MiRNA-203在尋常性銀屑病皮損的表達及其對HaCaT細胞增殖的影響

梁穎紅 魏明 劉佳 龔艷杰 涂玲 張宜花

450052鄭州大學第五附屬醫(yī)院檢驗科

MiRNA-203在尋常性銀屑病皮損的表達及其對HaCaT細胞增殖的影響

梁穎紅 魏明 劉佳 龔艷杰 涂玲 張宜花

450052鄭州大學第五附屬醫(yī)院檢驗科

目的 研究微小核糖核酸（miRNA）-203在尋常性銀屑病患者皮損中的表達，并探討對角質(zhì)形成細胞株（HaCaT細胞）增殖的影響。方法 取2014—2016年23例尋常性銀屑病患者的皮損組織和相鄰非皮損組織。熒光定量PCR法檢測組織中miRNA-203的表達水平，并以5′端、3′端地高辛標記的探針對皮膚組織切片中目的miRNA進行原位雜交，觀察miRNA-203在皮膚組織中的定位情況。將miRNA-203模擬物（miRNA-203模擬物組）和miRNA-203模擬物陰性對照（陰性對照組）分別轉染HaCaT細胞，正常細胞培養(yǎng)組作為空白對照組，采用噻唑藍（MTT）法、流式細胞儀和Western印跡法分別對HaCaT細胞的增殖、細胞周期及相關周期蛋白（Cyclin D1、Cyclin B1）的變化進行檢測。結果 miRNA-203特異性地表達在表皮的角質(zhì)形成細胞中，除細胞核外，細胞質(zhì)亦有表達，且尋常性銀屑病患者皮損組織中miRNA-203表達水平（1.35±0.28）顯著高于非皮損組織（0.52±0.09），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.76，P=0.012）。轉染miRNA-203模擬物能抑制HaCaT細胞增殖（F=9.36，P=0.007），且空白對照組、陰性對照組和miRNA-203模擬物組HaCaT細胞增殖率均隨時間的延長逐漸增加（F=18.68，P＜0.001）。與陰性對照組和空白對照組相比，miRNA-203模擬物組HaCaT細胞被阻滯在G2/M期（G2/M期細胞比例：31.33%±4.56%比17.02%±3.53%、16.67%±3.32%，均P＜0.05），HaCaT細胞周期蛋白周期蛋白D1表達水平較高（1.15±0.13比0.52±0.05、0.56±0.07，均P＜0.05），而周期蛋白B1水平較低（0.43±0.08比0.93±0.16、0.91±0.0.15，均P＜0.05）。結論 miRNA-203可能參與了尋常性銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程。

銀屑病，尋常性；微小核糖核酸；角質(zhì)形成細胞；細胞增殖

近年來研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（micro-RNA，miRNA）在調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞增殖分化、皮膚炎癥及免疫細胞之間的相互影響等方面發(fā)揮重要作用［1-2］。在銀屑病皮損中異常表達的各組成細胞中，只有角質(zhì)形成細胞表達miRNA-203，具有高度皮膚特異性。通過限制表皮細胞增殖潛能、誘導其退出細胞周期，促進表皮細胞分化［3-4］。但miRNA-203在銀屑病發(fā)生中的確切作用還不清楚。本研究用熒光定量PCR分析尋常性銀屑病患者皮損中miRNA-203的表達，同時以HaCaT細胞為研究模型，分析轉染miRNA-203模擬物對HaCaT細胞增殖、細胞周期及其相關蛋白的變化，探討miRNA-203在尋常性銀屑病中可能的作用，為開展尋常性銀屑病的靶向治療提供部分依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.組織來源：2014—2016年鄭州大學第五附屬醫(yī)院皮膚科23例尋常性銀屑病患者，其中男13例，女10例，年齡32.4±6.8（6～65）歲。本研究經(jīng)鄭州大學第五附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者術前均簽署知情同意書。納入標準：符合《中國臨床皮膚病學》［5］的尋常性銀屑病診斷標準；排除標準：近2周內(nèi)局部外用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑；近1個月系統(tǒng)應用糖皮質(zhì)激素、阿維A、補骨脂素等系統(tǒng)治療、紫外線治療及日光?。挥行呐K、肝腎疾病及精神疾病者；有感染、妊娠、分娩、外傷等應激狀態(tài)；有各器官惡性腫瘤者。

2.細胞與主要試劑：人HaCaT細胞由上海復祥生物科技有限公司提供。miRCURYTM原位雜交探針（丹麥Exiqon公司）；Anti-DIG-AP抗體、四唑硝基藍（NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（BCIP）顯色試劑盒（瑞士Roche公司）。RNAiso試劑、反轉錄試劑盒、熒光染料試劑SYBR Green I Master（日本TaKaRa公司）；Lipofectamine 2000 Reagent（德國Invitrogen公司）；二喹啉甲酸蛋白（BCA）試劑盒、細胞周期試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；噻唑藍（MTT）試劑盒（美國Sigma公司）。鼠單克隆抗體、兔二抗、鼠二抗（英國Abcam公司）；周期蛋白B1、周期蛋白D1兔單克隆抗體（德國CST公司）。

二、方法

1.標本獲?。壕致橄滦惺中g取材，術后立即將手術標本的皮損區(qū)與相鄰非皮損區(qū)分離，一部分以4%甲醛固定、石蠟包埋，用于原位雜交，一部分于-196℃液氮中凍存，用于熒光定量PCR檢測miRNA-203。

2.原位雜交：將蠟塊制成4 μm組織切片，以5′端、3′端地高辛（DIG）標記的目的探針行原位雜交，miRNA-203探針序列為5′-TAGTGGTCCTAAACATT TCA-3′。U6 snRNA探針為陽性對照，序列為5′-CACGAATTTGCGTGTCATCCTT-3′，無義微小 RNA探針為陰性對照，序列為5′-GTGTAACACGTCTATA CGCCCA-3′。脫蠟后蛋白酶K消化10 min，54℃雜交儀中雜交2 h，堿性磷酸酶結合的抗地高辛抗體孵育1 h，NBT/BCIP（含2 mmol/L左旋咪唑）進行顯色。各步驟均嚴格按照試劑操作說明進行，NIKON光學顯微鏡下觀察顯色情況，對miRNA-203的表達進行定位。

3.熒光定量PCR檢測miRNA-203的表達：按照RNAiso RNA提取試劑盒說明書提取冷凍組織總RNA。以紫外分光光度計測總RNA純度及濃度。cDNA的合成按照反轉錄試劑盒操作說明書進行。熒光定量PCR實驗所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成，以U6作為內(nèi)參照，引物序列分別為miRNA-203反轉錄：5′-CTCAACTGGT GTCGTGGA-3′，正向引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGG AG-3′，反向引物：5′-GGGTCAGTGCATCACAGAA-3′；U6 反轉錄：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應體系的配制及反應條件的設置均按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行。用2-ΔΔCt計算miRNA-203相對表達量。

4.細胞培養(yǎng)：HaCaT細胞在含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的改良DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞單層鋪滿培養(yǎng)瓶后，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗1次，加0.25%胰蛋白酶消化液，待鏡下細胞圓縮時，DMEM培養(yǎng)液終止消化，細胞收集于離心管中，1 000×g離心5 min，棄上清，將細胞懸液分別移至冷凍管中，每管1.5 ml，將凍存管先置于4℃冰箱2 h，再移至-80℃低溫冰箱24 h，然后投入-196℃液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

5.miRNA-203模擬物的設計、合成、轉染及實驗分組：針對靶點miRNA-203設計其模擬物，其正向引物為 5′-UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU-3′，反向引物為5′-AAAGUUCUGUGAUGCACUGAUU-3′。按照Lipofectamine 2000說明書的要求進行轉染。細胞達到70%～80%融合度時，按實驗要求分組如下：空白對照組（僅加含Lipofectamine 2000的DMEM高糖培養(yǎng)基）、miRNA-203模擬物陰性對照組（加入含Lipofectamine 2000的DMEM高糖培養(yǎng)基和miRNA-203模擬物陰性對照物）、miRNA-203模擬物組（加入含Lipofectamine 2000的DMEM高糖培養(yǎng)基和miRNA-203模擬物）。孵育6 h后，置換為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每組實驗重復3次取均值。

6.Western印跡法檢測細胞周期相關蛋白：在HaCaT細胞轉染miRNA-203模擬物或陰性對照物后72 h，收集細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。制備十二烷基磺酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量為12.5 μg，進行常規(guī)電泳后，凝膠轉移至硝酸纖維素膜上。取出轉移膜，用5%脫脂牛奶封閉。分別用兔抗人周期蛋白D1（1∶3 000）、周期蛋白 B1一抗（1∶1 500）、GAPDH一抗（1∶3 000）于4℃冰箱中孵育過夜。TBST洗滌3次，分別加入1∶3 000稀釋的兔、鼠二抗，室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，增強化學發(fā)光（ECL）液處理并發(fā)光顯像。

7.MTT法檢測HaCaT細胞增殖：將轉染miRNA-203模擬物后的HaCaT細胞濃度調(diào)整為2×104/ml，96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入200 μl培養(yǎng)液。分別在轉染后的24、48、72和96 h，在各組孔內(nèi)加入5 g/L MTT工作液20 μl，繼續(xù)37 ℃孵育4 h。吸去上清液，每孔加入200 μl二甲基亞砜（DMSO），置平板搖床振蕩至結晶完全溶解后，酶標儀測定490 nm波長處各孔的吸收度（A）值。陰性對照組和空白對照組同樣處理，實驗重復3次取均值，并繪制細胞增殖曲線。

8.流式細胞儀檢測細胞周期：將HaCaT細胞鋪于6孔板并轉染。48 h后收集細胞，按照說明書用RNA酶處理細胞后加入碘化丙錠（PI），避光孵育30 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期變化。

9.統(tǒng)計學方法：采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。尋常性銀屑病患者皮損與非皮損區(qū)miRNA-203表達的比較采用配對t檢驗；多組間細胞周期蛋白表達表達量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；分析轉染miRNA-203模擬物不同時間對HaCaT細胞增殖的影響采用重復測量資料的方差分析，調(diào)用多元方差分析中的LSD檢驗進行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、尋常性銀屑病患者皮損中miRNA-203的定位及表達

光學顯微鏡下觀察原位雜交切片，miRNA-203特異性地在角質(zhì)形成細胞表達，除細胞核外，細胞質(zhì)亦有表達，在基底層表達較高，真皮中沒有明顯著色，見圖1。miRNA-203在尋常性銀屑病皮損區(qū)的表達（1.35±0.28）高于非皮損區(qū)（0.52±0.09），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.76，P=0.012）。

圖1 尋常性銀屑病患者皮損與非皮損中miRNA-203的定位（×100） 1A：非皮損區(qū)miRNA-203；1B：皮損區(qū)miRNA-203；1C：U6陽性對照；miRNA-203特異性在角質(zhì)形成細胞表達，除細胞核外，細胞質(zhì)亦有表達，呈藍紫色；尋常性銀屑病皮損區(qū)miRNA-203表達明顯高于非皮損區(qū)

二、miRNA-203與細胞周期蛋白表達的關系

miRNA-203模擬物轉染HaCaT細胞72 h后，miRNA-203模擬物組、陰性對照組和空白對照組間細胞周期蛋白周期蛋白D1和周期蛋白B1的相對表達量均各不相同，差異有統(tǒng)計學意義（F=31.29、25.83，P ＜ 0.001）。miRNA-203模擬物組周期蛋白D1蛋白（1.15±0.13）顯著高于陰性對照組（0.52±0.05）和空白對照組（0.56±0.07），差異均有統(tǒng)計學意義（LSD-t=11.26、10.45，P=0.012、0.015），而周期蛋白B1蛋白（0.43±0.08）顯著低于陰性對照組（0.93±0.16）和空白對照組（0.91±0.0.15），差異均有統(tǒng)計學意義（LSD-t=15.33、15.16，P=0.009、0.009），見圖2。

圖2 Western印跡法分析轉染miRNA-203模擬物72 h后HaCaT細胞周期蛋白表達 1：空白對照組；2：陰性對照組；3：miRNA-203模擬物組

三、miRNA-203對HaCaT細胞增殖的影響

MTT檢測轉染miRNA-203模擬物后24、48、72、96 h對HaCaT細胞增殖能力的影響，結果見圖3和表1。重復測量方差分析顯示，空白對照組、陰性對照組和miRNA-203模擬物組間HaCaT細胞增殖率不同（F=9.36，P=0.007），兩兩多重比較結果顯示，轉染后48、72、96 h，miRNA-203模擬物組細胞增殖A值顯著低于空白對照組（LSD-t=3.24、4.56、8.67，均P ＜ 0.05）和陰性對照組（LSD-t=3.24、4.68、7.35，均P＜0.05），提示轉染miRNA-203模擬物能抑制HaCaT細胞的增殖；時間因素有統(tǒng)計學意義（F=18.68，P＜0.001），說明HaCaT細胞增殖率有隨時間變化的趨勢，如圖3所示，HaCaT細胞增殖A值隨時間的延長逐漸增加；時間和分組的交互作用沒有統(tǒng)計學意義（F=1.37，P=0.21），說明各組HaCaT細胞增殖率隨時間變化的趨勢沒有明顯差異。

圖3 miRNA-203模擬物對HaCaT細胞株增殖的影響（490 nm熒光A值） 空白對照組、陰性對照組和miRNA-203模擬物組HaCaT細胞增殖A值均隨時間的延長而逐漸增加，但48～96 h miRNA-203模擬物組

表1 轉染miRNA-203模擬物后對HaCaT細胞增殖的影響（A490，±s）

表1 轉染miRNA-203模擬物后對HaCaT細胞增殖的影響（A490，±s）

注：空白對照組為僅加入DMEM高糖培養(yǎng)基；陰性對照組為加入DMEM高糖培養(yǎng)基和miRNA-203模擬物陰性對照物；miRNA-203模擬物組：加入DMEM高糖培養(yǎng)基和miRNA-203模擬物；a每個時間點3個分組間的比較；bLSD-t檢驗顯示，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；cLSD-t檢驗顯示，與陰性對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）

四、miRNA-203對HaCaT細胞G2/M期的影響

miRNA-203模擬物轉染HaCaT細胞48 h后，miRNA-203模擬物組、陰性對照組和空白對照組G2/M期HaCaT細胞比例各不相同，差異有統(tǒng)計學意義（F=29.67，P ＜0.001），且miRNA-203模擬物組G2/M期HaCaT細胞比例（31.33%±4.56%）顯著高于陰性對照組（17.02%±3.53%）和空白對照組（16.67%±3.32%），差異均有統(tǒng)計學意義（LSD-t=10.68、11.02，P=0.018、0.016），見圖4。

圖4 轉染miRNA-203模擬物48 h后對HaCaT細胞G2/M期的影響 4A：空白對照組；4B：陰性對照組；4C：miRNA-203模擬物組

討 論

研究表明，miRNA是一種普遍存在于真核生物中的小分子，已發(fā)現(xiàn)的上千條miRNAs基因中，絕大多數(shù)在不同組織及發(fā)育階段中的表達水平有差異，即miRNA的表達模式具有時間及空間特異性。Yi等［6］在對小鼠表皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，在小鼠發(fā)育的不同時期，miRNA-203的表達是不一樣的。隨后，Wei等［7］對人胚胎的研究也發(fā)現(xiàn)，miRNA-203在胚胎17周時才顯著表達，在14周前基本檢測不出；在沒有鈣離子、對苯二甲酸（TPA）等誘導分化因素存在時，miRNA-203也可誘導角質(zhì)形成細胞的分化。提示miRNA-203在皮膚的增殖和分化中發(fā)揮了作用［8］。

本研究結果顯示，尋常性銀屑病患者皮損區(qū)miRNA-203的表達高于非皮損區(qū)，與Sonkoly等［9］研究結果一致。原位雜交結果顯示，miRNA-203幾乎特異性地表達在表皮的角質(zhì)形成細胞，除細胞核外，細胞質(zhì)亦有表達，在基底層表達較高，真皮中沒有明顯著色。據(jù)此推測，尋常性銀屑病中miRNA-203的異常表達可能參與了銀屑病的發(fā)病過程，并可導致表皮細胞和浸潤細胞間信號傳導功能障礙［10-11］。研究發(fā)現(xiàn)［12-13］，miRNA-203在人角質(zhì)形成細胞中可通過調(diào)控腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素24（IL-24）的編碼基因、直接結合IL-8 3′UTR等途徑，參與炎癥過程。

周期蛋白D1是G1到S期細胞周期調(diào)節(jié)的關鍵因子，是成纖維細胞和上皮細胞增殖所必需的，如降低周期蛋白D1的表達，控制細胞周期G1期到S期的過度，可強有力地抑制角質(zhì)形成細胞增殖。周期蛋白B1蛋白在整個細胞周期中的表達呈時相性變化，周期蛋白B1蛋白在G1期表達量極低，S期明顯增加，在G2期達到最高［14］。我們用HaCaT細胞作為研究模型，探討miRNA-203生物學功能。在HaCaT細胞中轉染miRNA-203模擬物后，miRNA-203模擬物組HaCaT細胞增殖能力下降、細胞周期阻滯、周期蛋白下調(diào)，提示miRNA-203可能通過JAK/STAT信號通路參與細胞的增殖、分化和周期改變［15］。

綜上所述，miRNA-203在尋常性銀屑病皮損區(qū)的表達顯著高于非皮損區(qū)，其表達定位在角質(zhì)形成細胞的細胞核和細胞質(zhì)中。miRNA-203與SOCS3、JAK/STAT信號傳導通路有密切聯(lián)系，故有必要針對miRNA-203及其靶點進行深入研究，揭示其在尋常性銀屑病中的作用機制。

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Expression of miRNA-203 in psoriasis vulgaris skin lesions and its effect on the proliferation of HaCaT cells

Liang Yinghong,Wei Ming,Liu Jia,Gong Yanjie,Tu Ling,Zhang Yihua
Clinical Laboratory,Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

Wei Ming,Email:gushiweiming@126.com

Objective To investigate the expression of miRNA-203 in skin lesions of patients with psoriasis vulgaris,and to explore its effect on the proliferation of a human keratinocyte cell line HaCaT.Methods Lesional skin and adjacent non-lesional skin tissues were obtained from 23 patients with psoriasis vulgaris from 2014 to 2016.Fluorescence-based quantitative PCR was performed to determine the expression of miRNA-203 in these skin tissues.Targeted miRNA in skin tissues was in situ hybridized by using 5′and 3′digoxigenin-labelled probes,so as to localize the expression of miRNA-203 in skin tissues.Cultured HaCaT cells were divided into 3 groups:miRNA-203 mimic group and negative control group transfected with miRNA-203 mimics and negative control miRNA-203 respectively,and blank control group receiving no treatment.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay,flow cytometry and Western blot analysis were performed to investigate changes in cellular proliferative activity,cell cycle and its related proteins Cyclin D1 and Cyclin B1 in HaCaT cells respectively.Results MiRNA-203 was specifically expressed in epidermal keratinocytes.Besides the cell nuclei,it could be expressed in the cytoplasm.In the patients with psoriasis vulgaris,the expression of miRNA-203 was significantly higher in lesional skin tissues than in nonlesional skin tissues（1.35 ± 0.28 vs.0.52 ± 0.09,t=6.76,P=0.012）.The transfection with miRNA-203 mimics could significantly inhibit the proliferation of HaCaT cells（F=9.36,P=0.007）.Additionally,the blank control group,negative control group and miRNA-203 mimic group all showed a gradual increase in proliferative activity of HaCaT cells over time（F=18.68,P ＜ 0.001）.HaCaT cells were arrested in G2/M phase in the miRNA-203 mimic group with the percentage of cells in G2/M phase being 31.33%±4.56%,compared to 17.02% ±3.53%in the negative control group（P＜0.05）and 16.67% ±3.32%in the blank control group（P ＜ 0.05）.Moreover,the miRNA-203 mimic group showed significantly higher protein expression of Cyclin D1（1.15 ± 0.13）,but significantly lower protein expression of Cyclin B1（0.43 ±0.08）,compared with the negative control group（0.52±0.05,0.93±0.16,respectively,both P ＜0.05）and blank control group（0.56±0.07,0.91±0.0.15,respectively,both P＜0.05）.Conclusion MiRNA-203 may participate in the occurrence and development of psoriasis vulgaris.

Vulgaris,psoriasis;MicroRNA;Keratinocyte cells;Cell proliferation

魏明，Email：gushiweiming@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.006

2017-01-16）

（本文編輯：周良佳 顏艷）