 mg尼克酸1]。另外，毛木耳還具有較高的藥用價值，入藥有益氣強身、活血、止血、止痛之功效2-3]。

毛木耳是一種著名的藥食兼用的蕈菌，在我國栽培的歷史悠久，是極具商業(yè)開發(fā)價值的木耳品種之一4]。毛木耳是一種高溫腐生型菌類，易栽培，既可鮮銷又可干售，適合高溫季節(jié)栽培，正好可以彌補夏季蔬菜市場上鮮品菇類供應(yīng)的不足，亦可作為食用菌周年栽培生產(chǎn)的一個配套品種，是當(dāng)前我國廣泛栽培的食用菌之一。目前，毛木耳生產(chǎn)過程中大多使用的是固體菌種，與固體菌種相比，液體菌種具有菌齡一致、生長速度快、生產(chǎn)周期短、接種方便、無季節(jié)性、適宜工廠化生產(chǎn)等優(yōu)勢，因此在食用菌生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景5-6]。

目前有關(guān)毛木耳液體發(fā)酵條件尚未見系統(tǒng)的研究，因此，本研究采用液體搖瓶培養(yǎng)法，以菌絲體鮮質(zhì)量為指標(biāo)，通過碳、氮源單因素試驗并結(jié)合L9（34）正交試驗方法，對白背毛木耳液體發(fā)酵過程中的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出白背毛木耳最適宜的液體培養(yǎng)基，旨在為白背毛木耳菌種生產(chǎn)、紫外誘變育種以及液體發(fā)酵活性物質(zhì)提取等方面的研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1材料與方法

11試驗材料

111供試菌株

白背毛木耳菌株為川耳1號，由河北大學(xué)食藥用真菌研究所保藏。

112培養(yǎng)基

（1）PDA培養(yǎng)基：20%馬鈴薯、2%葡萄糖、2%瓊脂，pH值自然。

（2）一級液體培養(yǎng)基、基礎(chǔ)二級液體培養(yǎng)基：200%馬鈴薯、20%葡萄糖、10%蛋白胨、01%MgSO4·7H2O、01% KH2PO4。

（3）栽培培養(yǎng)基：84%雜木屑，15%麩皮，1%生石灰。

12試驗方法

121JP3]白背毛木耳試管母種擴繁

按常規(guī)方法制備PDA培養(yǎng)基后，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后，通過無菌操作進(jìn)行接種，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，待試管中菌絲長滿，備用。

122一級液體菌種的制備方法

按常規(guī)方法制備一級液體培養(yǎng)基，分裝于250 mL三角瓶中，裝液量為100 mL，121 ℃高壓滅菌30 min，待冷卻后，取活化的菌種在無菌條件下進(jìn)行接種，接種后放入恒溫?fù)u床中25 ℃、160 rmin恒溫振蕩培養(yǎng)6 d，制得白背毛木耳一級液體菌種，備用。

123碳源的選擇

固定其他成分不變，分別用蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉代替基礎(chǔ)二級液體培養(yǎng)基中的葡萄糖作為培養(yǎng)基的碳源，濃度均為20%，250 mL三角瓶中裝液量為 100 mL，121 ℃滅菌30 min，接種量為10%，放入 25 ℃、160 rmin 搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)6 d，測定菌絲體鮮質(zhì)量，每個處理3次重復(fù)。菌絲體鮮質(zhì)量測定方法7]：以80目銅絲網(wǎng)過濾稱質(zhì)量，鮮質(zhì)量的測定可以實時檢測菌種的發(fā)酵動態(tài)，是較干質(zhì)量測定更為實用的快速測定方法。

124氮源的選擇

固定其他成分不變，分別用麩皮、酵母粉、硫酸銨代替基礎(chǔ)二級液體培養(yǎng)基中的蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源，濃度均為10%，250 mL三角瓶中裝液量為100 mL，121 ℃ 滅菌30 min，接種量為10%，放入25 ℃、160 rmin搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)6 d，測定菌絲體鮮質(zhì)量，每個處理3次重復(fù)。

125碳源、氮源正交試驗

以葡萄糖、酵母粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4為試驗因素，設(shè)計L9（34）正交試驗，試驗因素水平如表1所示，以菌絲體鮮質(zhì)量為指標(biāo)，共計9個處理，每個處理3次重復(fù)。

126溫度的選擇

接種菌種后，將三角瓶分別置于19、22、25、28、31 ℃溫度下160 rmin振蕩培養(yǎng)6 d后，測定菌絲體鮮質(zhì)量。

127搖床轉(zhuǎn)速的選擇

接種菌種后，搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為160、170、180、190、200、210 rmin，在上述試驗選出的最佳溫度下振蕩培養(yǎng)6 d后，測定菌絲體鮮質(zhì)量。endprint

128裝液量的選擇

配制基礎(chǔ)二級液體培養(yǎng)基時分別在 250 mL 三角瓶中裝入70、80、90、100、110、120 mL的培養(yǎng)基，接種菌種后，在上述試驗選出的最佳溫度及上述試驗最佳搖床轉(zhuǎn)速條件下振蕩培養(yǎng)6 d后，測定菌絲體鮮質(zhì)量。

129發(fā)酵終點的確定

1291白背毛木耳液體發(fā)酵過程中相關(guān)指標(biāo)的檢測

接種后，將三角瓶置于25 ℃、160 rmin的恒溫?fù)u床中，發(fā)酵開始后每隔24 h取出3瓶測定菌絲體的鮮質(zhì)量和發(fā)酵液pH值，確定最佳發(fā)酵時間。

1292回接試管法萌發(fā)試驗

根據(jù)液體發(fā)酵曲線的情況，試驗中從液體發(fā)酵的第4天至第7天，每天上午10：00取樣，取樣后接種到斜面培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，記錄回接試管后菌絲的萌發(fā)時間。以菌絲體鮮質(zhì)量及回接試管后菌絲萌發(fā)情況作為主要評價指標(biāo)，確定白背毛木耳液體發(fā)酵終點。

1210液體菌種應(yīng)用比較

分別將白背毛木耳固體菌種和液體菌種接種于栽培培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中觀察并記錄滿袋時間、菌絲長勢、白背毛木耳的子實體農(nóng)藝性狀和生物學(xué)效率等（每袋裝干料1 000 g）。

13數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行處理和分析。

2結(jié)果與分析

21碳源對白背毛木耳液體菌絲體培養(yǎng)的影響

碳源是食用菌培養(yǎng)基的主要營養(yǎng)成分之一，碳素是構(gòu)成食用菌細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳架來源的營養(yǎng)物質(zhì)，也是食用菌的生命活動所需要的能源。相關(guān)研究表明，碳源主要對細(xì)胞生長和活性生物成分的合成有較大的影響8-9]。由表2可知，白背毛木耳對4種碳源均有不同程度的利用，以菌絲體鮮質(zhì)量為指標(biāo)來看，其中葡萄糖的利用率最高，可溶性淀粉次之，蔗糖最差。在4種供試的碳源中，發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源為葡萄糖，菌絲體鮮質(zhì)量可達(dá)25432 7 g100 mL，并且與其他3種碳源的菌絲體鮮質(zhì)量差異顯著（P<005），其余3個碳源（可溶性淀粉、蔗糖和玉米粉）盡管在發(fā)酵后菌絲體鮮質(zhì)量有所不同，但是經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析并無顯著性差異。因此，選擇葡萄糖作為白背毛木耳液體發(fā)酵的主要碳源并進(jìn)行后續(xù)的碳源、氮源正交試驗。

22氮源對白背毛木耳液體菌絲體培養(yǎng)的影響

氮源是食用菌細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和核酸必不可少的主要原料，一般不供作能量來源，通常分為無機氮和有機氮2類。由表3可知，氮源對白背毛木耳菌絲體生物量的影響有一定的差異。在4種供試氮源中，麩皮和酵母粉的發(fā)酵效果較好，發(fā)酵結(jié)束后菌絲體鮮質(zhì)量較高，并且兩者之間無顯著性差異，因此麩皮和酵母粉均可以作為白背毛木耳液體發(fā)酵時的氮源來使用。由于酵母粉為氮源時培養(yǎng)白背毛木耳的結(jié)果略優(yōu)于麩皮，此時菌絲體鮮質(zhì)量最大，可以達(dá)到31098 6 g100 mL，且考慮到培養(yǎng)基制作過程的簡便易行，選擇酵母粉作為白背毛木耳液體發(fā)酵的主要氮源并進(jìn)行后續(xù)的碳源、氮源正交試驗。

23正交試驗分析

正交試驗中共有9個處理，由表4可知，白背毛木耳液體培養(yǎng)中的4個因素對菌絲體鮮質(zhì)量的影響表現(xiàn)為B>D>A>C，即酵母粉>KH2PO4>葡萄糖>MgSO4·7H2O。從正交試驗直觀分析結(jié)果可知，各因素水平的最優(yōu)理論組合為A1B3C1D2，即10%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4，此時菌絲體鮮質(zhì)量最大。而試驗處理最優(yōu)結(jié)果卻是A2B3C1D2，即20%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4，因此須要做驗證試驗。

由表5可知，在A2B3C1D2組合條件下白背毛木耳的菌絲體鮮質(zhì)量達(dá)43631 0 g100 mL，略優(yōu)于A1B3C1D2組合。因此，確定白背毛木耳最佳液體培養(yǎng)基配方組合為A2B3C1D2，即20%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4。

24培養(yǎng)溫度對白背毛木耳液體菌絲體培養(yǎng)的影響

CM（24]由圖1可知，溫度過高或過低均會影響白背毛木耳的生長，19～25 ℃時，隨溫度不斷升高菌絲體鮮質(zhì)量逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時，菌絲體鮮質(zhì)量達(dá)到最大值，為 42579 8 g100 mL，高于25 ℃時菌絲體鮮質(zhì)量略有下降。因此，白背毛木耳液體發(fā)酵溫度為25 ℃時較為適宜。

25搖床轉(zhuǎn)速對白背毛木耳液體菌絲體培養(yǎng)的影響

由圖2可知，轉(zhuǎn)速過高或過低均會影響白背毛木耳的生長，隨著轉(zhuǎn)速的不斷增加，培養(yǎng)基中溶氧量逐漸增大，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為180 rmin時，菌絲體鮮質(zhì)量達(dá)到最大值，為 43200 7 g100 mL。因此，白背毛木耳液體發(fā)酵的搖床轉(zhuǎn)速以180 rmin較為適宜。

26裝液量對白背毛木耳液體菌絲體培養(yǎng)的影響

液體發(fā)酵過程中，裝液量也可以直接影響培養(yǎng)基中的溶氧情況。由圖3可知，當(dāng)250 mL的三角瓶中裝液量為 100 mL 時，培養(yǎng)結(jié)束后菌絲體鮮質(zhì)量達(dá)到最大值，為 43491 3 g100 mL。因此，在進(jìn)行白背毛木耳液體發(fā)酵時，裝液量以100 mL（250 mL三角瓶）較為適宜。

FK（W10]TPLM11tif]

27發(fā)酵終點試驗結(jié)果

由圖4可知，白背毛木耳在整個液體發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的pH值變化并不大，在54～67之間，總體趨勢是先上升后下降，培養(yǎng)3 d時達(dá)到最大值，為67，培養(yǎng)4～5 d達(dá)到穩(wěn)定，均為65，而后開始下降。生物量方面，發(fā)酵開始后的前 4 d，隨著發(fā)酵時間的延長，菌絲體鮮質(zhì)量呈快速增長趨勢，此時處于對數(shù)生長期，4 d后開始菌絲體生物量增長速度變緩，幾乎趨于穩(wěn)定，6 d后開始有所下降。由表6可知，菌齡為4、5 d的液體菌種在斜面培養(yǎng)基上的萌發(fā)時間最短。綜合考慮菌絲體生物量、回接試管后菌絲萌發(fā)時間和成本因素，確定白背毛木耳液體菌種的發(fā)酵終點為 4 d。endprint

28液體菌種的應(yīng)用

由表7結(jié)果可知，白背毛木耳液體菌種接入栽培培養(yǎng)基，其菌絲生長速度比固體菌種快，滿袋時間較短，比固體菌種滿袋的時間少了9 d，可明顯縮短生產(chǎn)周期；耳片的顏色均呈現(xiàn)為CM（25]暗褐色，液體菌種的出耳生物學(xué)效率略高于固體菌種。不同菌種應(yīng)用于栽培后的子實體情況如圖5所示。另外，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)采用液體菌種污染率較低，主要是因為液體菌種接種后的萌發(fā)點較多，菌絲生長速度快于固體菌種，因此，白背毛木耳的液體菌種可用于生產(chǎn)實踐。

3結(jié)論

通過碳源、氮源的單因素試驗和正交試驗，最終確定了白背毛木耳適宜的液體培養(yǎng)基配方為200%馬鈴薯、20%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4。本試驗還從起始培養(yǎng)溫度、 搖床轉(zhuǎn)速以及裝液量3個方面對白背毛木耳的液體培養(yǎng)條件進(jìn)行了單因素試驗，結(jié)果表明，白背毛木耳液體培養(yǎng)適宜的條件：培養(yǎng)溫度為25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 rmin、CM（213]裝液量為100KG3]mL（250KG3]mL三角瓶）、發(fā)酵終點為4 d。JP3]白背毛木耳液體菌種的發(fā)酵速度明顯快于固體菌種，滿袋時間較短，從而降低了生產(chǎn)成本，生物學(xué)效率也略優(yōu)于固體菌種，且操作簡便，具有一定的現(xiàn)實應(yīng)用優(yōu)勢，可用于生產(chǎn)實踐。

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