厄貝沙坦對(duì)帕金森病大鼠的保護(hù)作用

楊發(fā)滿 黃 新 敬澤慧 蔣德旗

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，青海 西寧 810000)

厄貝沙坦對(duì)帕金森病大鼠的保護(hù)作用

楊發(fā)滿 黃 新 敬澤慧 蔣德旗1

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，青海 西寧 810000)

目的探討厄貝沙坦對(duì)魚藤酮致帕金森病(PD)大鼠模型的保護(hù)作用。方法48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成對(duì)照組、PD模型組、PD+厄貝沙坦組、厄貝沙坦組，每組12只。2.5 mg·kg-1·d-1魚藤酮溶于二甲基亞砜和聚乙二醇(1∶1)混合液中，埋于PD模型組、PD+厄貝沙坦組微量滲透泵中，余2組給予等質(zhì)量的生理鹽水；PD+厄貝沙坦組、厄貝沙坦組同時(shí)給予1 mg·kg-1·d-1厄貝沙坦每天上午8時(shí)灌胃，其余2組給予等體積生理鹽水灌胃，試驗(yàn)周期為4 w。行為學(xué)檢測(cè)評(píng)定運(yùn)動(dòng)功能等損害癥狀；高效液相檢測(cè)黑質(zhì)區(qū)多巴胺含量；免疫組化染色檢測(cè)大鼠黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目；Western印跡檢測(cè)黑質(zhì)部位α-共核蛋白、caspase-3、核因子(NF)-κB蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組比較，PD模型組體質(zhì)量、多巴胺含量顯著下降，黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，α-共核蛋白、caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著上升(Plt;0.05)；但與PD模型組比較，PD+厄貝沙坦組經(jīng)厄貝沙坦干預(yù)后，體質(zhì)量、多巴胺含量顯著提高，TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增加，α-共核蛋白、caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(Plt;0.05)。結(jié)論厄貝沙坦可通過提高多巴胺含量、抑制黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞凋亡和下調(diào)α-共核蛋白、caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)而起到魚藤酮致PD模型大鼠的保護(hù)作用。

帕金森病;魚藤酮;厄貝沙坦;α-共核蛋白;多巴胺

帕金森病(PD)屬于慢性神經(jīng)退行性疾病，≥65歲人群發(fā)病率為1.5%〔1〕，神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)α-共核蛋白(synuclein)沉積組成的路易小體，黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性、脫水等為PD主要病理特征，α-synuclein異常沉積與認(rèn)知、行為失常有關(guān)，是PD早期病理關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，腦組織內(nèi)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)與PD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且血管緊張素(Ang)Ⅱ受體拮抗劑或管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)具有保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用〔2～4〕。本研究探討血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(AT)1受體厄貝沙坦片對(duì)魚藤酮致PD模型大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 健康成年清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體質(zhì)量250～270 g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。魚藤酮、二甲基亞砜、酪氨酸羥化酶(TH)抗體、α-synuclein抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；厄貝沙坦片，商品名：安博維，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：J20080060，法國(guó) Sanofi Pharma Bristol-Myers Squibb SNC產(chǎn)品，賽諾菲(杭州)制藥有限公司分裝；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3抗體、核因子(NF)-κB抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與PD模型制備 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成對(duì)照組、PD模型組、PD+厄貝沙坦組及厄貝沙坦組各12只。100 g/L水合氯醛麻醉充分后，2ML4微量滲透泵(美國(guó)Alzet公司)包埋于各組大鼠背部皮下。2.5 mg·kg-1·d-1魚藤酮溶于二甲基亞砜和聚乙二醇(1∶1)混合液中，埋于大鼠微量滲透泵中；其他3組給予等質(zhì)量的生理鹽水裝于微量滲透泵中：PD+厄貝沙坦組同時(shí)給予1 mg·kg-1·d-1厄貝沙坦(混于0.5%甲基纖維素)，每天上午8時(shí)灌胃，對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃。每周一上午10時(shí)測(cè)量血壓和體質(zhì)量，血壓測(cè)量采用無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x(BP-2000，美國(guó)Visitech公司)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施均經(jīng)過青海大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》有關(guān)規(guī)定。

1.3行為學(xué)評(píng)分 參照陳忻等〔5〕大鼠行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分為7個(gè)等級(jí)，0分：大鼠活動(dòng)正常，無(wú)異常反應(yīng)；1分：大鼠出現(xiàn)拒捕行為減弱、豎毛、毛色變黃、弓背、主動(dòng)活動(dòng)減少；2分：有1分的表現(xiàn)，且主動(dòng)活動(dòng)減少明顯、動(dòng)作遲緩或有步態(tài)不穩(wěn)；4分：有2分的表現(xiàn)，且步態(tài)不穩(wěn)，或不能直線行走或行走時(shí)向一側(cè)旋轉(zhuǎn)；6分：向單側(cè)斜臥，單側(cè)前肢和(或)后肢癱瘓、行走困難、近似困難；8分：?jiǎn)蝹?cè)，前肢和(或)后肢完全癱瘓，四肢拘攣，體質(zhì)量大幅度減輕，不能進(jìn)食；10分：瀕死狀態(tài)或死亡。大鼠分組后每周進(jìn)行一次評(píng)分，共持續(xù)4 w。

1.4高效液相色譜檢測(cè)黑質(zhì)區(qū)多巴胺含量 實(shí)驗(yàn)第4周末，麻醉后直接斷頭取腦，分離黑質(zhì)腦組織，吸干表面水分稱重，冰箱保存?zhèn)溆?。待測(cè)時(shí)加0.1 mol/L高氯酸去除蛋白，制成勻漿后4℃低溫10 000 r/min，離心30 min，取上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，即可用高效液相色譜儀(型號(hào)：LC1200，美國(guó)Agilent公司)檢測(cè)。流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉：0.02 mol/L檸檬酸鉀：甲醇=72∶23∶5，λ=280 nm。參照峰值面積計(jì)算其測(cè)定值，以計(jì)算值/腦組織濕重(μg/g)表示。

1.5免疫組化染色檢測(cè)TH陽(yáng)性細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)第4周末，麻醉后直接斷頭取腦，分離黑質(zhì)腦組織，多聚甲醛4℃固定24 h，包埋成蠟塊，進(jìn)行石蠟切片，每張厚5 μm，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，滴加正常非免疫動(dòng)物血清，室溫下5 min，滴加1∶300稀釋的兔抗TH多克隆抗體，置4℃冰箱過夜，PBS洗3次，免疫球蛋白(Ig)G-辣根過氧化物酶(HRP)(1∶500)二抗孵育，PBS洗3次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，脫水，脫敏，中性樹脂膠封片，400倍顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，取平均值。

1.6Western印跡檢測(cè)黑質(zhì)區(qū)α-synuclein、caspase-3、NF-κB蛋白的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)完成后取各組大鼠黑質(zhì)腦組織，加組織裂解液超聲破碎成漿液，4℃低溫10 000 r/min，離心20 min，取上清低溫保存，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離后，恒流轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉，三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液(TBST)洗膜，之后加入相應(yīng)的一抗(1∶1 000)、二抗(1∶5 000)進(jìn)行孵育并洗膜，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組行為學(xué)比較 對(duì)照組和厄貝沙坦組活動(dòng)正常，毛色光滑、無(wú)異常行為；PD模型組和PD+厄貝沙坦組給藥3 d后出現(xiàn)拘捕行為減弱，主動(dòng)活動(dòng)減少，毛色逐漸變黃，豎毛明顯；第4周時(shí)，PD模型組2只死亡，其余10只均出現(xiàn)不同程度的PD癥狀；PD+厄貝沙坦組死亡1只，其余11只出現(xiàn)PD癥狀，但行為學(xué)評(píng)分小于PD組。見表1。

2.2各組血壓、體質(zhì)量、黑質(zhì)多巴胺含量比較 PD模型組體質(zhì)量較對(duì)照組明顯減輕，PD+厄貝沙坦組減輕較PD模型組顯著少(Plt;0.05)。各組間血壓變化均無(wú)明顯差異(Pgt;0.05)。PD模型組黑質(zhì)區(qū)多巴胺含量較對(duì)照組明顯低，PD+厄貝沙坦組較PD模型組明顯提高(均Plt;0.05)。見表2。

2.3黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比較 PD模型組〔(21±3)個(gè)〕、PD+厄貝沙坦組TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目〔(56±6)個(gè)〕較對(duì)照組〔(103±11)個(gè)〕均明顯減少(Plt;0.05)，PD+厄貝沙坦組TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較PD模型組顯著增加(Plt;0.05)，厄貝沙坦組TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目〔(98±10)個(gè)〕較對(duì)照組變化不顯著(Pgt;0.05)。見圖1。

2.4Western印跡檢測(cè)各組黑質(zhì)區(qū)α-synuclein、caspase-3、NF-κB的蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，PD模型組α-synuclein、caspase-3、NF-κB 3種蛋白表達(dá)水平顯著提高(Plt;0.05)；PD+厄貝沙坦組干預(yù)后，α-synuclein、caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)均較PD模型組顯著下調(diào)(Plt;0.05)。見表3、圖2。

表1 各組4 w后行為學(xué)評(píng)分比較(n=12，n)

表2 厄貝沙坦對(duì)大鼠體質(zhì)量、血壓及黑質(zhì)區(qū)多巴胺含量的影響

與對(duì)照組比較:1)Plt;0.05，與PD模型組比較：2)Plt;0.05，下表同

圖1 各組黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性表達(dá)(DAB，×400)

組別nα-synucleincaspase-3NF-κB對(duì)照組121.0±0.21.0±0.11.0±0.2PD模型組102.1±0.51)3.1±0.71)2.2±0.41)PD+厄貝沙坦組111.6±0.32)1.2±0.22)1.1±0.32)厄貝沙坦組121.1±0.20.9±0.21.2±0.2

圖2 Western印跡檢測(cè)各組α-synuclein、caspase-3、NF-κB表達(dá)

3 討 論

RAS存在于大腦多個(gè)器官組織，在PD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用〔6〕。紋狀體中存在ATⅡ、ATⅡ受體及AT，ACEI或AT1受體拮抗劑在6-羥基多巴胺(OHDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)致PD動(dòng)物模型中保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元〔3,4〕。厄貝沙坦屬于AngⅡ受體抑制劑，能抑制AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ，能特異性地拮抗AT1受體，抑制血管收縮和醛固酮的釋放，產(chǎn)生降壓作用。研究表明，厄貝沙坦可降低酒精性腦損傷大鼠血清及腦組織神經(jīng)元特異性烯醇化酶水平，有望成為治療酒精性腦損傷患者的預(yù)防用藥〔7〕。厄貝沙坦可有效改善大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)大鼠腦損傷的作用〔8〕。阿司匹林聯(lián)合厄貝沙坦治療急性腦梗死的臨床療效確切，安全性較高，可有效改善血液流變學(xué)、減輕炎性反應(yīng)、提高神經(jīng)功能及生活質(zhì)量〔9〕。厄貝沙坦通過上調(diào)糖尿病大鼠腎組織基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、下調(diào)NF-κB及MMP抑制劑(TIMP)-1的表達(dá)，達(dá)到減緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展〔10,11〕。白藜蘆醇聯(lián)合厄貝沙坦抑制大鼠肺纖維化及肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、NF-κB表達(dá)，對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化具有明顯的改善作用〔12〕。厄貝沙坦抑制糖尿病腎病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的C/EBP同源蛋白-氨基末端激酶(CHOP-JNK)-caspase-12凋亡途徑、減少細(xì)胞凋亡、保護(hù)腎臟功能〔13〕。本研究結(jié)果顯示，厄貝沙坦也可通過下調(diào)NF-κB，caspase-3的表達(dá)，增加大腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺含量和TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目起到保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用。厄貝沙坦可能通過抑制心肌組織中TGF-β1表達(dá)，進(jìn)而減少骨膜蛋白(periostin)表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纖維化的作用〔14〕。厄貝沙坦拮抗高糖環(huán)境中胰島細(xì)胞凋亡，可能與抑制AT1R、AngⅡ mRNA表達(dá)，阻斷RAS通路及抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)〔15〕。厄貝沙坦可降低高血壓小鼠血管組織前纖維蛋白(Profilin)-1表達(dá)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3磷酸化水平，促使血管氧化應(yīng)激水平改善，降低血壓〔16〕。厄貝沙坦下調(diào)糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)，從而抑制糖尿病心肌纖維化，改善心功能〔17〕。

綜上所述，厄貝沙坦對(duì)魚藤酮所致PD模型大鼠具有保護(hù)作用：①改善魚藤酮所致的PD大鼠行為學(xué)變化；②增加大鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺含量及TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目；③抑制凋亡相關(guān)蛋白NF-κB，caspase-3的表達(dá)；④減少α-synuclein的表達(dá)與沉積。

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〔2016-06-04修回〕

(編輯 苑云杰/王一涵)

R742.5

A

1005-9202(2017)22-5533-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.020

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2016GXNSFBA380040)

1 玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院

蔣德旗(1986-)，男，講師，博士，主要從事神經(jīng)藥理研究。

楊發(fā)滿(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要從事老年血液病學(xué)研究。