羊水干細(xì)胞移植對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎臟微血管損傷的影響及其機(jī)制

高芳，厲書林，孫東

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇徐州221002)

·基礎(chǔ)研究·

羊水干細(xì)胞移植對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎臟微血管損傷的影響及其機(jī)制

高芳，厲書林，孫東

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇徐州221002)

目的探討羊水干細(xì)胞(AFSCs)移植對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠腎臟微血管損傷的影響及其可能的機(jī)制。方法選擇1例孕中期需進(jìn)行產(chǎn)前篩查的孕婦，穿刺抽取羊水后分離、培養(yǎng)AFSCs，制備AFSCs懸液。將36只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和觀察組，每組12只。模型組和觀察組采用結(jié)扎的方法建立左側(cè)UUO模型，假手術(shù)組只游離輸尿管不結(jié)扎。觀察組腹部縫合后經(jīng)尾靜脈注射150 μL AFSCs懸液，模型組和假手術(shù)組注射等量生理鹽水。三組術(shù)后第3、7天分別處死6只小鼠，采用HE染色觀察腎組織病理情況，免疫組化法檢測(cè)腎組織管周毛細(xì)血管密度，Western blotting法檢測(cè)腎組織尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(gp91-phox)、抗硝基酪氨酸(NT)蛋白表達(dá)。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組腎臟結(jié)構(gòu)正常；模型組術(shù)后第3、7天出現(xiàn)不同程度的腎小管上皮細(xì)胞腫脹，空泡變性，刷狀緣消失，腎間質(zhì)增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)纖維化程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重。觀察組術(shù)后第3、7天均出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化，但其程度均輕于模型組同時(shí)間點(diǎn)。模型組、觀察組術(shù)后第3、7天腎組織管周毛細(xì)血管密度均低于假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)，gp91-phox、NT蛋白相對(duì)比表達(dá)量均高于假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)，但模型組變化更明顯(P均<0.05)。結(jié)論AFSCs移植可減輕單側(cè)UUO小鼠腎臟微血管損傷；通過降低gp91-phox、NT表達(dá)而減輕氧化應(yīng)激是其可能的機(jī)制。

輸尿管梗阻；羊水干細(xì)胞；微血管損傷；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶；抗硝基酪氨酸

干細(xì)胞是一類具有較強(qiáng)自我更新和定向分化能力的原始細(xì)胞，是組織、器官結(jié)構(gòu)與功能再生的理想種子細(xì)胞，因此干細(xì)胞移植逐漸成為腎臟疾病修復(fù)再生的治療手段[1～3]。胚胎干細(xì)胞(ESCs)是一類未分化細(xì)胞，具有高度的自我復(fù)制能力，幾乎可以分化為人體內(nèi)所有的組織器官，但因倫理學(xué)爭(zhēng)議及安全性問題導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制[4]。羊水干細(xì)胞(AFSCs)是比成體干細(xì)胞(ASCs)更原始的干細(xì)胞，其多能性介于ESCs和ASCs之間，可以向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)原細(xì)胞等分化。維持腎臟微血管的數(shù)目及功能，對(duì)于減輕腎臟組織形態(tài)學(xué)損傷及腎功能惡化、延緩腎臟纖維化進(jìn)程具有重要意義。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(gp91-phox)與硝基酪氨酸(NT)均為氧化應(yīng)激相關(guān)因子，其表達(dá)變化均可引起氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。2014年12月～2016年2月，本研究觀察了AFSCs移植對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠腎臟微血管損傷的影響。現(xiàn)將結(jié)果及其可能的機(jī)制報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性裸小鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水、攝食，飼料由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所，抗gp91-phox兔多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，抗NT鼠多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 AFSCs分離及培養(yǎng) 選擇1例孕中期需進(jìn)行產(chǎn)前篩查的孕婦，穿刺抽取羊水10 mL，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，下層沉淀即為AFSCs。將AFSCs使用DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并加入15% FBS、4 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、100 μg/mL谷氨酰胺、1%雙抗。將細(xì)胞懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入5 mL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至70%～80%后，加入0.05%酶-EDTA進(jìn)行消化，按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，2～3天更換培養(yǎng)基。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，孕婦及其家屬均知情同意。

1.3 建模與分組處理 將36只雄性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和觀察組，每組12只。模型組和觀察組采用結(jié)扎的方法[5]建立左側(cè)UUO模型；假手術(shù)組只游離輸尿管，不結(jié)扎。觀察組腹部縫合后經(jīng)尾靜脈注射150 μL AFSCs懸液(AFSCs數(shù)量為3.5×105個(gè))，模型組和假手術(shù)組注射等量生理鹽水。三組于術(shù)后第3、7天分別處死6只小鼠，打開腹腔后迅速切除左腎，剝離腎包膜，冷生理鹽水沖洗干凈。取部分腎組織置于10%中性甲醛中固定，剩余腎組織-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 腎組織病理情況 采用HE染色。取三組術(shù)后第3、7天中性甲醛固定后的腎組織標(biāo)本，石蠟包埋，4 μm厚度切片。貼附于防脫載玻片上，60 ℃烤箱烘烤3 h。常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色，蒸餾水沖洗；待達(dá)到合適的染色程度，置于0.25%鹽酸乙醇中分化數(shù)秒，蒸餾水沖洗。1%氨水返藍(lán)，蒸餾水沖洗3次，于伊紅染液中浸染數(shù)十秒；顯微鏡下觀察染色程度，蒸餾水沖洗3 min×3次。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理改變。

1.4.2 腎組織管周毛細(xì)血管(PTCs)密度 采用免疫組化法。取三組術(shù)后第3、7天中性甲醛固定后的腎組織標(biāo)本，石蠟包埋，4 μm厚度切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，PBS清洗5 min×3次。枸櫞酸鹽緩沖液高壓水煮抗原修復(fù)，PBS清洗5 min×3次，3% H2O2孵育，消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS清洗5 min×3次。進(jìn)口羊血清工作液37 ℃ 封閉1 h，PBS浸洗5 min×3次。加入CD34一抗，4 ℃孵育過夜，室溫復(fù)溫30 min，PBS清洗5 min×3次；加入二抗，室溫孵育至少1 h。PBS搖床清洗5 min×3次。顯微鏡下DAB液顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸分化，脫水，透明，封片。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察CD34表達(dá)情況，CD34陽(yáng)性表達(dá)呈黃褐色，定位于腎臟間質(zhì)。采用Image Pro Plus軟件分析其光密度值，以CD34表達(dá)的光密度值表示腎組織PTCs密度。

1.4.3 腎組織gp91-phox、NT蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。取置于-80 ℃保存的腎臟組織，加入裂解液，冰浴中勻漿，4 ℃條件下以12 000 r/min離心15 min，所得上清即為組織蛋白提取液。采用BCA法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得蛋白濃度。各組取配平后蛋白100 μg/10 μL于10%變性聚丙烯酰胺凝膠上，電泳后采用半干電轉(zhuǎn)移的方法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，置于封閉液(3% BSA)中室溫下封閉2 h。加入一抗(gp91phox稀釋倍數(shù)為1∶800，NT稀釋倍數(shù)為1∶200，內(nèi)參β-actin稀釋倍數(shù)為1∶1 000)，4 ℃過夜后常溫下復(fù)溫30 min，washing buffer洗滌5 min×3次；加入二抗室溫下孵育2 h，washing buffer洗滌5 min×3次。采用BCIP/NBT磷酸酶顯色試劑盒進(jìn)行顯色，掃描儀分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶灰度值的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三組腎組織病理情況比較 假手術(shù)組腎臟結(jié)構(gòu)正常；模型組術(shù)后第3、7天出現(xiàn)不同程度的腎小管上皮細(xì)胞腫脹，空泡變性，刷狀緣消失，腎間質(zhì)增寬，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)纖維化程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重。觀察組術(shù)后第3、7天均出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化，但其程度均輕于同時(shí)間點(diǎn)模型組。

2.2 三組腎組織PTCs密度比較 見表1。

表1 三組腎組織PTCs密度比較

注：與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

2.3 三組腎組織gp91-phox、NT蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 三組腎組織gp91-phox、NT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

3 討論

腎間質(zhì)纖維化與腎功能惡化密切相關(guān)，是各種慢性腎臟病長(zhǎng)期遷延、最終進(jìn)展到慢性腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腎臟微血管損傷對(duì)腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展具有不容忽視的作用[6]。在梗阻性腎病的發(fā)病過程中，腎臟組織血供減少，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧性壞死和細(xì)胞凋亡；同時(shí)PTCs血流量減少，氧分壓降低，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，使活性氧(ROS)生成增加。ROS除可引起大分子(主要為脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA)氧化損傷外，還可促使PTCs損傷，腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為纖維母細(xì)胞，使細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加，間質(zhì)纖維化程度加重，從而在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[7,8]。PTCs損傷、丟失又可進(jìn)一步導(dǎo)致局部組織缺血缺氧，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。由此可見，PTCs損傷、局部組織缺血缺氧在慢性腎臟病的進(jìn)展中形成惡性循環(huán)，最終加快腎臟纖維化的進(jìn)程[9,10]。

目前基因治療和干細(xì)胞治療的聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)成為再生醫(yī)學(xué)中的研究熱點(diǎn)。AFSCs因具有比其他干細(xì)胞更多的優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用于基因治療中，其優(yōu)勢(shì)包括來源容易、具有多向分化潛能、易被外源基因轉(zhuǎn)染、表達(dá)穩(wěn)定、低風(fēng)險(xiǎn)(抗免疫排斥和癌癥)、不受倫理限制等，被認(rèn)為是最具潛力的基因治療方法之一。AFSCs具有分化為內(nèi)、中、外3個(gè)胚層的潛能，并且表面能表達(dá)ESCs和ASCs表面標(biāo)記物Oct-4[11～13]。PTCs是對(duì)維持腎小管正常形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能以及腎小球?yàn)V過功能起關(guān)鍵作用的微血管網(wǎng)。PTCs損傷可導(dǎo)致腎間質(zhì)缺血、缺氧，進(jìn)而加重纖維化。CD34抗原主要表達(dá)在毛細(xì)血管、小血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)中，能夠反映PTCs密度，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的可靠標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，模型組和觀察組腎組織CD34光密度值均低于假手術(shù)組，并出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化，但模型組變化更明顯；表明AFSCs移植有助于增加單側(cè)UUO小鼠的腎臟微血管密度，修復(fù)受損腎臟微血管內(nèi)皮，進(jìn)而增加腎臟腎小管間質(zhì)微循環(huán)，改善組織缺血缺氧的狀態(tài)，從而減輕腎間質(zhì)纖維化。

綜上所述，AFSCs移植可減輕UUO小鼠腎臟微血管損傷；通過降低gp91-phox、NT表達(dá)而減輕氧化應(yīng)激可能是其作用機(jī)制。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81270769)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20161172)；江蘇省“十二五”醫(yī)學(xué)重點(diǎn)人才項(xiàng)目(RC2011116)；江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(2010-WS043)。

孫東(E-mail： sundong126@yahoo.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.008

R693.2

A

1002-266X(2017)44-0029-03

2016-09-14)