不同產(chǎn)地石上柏抗氧化和抗腫瘤活性比較

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1.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 遵義 563099

藥物研究

不同產(chǎn)地石上柏抗氧化和抗腫瘤活性比較

李三華1黎丹2蔣永梅2袁仕夢2魏瑋2王剛2*

1.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 遵義 563099

目的比較不同產(chǎn)地的石上柏抗氧化和抗腫瘤活性的差異。方法將采集于廣西、貴州、重慶和四川的十批石上柏樣品用乙醇提取后再以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。采用DHHP自由基清除、ABTS自由基清除和FRAP法測定三種萃取物的抗氧化活性；以肺癌A549和肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖活性測定三種萃取物的抗腫瘤活性。結(jié)果10批樣品中，貴州產(chǎn)地的石上柏的抗氧化活性最高，廣西產(chǎn)地的石上柏抗腫瘤活性最高；乙酸乙酯萃取物的2種生物活性均高于其他2種萃取物(P<0.05)。結(jié)論石上柏的乙酸乙酯萃取物具有良好的抗氧化和抗腫瘤活性，不同產(chǎn)地的石上柏生物活性有一定差異。

石上柏；雙黃酮；抗氧化；抗腫瘤

中藥石上柏來自于卷柏科植物深綠卷柏(SelaginelladoederleiniiHieron)的全草，又名大葉菜、深綠卷柏和地側(cè)柏等，主要產(chǎn)于我國南方地區(qū)；其味甘中帶澀、性溫平，主要含有雙黃酮類、生物堿、有機(jī)酸等活性成分[1-5]；具有清熱解毒、抗癌止血等多種功效，臨床中主要用于治療肺癌、鼻咽癌、慢性肝炎和風(fēng)濕等疾病[6-8]。石上柏在臨床上有廣泛的使用，但由于產(chǎn)地或來源不同，其活性成分的種類或含量具有差異性而導(dǎo)致藥效的不同。研究采集了貴州、四川、重慶及廣西4省市的10批次石上柏藥材，以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三種不同極性的試劑進(jìn)行活性物質(zhì)萃取，對不同萃取物進(jìn)行抗氧化和抗腫瘤活性檢測分析，為中藥石上柏的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 石上柏(SelaginelladoederleiniiHieron)采自于貴州、四川、重慶和廣西，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院天然藥物研究所楊建文副教授鑒定為正品(表1)。葡聚糖凝膠色譜填料、C18柱層析填料(北京綠百草公司)；硅膠GF254(青島海洋化工廠)；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、硫酸等化學(xué)試劑均為分析純(貴州遵義雙巨化學(xué)試劑公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；1640培養(yǎng)基(Hyclon)；CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)、2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)等分析試劑(國藥集團(tuán)試劑公司)。

表1 石上柏不同產(chǎn)地來源

1.2 儀器 MF-10A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化公司)；400MHz型核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；MAT95XP高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；CKX41型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；WD-9417B酶標(biāo)儀(蘇州奇樂電子科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(西安太康生物科技有限公司)；5810R型高速離心機(jī)(德國Eppendorff公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Forma公司)；SCV4AI型超凈工作臺(美國Shellab公司)。

1.3 樣品制備 稱取10個產(chǎn)地石上柏藥材各200g，粉碎，采用10倍量75%乙醇提取3次，每次1h，過濾，合并提取液，提取液在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液用適量熱水溶解，再經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取、濃縮，分別得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物。取3種萃取物用95%乙醇稀釋，分別配置成25、50、100、150、200、250、300 μg/mL，4℃存放備用。

1.4 DPPH自由基清除活性測定 取0.5 mL不同濃度的樣品溶液分別加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液各2 mL，溶液充分混合并室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定樣品的吸光值(Ax)，以0.5 mL乙醇代替樣品與DPPH乙醇溶液反應(yīng)作為空白對照組，吸光值為(A0)。按照公式：清除率=(A0-Ax)/A0×100%，計算不同濃度的樣品對DPPH自由基的清除率；根據(jù)自由基清除率作線性回歸方程，計算每個樣品清除自由基的IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 ABTS自由基清除活性測定 用蒸餾水將ABTS配制成7 mmol/L儲備液，與140 mmol/LK2S2O8溶液等體積混勻，在室溫下避光靜置反應(yīng)過夜；然后用磷酸鹽緩沖液稀釋反應(yīng)完成的ABTS+·溶液，使其在734 nm下吸光值為(0.700±0.020)。將0.4 mL不同濃度樣品溶液加入2.5 mLABTS+·溶液，在室溫下放置10 min后734 nm測定樣品吸光值(Ax)；以0.4 mL乙醇代替樣品與ABTS+·溶液反應(yīng)作為空白對照組，吸光值為(A0)；按以下公式計算ABTS自由基清除率：清除效率=(A0-Ax)/A0×100%，根據(jù)自由基清除率作回歸方程，計算各樣品清除自由基的IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 總抗氧化能力(FRAP法) 測定 0.5 mL不同濃度樣品溶液加入1.18 mL TPTZ工作液(由0.13mol/L醋酸鹽緩沖液25 mL，10 mmol/L TPTZ溶液2.15 mL，20 mmol/LFeCl3溶液215 mL組成)，混勻后在37℃條件下反應(yīng)10 min；在593 nm處測定樣品吸光度，以1.0 mmol/LFeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的摩爾質(zhì)量表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 抗腫瘤活性測定 取人肺腺癌A549和人肝癌SMMC-7721細(xì)胞在1640培養(yǎng)基中(含有L-谷氨酰胺2nmol/L，10%胎牛血清，鏈霉素100IU/mL和青霉素100IU/mL)于37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)。取生長旺盛細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞8000個；石上柏萃取物以DMSO溶解，培養(yǎng)基稀釋；細(xì)胞培養(yǎng)24h后加入石上柏萃取物，設(shè)立6個濃度組，使萃取物終濃度分別為25、50、100、200、400、800 μg/mL，以加入相同終體積的DMSO作為溶媒對照組；藥物作用48h后加入每孔10 μLCCK8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h后于560 nm測定實(shí)驗(yàn)組吸光值(Ax)和對照組吸光值(A0)。按下列公式抑制率(%)=(A0-Ax)/Ax×100%計算不同產(chǎn)地石上柏萃取物對腫瘤細(xì)胞的抑制率；根據(jù)每種萃取物的抑制率計算抑制腫瘤細(xì)胞的IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計，采用多因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗氧化活性

2.1.1 DPPH自由基清除能力 由圖1A可知，6號產(chǎn)地石上柏清除能力最強(qiáng)(其石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物的IC50分別為74.14 μg/mL、32.24 μg/mL和49.43 μg/mL)；7號產(chǎn)地石上柏清除能力最弱(其石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物的IC50分別為205.44 μg/mL、89.32 μg/mL和136.96 μg/mL)。

2.1.2 ABTS自由基清除能力 由圖1B可知，5號產(chǎn)地石上柏清除能力最強(qiáng)(其石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物的IC50分別為133.29 μg/mL、53.32 μg/mL和88.86 μg/mL)；10號產(chǎn)地石上柏清除能力最弱(其石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物的IC50分別為261.39 μg/mL、104.56 μg/mL和174.26 μg/mL)。

2.1.3 FRAP法總抗氧化能力 由圖1C可知，5號產(chǎn)地石上柏總抗氧化能力最強(qiáng)(其石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物的FRAP值分別為3219.46 μmol/g、8536.24 μmol/g和5597.31 μmol/g)；8號產(chǎn)地石上柏抗氧化能力最弱(其石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物FRAP值分別為939.46 μmol/g、7416.34 μmol/g和4787.15 μmol/g)。

不同產(chǎn)地的石上柏的抗氧化能力不同，不同試劑萃取物的抗氧化能力也有差異，來自貴州的4-6號石上柏樣品抗氧化能力較強(qiáng)，而來自重慶和四川7-10號石上柏抗氧化能力較弱；各個樣品不同溶劑萃取物抗氧化效果則均是乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>石油醚萃取物(P<0.05)。

2.2 抗腫瘤活性 由圖2可知，對于肺癌A549細(xì)胞，3號產(chǎn)地石上柏抑制能力最強(qiáng)(其石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物IC50分別為133.56 μg/mL、23.58 μg/mL和92.44 μg/mL)；9號產(chǎn)地石上柏抑制能力最弱(其石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物IC50分別為323.57 μg/mL、57.13 μg/mL和223.94 μg/mL)。對于肝癌SMMC-7721，2號產(chǎn)地石上柏抑制能力最強(qiáng)(其石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物IC50分別為142.03 μg/mL、25.07 μg/mL和98.30 μg/mL)；7號產(chǎn)地石上柏抑制能力最弱(其石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物IC50分別為434.82 μg/mL、76.77 μg/mL和300.94 μg/mL)。

產(chǎn)地廣西的1-3號石上柏樣品抗腫瘤能力較強(qiáng)，產(chǎn)地重慶和四川的7-10號石上柏樣品抗腫瘤能力較弱；各樣品不同溶劑萃取物的抗腫瘤效果仍然均是乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>石油醚萃取物(P<0.05)。

3 討論

研究中，產(chǎn)地貴州的石上柏的抗氧化活性優(yōu)于廣西和川渝地區(qū)的，而廣西的石上柏的抗腫瘤能力則優(yōu)于貴州和川渝地區(qū)的；無論是抗氧化或抗腫瘤功效，乙酸乙酯萃取物的作用最為明顯。研究發(fā)現(xiàn)，石上柏的乙酸乙酯萃取物的主要成分是穗花杉雙黃酮、銀杏杉雙黃酮、橡膠樹雙黃酮等雙黃酮類物質(zhì)，這些雙黃酮物質(zhì)具有抗腫瘤活性[9-14]。一些具有抗腫瘤功效的藥材也具有抗氧化作用，比如姜黃、白芍、虎杖等對DHHP具有非常強(qiáng)的清除作用，且這些藥材都具有較高含量的黃酮類物質(zhì)[15]；黃酮類物質(zhì)則是公認(rèn)的良好的抗氧化物質(zhì)，由此推測天然抗氧化劑與抗腫瘤具有一定相關(guān)性。研究中不同產(chǎn)地的石上柏的乙酸乙酯提取物顯示出較強(qiáng)的抗氧化作用和抗腫瘤作用，但兩種功效的強(qiáng)弱并非完全重疊，這可能與不同產(chǎn)地石上柏中的單體雙黃酮物質(zhì)的種類與含量存在一定的差異，值得進(jìn)一步探索研究。

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ComparisonofAntioxidationandAntitumorActivityofSelaginelladoederleiniiHieronfromDifferentHabitats

LI Sanhua1LI Dan2JIANG Yongmei2YUAN Shimeng2WEI Wei2WANG Gang2*

1. Research Center for Biology and Medicine, Zunyi Medical University, Zunyi 563099,China;2. School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi 563099,China

ObjectiveTo investigate the difference of antioxidation and antitumor activity ofSelaginelladoederleiniiHieron which harvested from different habitats.Methods10 batches ofSelaginelladoederleiniiHieronwere collected from GuangXi, GuiZhou,ChongQing and SiChuan and then extracted by alcohol followed by further extracted with petroleum benzin,ethyl acetate and n-butyl alcohol in turn. Antioxidation activity of three kinds of extract was estimated by the clearance capacity of DHHP and ABTS free radical together with reduction capacity by FRAP method.Antitumor activity was estimated through the proliferation of A549 and SMMC-7721 cancer cells.ResultsAmong the 10 batches ofSelaginelladoederleiniiHieron ,theSelaginelladoederleiniiHieron from GuiZhou had the highest Antioxidation activity while which from Guangxi had the highest Antitumor activity. These two bioactivities ofethyl acetate extract were higher than which of other two kinds of extract(P<0.05).ConclusionThe ethyl acetate extract ofSelaginelladoederleiniiHieron has good antioxidation and antitumor activity. Differences of bioactivity exist among theSelaginelladoederleiniiHieron which derived from different habitats.

SelaginelladoederleiniiHieron; Biflavones; Antioxidation; Antitumour

國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項目(NO.：81302639)。

李三華(1979-)，女，碩士研究生，副教授，研究方向?yàn)樘烊换钚晕镔|(zhì)抗腫瘤研究。E-mail:zyzmclsh@163.com

王剛(1977-)，男，博士研究生，教授，研究方向?yàn)樗幱弥参锱c抗腫瘤研究。E-mail:wg8855350@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)22-0011-04

2017-09-29 編輯：鄧佳麗)