辣椒素對大鼠胃動力的影響及作用機制

徐勁，唐川康，陽鳳，王縷，王瑤，彭燕

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州628000)

辣椒素對大鼠胃動力的影響及作用機制

徐勁，唐川康，陽鳳，王縷，王瑤，彭燕

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州628000)

目的探討辣椒素對大鼠胃動力的影響及其作用機制。方法選擇SD大鼠160只，隨機分為對照組及辣椒素低、中、高劑量組，每組40只。辣椒素低、中、高劑量組分別給予0.01、0.1、0.5 mg/mL的辣椒素溶液灌胃，對照組給予等量辣椒素溶劑灌胃。各組分別于灌胃3天及灌胃1、2、4周，隨機取10只，采用核素顯像法檢測胃半排空時間(t50%)、65 min時胃排空率(GE65 min)；處死后剖腹取胃，采用免疫組化二步法檢測胃組織辣椒素受體1(TRPV1)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、P物質(zhì)(SP)表達(dá)。結(jié)果辣椒素低、中、高劑量組各時間點較對照組同期t50%有升高趨勢，GE65 min有降低趨勢，均表現(xiàn)出抑制胃排空作用；辣椒素高、中劑量組各時間點抑制胃排空效果強于辣椒素低劑量組(P均<0.05)，辣椒素中、高劑量組抑制胃排空的效果相當(dāng)(P均>0.05)。辣椒素低、中、高劑量組各時間點胃黏膜TRPV1表達(dá)均較對照組同期明顯增加(P均<0.05)，但辣椒素低、中、高劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。辣椒素低、中、高劑量組各時間點胃黏膜CGRP表達(dá)較對照組有升高趨勢；灌胃3天及1周，辣椒素高、中劑量組CGRP表達(dá)升高較辣椒素低劑量組更明顯(P均<0.05)。灌胃2、4周，辣椒素高、中劑量組胃黏膜CGRP表達(dá)顯著降低(P均<0.05)。辣椒素低、中、高劑量組各時間胃黏膜SP表達(dá)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論辣椒素具有抑制大鼠胃排空作用，且劑量越大，抑制效果越強；隨著作用時間延長，辣椒素劑量越大抑制胃排空效果減弱越明顯，其原因可能與胃黏膜CGRP大量消耗有關(guān)。

功能性胃腸??；胃腸道動力紊亂；辣椒素；辣椒素受體1；降鈣素基因相關(guān)肽；P物質(zhì)

辣椒素是辣椒的主要活性成分，可選擇性刺激初級傳入神經(jīng)元末梢和細(xì)胞膜上的辣椒素受體1(TRPV1)，參與胃腸道眾多的生理和病理過程。TRPV1陽性神經(jīng)纖維含有多種神經(jīng)遞質(zhì)，如降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、P物質(zhì)(SP)等[1]。腸道CGRP主要分布于迷走神經(jīng)和內(nèi)臟神經(jīng)的傳入纖維以及胃腸道壁內(nèi)神經(jīng)叢，對大部分胃腸運動具有抑制作用，可引起胃排空延遲[2]。SP是速激肽家族的一員，通過對胃平滑肌的直接作用刺激膽堿類神經(jīng)元和作為非膽堿能神經(jīng)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，加強胃腸道平滑肌的收縮運動[3]。因此認(rèn)為，胃組織CGRP、SP表達(dá)改變可能與辣椒素抑制胃排空作用有關(guān)[4]。但目前辣椒素對胃腸道動力的影響及機制爭議較大。2015年5月～2016年2月，我們觀察了辣椒素對大鼠胃動力及胃組織TRPV1、CGRP、SP表達(dá)的影響?，F(xiàn)分析結(jié)果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠160只，清潔級，雌雄各半，2月齡，體質(zhì)量160～180 g，由西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。KS400圖像處理系統(tǒng)，德國Zeiss公司；H3000WC型SPECT，德國西門子公司。辣椒素，純度99%，美國Sigma公司；實驗前稱取辣椒素1、10、50 mg，分別加入100 mL辣椒素溶劑(10%吐溫20 mL+10%酒精1 mL+生理鹽水79 mL)，充分溶解，獲得終濃度為0.01、0.1、0.5 mg/mL的辣椒素溶液。99mTc-DTPA，由西南醫(yī)科大學(xué)核醫(yī)學(xué)科提供；兔抗大鼠TRPV1、CGRP、SP多克隆抗體及生物素標(biāo)記二抗試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組處理 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分為對照組及辣椒素低、中、高劑量組，每組40只。辣椒素低、中、高劑量組分別給予0.01、0.1、0.5 mg/mL濃度的辣椒素溶液2 mL灌胃，對照組給予等量辣椒素溶劑灌胃。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 各組分別于灌胃3天及灌胃1、2、4周隨機取10只，檢測以下指標(biāo)。

1.3.1 胃半排空時間(t50%)及65 min時胃排空率(GE65 min) 采用核素顯像法。①標(biāo)準(zhǔn)餐制備：取99mTc標(biāo)記的DTPA 1.2 mci，加入12 mL生理鹽水，并與12 g芝麻糊混合，振蕩10 min，獲得每毫升含有99mTc-DTPA 0.1 mci的半固體標(biāo)準(zhǔn)餐。②標(biāo)準(zhǔn)餐灌胃：大鼠禁食24 h、禁水6 h，不禁藥，末次灌胃后10 min，標(biāo)準(zhǔn)餐2 mL灌胃。③圖像采集：低能通用型準(zhǔn)直器參數(shù)：能峰140 keV，窗寬20%，矩陣128×128；標(biāo)準(zhǔn)餐灌胃后，將大鼠俯臥位固定于固定器中，使胃和大部分小腸置于探頭視野中。灌胃后5、10、15、20 min各采集圖像1幀，隨后每15 min采集圖像1幀，每幀圖像采集60 s，連續(xù)觀察2 h。若2 h內(nèi)放射性計數(shù)尚未下降50%，可繼續(xù)延長觀察時間。④圖像處理：CT圖像斷層融合：采集的CT圖像斷層數(shù)據(jù)經(jīng)OSEM迭代重建后，使用GE專用Functional anatomical fusion融合處理軟件與CT圖像進行融合，重建橫斷面、矢狀面、冠狀面SPECT/CT融合圖像，輔助診斷軟件設(shè)定感興趣區(qū)，獲得各時間點全胃內(nèi)放射性計數(shù)，繪制時間-放射性曲線。根據(jù)時間-放射性曲線即可獲得t50%及胃排空試驗第65 min時胃內(nèi)放射性核素計數(shù)，計算65 min時胃排空率(GE65 min)。計算公式：GEt=(Cmax-Ct)/Cmax×100%[GEt為某時點的胃排空率；Cmax為胃區(qū)內(nèi)最大計數(shù)率；Ct為某時點的胃內(nèi)計數(shù)率(經(jīng)衰變校正和衰減校正后)]。

1.3.2 胃體組織TRPV1、CGRP、SP表達(dá) 采用免疫組化二步法。胃排空檢測完畢后采用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后處死，迅速剖腹取胃。取胃體組織，甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚切片；60 ℃恒溫箱烤片過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；3%過氧化氫甲醛液室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min×3次；檸檬酸緩沖液高壓蒸煮5 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗5 min×3次；滴加適量相應(yīng)一抗(兔抗大鼠TRPV1、CGRP、SP多克隆抗體，稀釋效價均為1∶100)，4 ℃孵育過夜。次日，PBS沖洗5 min×3次，滴加適量生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min，蒸餾水沖洗3 min，TBST洗膜5 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸分化，常規(guī)脫水，透明，干燥，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。TRPV1、CGRP、SP陽性表達(dá)主要位于胞質(zhì)內(nèi)，呈黃色顆粒狀。光鏡下選擇切片的陽性區(qū)域，隨機取3個400倍視野，采用彩色病理圖像分析軟件測定3個視野內(nèi)陽性信號的面積和陽性信號平均光密度值，計算陽性指數(shù)(PI)。PI=陽性信號面積×陽性信號平均光密度值/測定面積。PI越大，表明TRPV1表達(dá)或CGRP、SP釋放越多。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間t50%、GE65 min比較 見表1。

2.2 各組胃體組織TRPV1、CGRP、SP表達(dá)比較 見表2。

表1 各組不同時間t50%、GE65 min比較

注：與對照組同期比較，*P<0.05；與辣椒素低劑量組同期比較，#P<0.05；與辣椒素中劑量組同期比較，☆P>0.05；與同組灌胃3天比較，△P<0.05；與同組灌胃1周比較，▲P<0.05；與同組灌胃2周比較，▽P<0.05。

表2 各組不同時間胃體組織TRPV1、CGRP、SP表達(dá)比較

注：與對照組同期比較，*P<0.05；與辣椒素低劑量組同期比較，#P<0.05；與同組灌胃3天比較，△P<0.05；與同組灌胃1周比較，▲P<0.05；與同組灌胃2周比較，▽P<0.05。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素通過作用于胃腸道黏膜上皮細(xì)胞的TRPV1，引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)，繼而促進胃黏膜屏障修復(fù)、調(diào)節(jié)胃腸道動力等[5]。但辣椒素的藥理作用特殊，可產(chǎn)生刺激興奮、感覺阻滯、選擇性神經(jīng)毒性損害和不可逆性細(xì)胞破壞四種藥理效應(yīng)。初次或小劑量辣椒素作用于傳入神經(jīng)纖維，可使該神經(jīng)纖維出現(xiàn)一過性興奮，釋放某些神經(jīng)遞質(zhì)，并向上級神經(jīng)元傳遞信號，即為刺激興奮效應(yīng)。當(dāng)繼續(xù)或反復(fù)使用辣椒素，使興奮的神經(jīng)纖維消耗大量遞質(zhì)，導(dǎo)致對刺激無反應(yīng)，出現(xiàn)脫敏現(xiàn)象，即為感覺阻滯效應(yīng)。大劑量辣椒素在引起初級刺激興奮作用后，可引起神經(jīng)遞質(zhì)的過量釋放，導(dǎo)致傳入神經(jīng)纖維受到嚴(yán)重?fù)p害，失去其信息傳入功能，即為選擇性神經(jīng)毒性損害效應(yīng)，甚至不可逆性細(xì)胞破壞。說明劑量和作用時間不同，辣椒素所表現(xiàn)出的藥理效應(yīng)亦不相同[6～10]。但目前關(guān)于辣椒素影響胃動力的量效關(guān)系、時效關(guān)系尚不完全清楚。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，1～10 mg/(kg·d)辣椒素灌胃對大鼠胃腸道的敏感性影響較小，故本研究選擇0.1、1、5 mg/(kg·d)三種劑量辣椒素灌胃。結(jié)果顯示，與對照組灌胃同期比較，辣椒素低、中、高劑量組各時間點t50%有升高趨勢，GE65 min有降低趨勢，均表現(xiàn)出胃排空抑制作用。但不同劑量辣椒素灌胃≤1周所表現(xiàn)出的抑制效果強度不同：辣椒素中、高劑量組抑制胃排空作用強于辣椒素低劑量組，而辣椒素中、高劑量組抑制胃排空效果相當(dāng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，1 mg/(kg·d)辣椒素灌胃1～7天，大鼠內(nèi)臟化學(xué)刺激敏感性逐漸增強，灌胃2周后基本恢復(fù)正常[11]。推測辣椒素的藥理作用隨著時間延長，可能出現(xiàn)耐受，導(dǎo)致藥理作用減弱甚至消失。本研究結(jié)果顯示，隨著作用時間延長，辣椒素中劑量組t50%逐漸降低，至灌胃4周，胃排空抑制作用基本消失；辣椒素高劑量組亦隨時間延長，抑制胃排空作用逐漸減弱，灌胃2周抑制胃排空作用基本消失。雖然整個實驗過程辣椒素低劑量組均表現(xiàn)為胃排空抑制作用，但仍有隨著時間延長，抑制效應(yīng)逐漸減弱的趨勢。因此認(rèn)為，辣椒素的藥理效應(yīng)具有時間及劑量依賴性，與Szolcsanyi[12]報道基本一致。

消化道內(nèi)有豐富的傳入神經(jīng)纖維和TRPV1分布，約50%的迷走傳入神經(jīng)支配的大鼠胃腸道有TRPV1表達(dá)。辣椒素通過傳入神經(jīng)纖維激活胃腸道TRPV1后鈣離子通道開放，引起神經(jīng)元及其纖維釋放神經(jīng)遞質(zhì)，從而調(diào)節(jié)胃腸道動力。有研究發(fā)現(xiàn)，1 mg/(kg·d)辣椒素灌胃不同時間，大鼠胃組織TRPV1表達(dá)明顯不同[13]。既往研究多在病理條件下觀察胃黏膜TRPV1表達(dá)改變[14]，對長時間使用辣椒素藥物本身是否影響TRPV1表達(dá)研究較少。本研究結(jié)果顯示，與對照組灌胃同期比較，辣椒素低、中、高劑量組胃黏膜TRPV1表達(dá)均明顯增加，但各辣椒素組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。推測辣椒素可上調(diào)正常大鼠胃黏膜TRPV1表達(dá)，但與辣椒素劑量和作用時間無關(guān)，尚不能確定大鼠胃排空改變與胃黏膜TRPV1上調(diào)有關(guān)。

胃腸道CGRP主要分布于迷走神經(jīng)和內(nèi)臟神經(jīng)的傳入纖維以及胃腸道壁內(nèi)神經(jīng)叢，對辣椒素作用敏感。CGRP對大部分胃腸運動起抑制作用，引起胃底縱行肌、胃竇部環(huán)形肌松弛，胃內(nèi)壓下降，引起胃排空延遲，抑制胃腸運動。SP廣泛分布于腸神經(jīng)系統(tǒng)和整個胃腸道，可直接作用于平滑肌或間接通過釋放乙酰膽堿，引起胃腸平滑肌收縮，促進胃腸道運動。本研究結(jié)果顯示，辣椒素高劑量組灌胃3天及灌胃1周胃黏膜CGRP表達(dá)較對照組明顯增加，但灌胃2、4周胃黏膜CGRP表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；辣椒素中劑量組灌胃3天及灌胃1、2周胃黏膜CGRP表達(dá)較對照組明顯增加，而灌胃4周胃黏膜CGRP表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；辣椒素低劑量組灌胃3天及灌胃1、2、4周胃黏膜CGRP表達(dá)較對照組均有所增加。說明辣椒素引起的大鼠胃黏膜CGRP表達(dá)改變可能具有劑量和時間依賴性。推測辣椒素灌胃早期導(dǎo)致大鼠胃黏膜CGRP釋放，繼而引起胃動力抑制、胃排空減慢，隨著時間延長，胃黏膜CGRP消耗，抑制胃動力效應(yīng)消失。De Winter等[15]研究發(fā)現(xiàn)，1.6 mmol/L辣椒素溶液灌胃可降低50%胃肌電活動，明顯延遲胃排空；胃灌流液中CGRP含量是SP的100倍，持續(xù)CGRP灌注同樣可抑制胃肌電活動，而CGRP拮抗劑可抵消辣椒素溶液灌胃所致的胃排空延遲。本研究結(jié)果顯示，各組胃黏膜SP表達(dá)極少，且其表達(dá)不受辣椒素灌胃的影響。

綜上所述，辣椒素具有抑制大鼠胃排空作用，且劑量越大，抑制作用越強；隨著作用時間延長，劑量越大，抑制胃排空效應(yīng)減弱越明顯，其原因可能與胃黏膜CGRP大量消耗有關(guān)。

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彭燕(E-mail： 1806857826@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.010

R573

A

1002-266X(2017)40-0035-04

2016-09-04)