人參水提取物對(duì)羥自由基的抑制作用

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 1166001

人參水提取物對(duì)羥自由基的抑制作用

李紅艷倪雪嬌張旭陳宏偉

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 1166001

目的比較人參不同水溶性提取物對(duì)羥自由基(·OH)的抑制作用。方法運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，提取人參水溶性有效部位；采用水楊酸法測(cè)定·OH清除率；通過(guò)方差分析和樣本聚類(lèi)分析優(yōu)選·OH抑制劑提取工藝。結(jié)果共提取得到16個(gè)樣品，其中12號(hào)樣品·OH清除率最大，在1g/L濃度下，其抑制率可達(dá)105.08%。結(jié)論人參水提取物中含有羥自由基清除劑，其最佳提取工藝為：pH8，料液比1∶10，4℃提取3次，每次12h。

人參水提取物；正交試驗(yàn)；羥自由基；抗氧化

人參(PanaxginsengC.A.Meyer.)是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[1-2]?？偨Y(jié)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，人參多種作用都與其抗氧化活性密切相關(guān)，有關(guān)人參有效成分的抗氧化活性已有多篇報(bào)道[3-5]，作者前期也報(bào)道了人參的抗氧化作用[2]，并對(duì)多種抗氧化酶尤其是人參SOD進(jìn)行了大量研究。然而，目前報(bào)道多是對(duì)某種成分進(jìn)行抗氧化研究，很少進(jìn)行活性導(dǎo)向下的有效成分分離，對(duì)人參中·OH抑制劑的提取分離實(shí)驗(yàn)者尤其未見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)制備不同提取條件下的人參水提取物，并測(cè)定其·OH清除率，為探索人參中·OH抑制劑的提取工藝及其活性導(dǎo)向下的有效成分分離奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 生曬參購(gòu)自陽(yáng)光大藥房，產(chǎn)地為吉林長(zhǎng)白山，經(jīng)本校鑒定教研室張慧教授鑒定，為4～5年生園參；BP-211D電子天平(Sartorius)；ALPHA12冷凍干燥機(jī)(Christ)；MR-96A型酶標(biāo)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 人參水提取物的制備 生曬參，粉碎，平均分成16份，每份0.5 g。按照正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.0L16(45)正交設(shè)計(jì)表，采用緩沖溶液(0.2MNa2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH4.0；0.2MNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH6.0；0.2MNH4Cl-氨水緩沖液，pH8.0、pH10.0)提取，考察的因素水平如下：pH4、6、8、10；料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(m∶v)；提取時(shí)間6、12、18、24h；提取溫度4、20、40、60℃；提取次數(shù)1、2、3、4次。各提取液4℃5000rpm離心10 min，收集上清，合并各次上清液，0.45μM濾膜過(guò)濾，各留取1 mL用于實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記為1-16號(hào)樣品，其余液體冷凍干燥后，-20℃保存。

1.2.2 羥自由基清除能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)[6]，采用Fenton法，于96孔板中分別加入FeSO4(6mM)、樣品、H2O2(6mM)各20 μL，靜置10 min，加入水楊酸溶液(6mM)20 μL，靜置30min，測(cè)定510 nm處的吸光度A值，以蒸餾水作空白，每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算羥自由基清除率。清除率=A空-(A樣-A對(duì))/A空。A空為不加樣品的A值，A對(duì)為不加水楊酸時(shí)的A值。

1.2.3 樣本聚類(lèi)分析 以樣品提取率和·OH清除率為聚類(lèi)要素，運(yùn)用SPSS13.0軟件，對(duì)16個(gè)樣品進(jìn)行分析，采用離差平方和法(Ward'Method)計(jì)算類(lèi)間距離。

1.2.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)羥自由基清除率，優(yōu)選提取工藝，并按此工藝，重復(fù)試驗(yàn)3次，按照上述方法測(cè)定并計(jì)算提取液羥自由基清除能力(1g/L)，進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以R值最小列為誤差項(xiàng)，進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參水提取物的制備 利用正交實(shí)驗(yàn)，共制備得到16個(gè)樣品，各樣品的提取條件及提取率見(jiàn)表1。

2.2 人參水提物對(duì)羥自由基的抑制作用 利用Fenton法測(cè)定各樣品的·OH清除率，并根據(jù)樣品濃度及其實(shí)驗(yàn)用體積，折算出各樣品單位濃度即1g/L(提取物濃度)下的羥自由基清除率(表1)；同時(shí)，以·OH清除率(提取物1g/L)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方程分析(表2)。由表1可見(jiàn)，12號(hào)和14號(hào)樣品羥自由基清除率最高且相近；由表2可見(jiàn)，提取溫度(D)和料液比(B)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著(P<0.05)。

表1 人參水提取物的羥自由基清除率

注：A→E五因素的四個(gè)水平(1→4)分別為：pH4、6、8、10；料液比(倍)5、10、15、20；提取時(shí)間(h)6、12、18、24；提取溫度(℃)4、20、40、60；提取次數(shù)1、2、3、4次。樣品提取率=凍干后樣品質(zhì)量/用于凍干的樣品體積×樣品總體積/0.5×100%

表2 羥自由基清除率方差分析

2.3 16個(gè)樣品的聚類(lèi)分析 為了方便比較各樣品間的差距，對(duì)16個(gè)樣品以提取率、·OH清除率(提取物)和·OH清除率(生藥)為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。·OH清除率%(生藥，1g/L)等于·OH清除率%(提取物，1g/L)與樣品提取率的乘積(結(jié)果未列)。由圖1可見(jiàn)，當(dāng)距離為5時(shí)，16個(gè)樣品被聚為2類(lèi)，即12、14、7聚為一類(lèi)，其余聚為1類(lèi)，這與單純以·OH清除率(提取物)為評(píng)價(jià)指標(biāo)的聚類(lèi)結(jié)果(未列)一致。比較各樣品的提取條件，不難看出，低溫和弱堿性pH是獲取較高活性·OH抑制劑的共性條件。

綜合圖1和表1，12號(hào)(A3B4C2D1E3)和14號(hào)(A4B2C3D1E4)樣品羥自由基清除率最高且相近；同時(shí)，據(jù)表1直觀分析結(jié)果，A3與A4、B4與B2、C2與C3接近，考慮到成本的節(jié)約和工藝的可行性，最終確定人參水提物中·OH抑制劑的最佳提取條件是A3B2C2D1E3，即pH8，料液比1∶10，4℃提取3次，每次12h。

2.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 按照上述優(yōu)選的提取方法A3B2C2D1E3，精密稱(chēng)取0.200g生曬參粉，3次浸提液合并，實(shí)驗(yàn)平行3份，所得樣品羥自由基清除率分別為100.64%、98.25%、94.38%，平均值97.76%，表明該提取工藝下的人參水提取物羥自由基抑制率較高且穩(wěn)定可行。

3 討論

前期研究表明，人參中含有多種抗氧化酶[7]，其中人參SOD已被分離得到[8]，其體外活性已有多篇報(bào)道[5-7]，對(duì)·OH抑制劑的研究目前未見(jiàn)報(bào)道。論文參考前期抗氧化酶的提取工藝，考慮到中醫(yī)的傳統(tǒng)用藥習(xí)慣和人類(lèi)追求健康飲食的心里，避免使用有機(jī)溶劑，采用緩沖溶液提取法制備人參水溶性提取物，并基于正交實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜉^全面地考察多因素多水平，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)。運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選·OH抑制劑的提取工藝，結(jié)果表明，人參水提物中含有·OH抑制劑，其活性受溫度、料液比、pH等影響，尤其受溫度影響最大，以低溫活性較高。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并參考前期研究結(jié)果[7]，推測(cè)該·OH抑制劑很可能是一種抗氧化酶類(lèi)，如過(guò)氧化氫酶(CAT)。

比較各提取物·OH清除率，以12號(hào)樣品最高(105.08%)；但比較相同生藥濃度(1g/L)下各樣品·OH清除率，則4號(hào)樣品最高(3.11%)。因4號(hào)樣品的提取率(6.72)是12號(hào)樣品(1.67)的4倍(表1)，但其·OH清除率(1g/L生藥)僅為12號(hào)樣品的1.8倍(3.11%4號(hào)，1.75%12號(hào))，筆者認(rèn)為，12號(hào)樣品的提取條件更有利于獲得高活性·OH抑制劑。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者以提取物·OH清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定A3B2C2D1E3為最佳提取工藝。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)僅是對(duì)·OH抑制劑提取工藝的初步研究，更為理想的提取方法還需要在此基礎(chǔ)上，縮小各水平的跨度做進(jìn)一步探索。另外，本實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)室小試，放大生產(chǎn)后，提取條件可能會(huì)發(fā)生變化，其活性導(dǎo)向下的有效成分的分離純化尚需進(jìn)一步研究。

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InhibitoryEffectofGinsengWaterExtractonHydroxylRadical

LI Hongyan NI Xuejiao ZHANG Xu CHEN Hongwei

College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China

ObjectiveComparing the inhibitory effect of different Water-soluble Extracts on Hydroxyl Radical.MethodsUsing orthogonal test design, extraction of ginseng water soluble effective parts; the hydroxyl radical scavenging rate of each extract was determined by salicylic acid method.ResultsSample No. 4 the highest yield (6.72%), Sample No. 12 hydroxyl radical scavenging maximum (105.08%).ConclusionGinseng water extract contains hydroxyl radical scavenger, the optimum extraction process is pH 8, feed ratio 1∶10，extraction 3 times, each time 12h at 4℃.

Ginseng Water Extract; Orthogonal Test; Hydroxyl Radicals; Anti-oxidation

遼寧省教育廳項(xiàng)目(L201606)；中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2013M530945)。

李紅艷(1982-)，女，漢族，博士研究生，副教授，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail：lhywaiw @163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)22-0018-03

2017-09-08 編輯：鄧佳麗)